第三章 核酸的分离与检测.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Chapter 3 Separate and investigate target gene,Wellcome to Genetic Engineering,By Nieguangjun,E-mail:n.g.jason,从哪儿提取（,Where,）？,怎么提取（,How,）？,提到什么程度（,What,）？,会出现什么问题（,Questions,）？如何解决（,Solution,）？,核酸提取的原则和基本要求,核酸提取的一般过程,关键试剂的作用,核酸的部分特征,核酸提取的常用方法,核酸提取经典案例,核酸提取的注意事项,核酸提取出现的问题及对策,核酸提取的相关说明,主要内容,核酸提取的原则和基本要求,Principle and steps,Principle,保持核酸的完整性；,提高核酸的质量（纯度和浓度）。,Requirements for purification,不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；,其他事物大分子（,Pr,、,sugar,and lipid,）,其他核酸污染,核酸提取的一般过程,Principle and steps,Steps,样品准备（取材）,破细胞（物理法、化学法、酶法）；,除杂质（蛋白质、脂类、糖类和不需要的核酸）；,沉淀提纯,I.,材料准备,II.,破碎细胞或包膜内容物释放,III.,核酸分离、纯化,IV.,沉淀或吸附核酸，并去除杂质,V.,核酸溶解在适量缓冲液或水中,破碎细胞,-,方法,机械方法,：超声波处理法、研磨法、匀浆法；,化学试剂法,：用,SDS,或,CTAB,处理细胞；,酶解法,：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。,破碎细胞,-,来源,动物：,小牛胸腺,动物肝脏、血液和肌肉组织等,鱼类精子；,植物：,种子的胚中都含有丰富的,DNA,。,微生物：,谷氨酸菌体含,7%10%,，面包酵母含,4%,，啤酒酵母含,6%,，大肠肝菌含,9%10%,（培养过夜）。,Note,：,从各种材料中提取,DNA,方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物。如从病毒中提取,DNA,比较容易，多数病毒,DNA,分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从高等动植物中提取,DNA,难度大一些。因分子量较大，易被机械张力剪断。,破碎细胞,（来源,-,方法）,微生物：,溶菌酶、,SDS,裂解。,高等植物：,捣碎器破碎、液氮研磨。,酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，,冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。,动物,：液氮处理后用匀浆器破碎。,细胞器,DNA,：,首先纯化细胞器。,以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂,抽提核酸除去杂质,1,首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离,2,使核酸与蛋白质分离,3,除去脂类,4,多糖的除去,How,to remove,？,核酸的纯化,根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂,(,盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。,How,to do,？,核酸样品的保存,核酸保存的主要条件是,温度,和,介质,温度：,4,（,5,）最佳和最简单,-70,是长期保存的良好温度，为一次性保存,-20,保存,保存介质：,TE,缓冲溶液,(,最常用,),10mmol/L Tris-HCl pH8.0,1mmol/L EDTA pH8.0,关键试剂的作用,关键试剂的作用,核酸酶的抑制和抑制剂,降低温度，改变,pH,及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。,对于,DNA,，抑制,DNase,活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。,对于,RNA,，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制,RNase,活力较难，故在,RNA,提取中设法抑制,RNase,更重要。,关键试剂的作用,核酸酶的抑制和抑制剂,RNase,抑制,操作要带手套。,所有器皿要严格消毒，,试剂处理,低温操作,在分离过程中要加入一定的,RNase,抑制剂。,关键试剂的作用,核酸制备中常用的去垢剂,核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：,1,溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；,2,溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；,3,对,RNase,、,DNase,有一定的抑制作用。,关键试剂的作用,核酸制备中常用的蛋白质变性剂,蛋白质变性剂的作用：,1.,使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。,2.,使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。,3.,某些蛋白质变性剂也有抑制,RNase,活性和破裂细胞的作用。,如：苯酚、氯仿、盐酸胍、,DEPC,关键试剂的作用,核酸制备中常用的酶,DNase,RNase,蛋白酶,K,溶菌酶,核酸的部分特征,核酸的部分特征,存在形式,pH,值影响,盐影响,温度影响,1.,存在形式,RNA,和核苷酸的纯品都呈,白色粉末或结晶,，,DNA,则为,白色类似石棉样,的纤维状物。,DNA,、,RNA,和核苷酸都是,极性化合物,，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，,RNA,钠盐在水中溶解度可达,40g/L,。,天然状态的,DNA,是以脱氧核糖核蛋白,(DNP),形式存在于细胞核中。要从细胞中提取,DNA,时，先把,DNP,抽提出来，再把,P,除去，再除去细胞中的糖，,RNA,及无机离子等，从中分离,DNA,。,removal of Pr,2.pH,值的影响,DNA,在水中为,10g/L,，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，,DNA,、,RNA,易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,在,pH,值高达,12.6,的碱性条件下，双螺旋结构解开而变性。质粒,DNA,两条互补链不会完全分离，当以,pH 4.8,的,NaAc,高盐缓冲液去调节其,pH,值至中性时，变性的质粒,DNA,完全复性，而染色体,DNA,不能复性而形成缠连的网状结构,碱变性法（,for plasmid DNA,）,3.,盐影响,DNP,在,低浓度盐溶液,中，几乎不溶解，如在,0.14 mol/L,的氯化钠溶解度最低,，仅为在水中溶解度的,1%,，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至,1mol/L,氯化钠中的溶解度很大，比纯水高,2,倍。,RNP,在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，,在,0.14mol/L,氯化钠中溶解度较大,。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。,浓盐法,4.,温度影响,高温变性,低温复性,沸水浴法（,for plasmid DNA,）,核酸的常用提取方法,常用的,DNA,提取方法,浓盐法,阴离子去污剂法,苯酚抽提法,水抽提法,沸水浴法,碱变性法,1.,浓盐法,原理：,利用,RNP,和,DNP,在电解溶液中溶解度不同，将二者分离；,常用的方法：,用,1M,氯化钠,提取氯化钠抽提,得到的,DNP,粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,，而,DNA,位于上层水相中,用,2,倍体积,95%,乙醇可将,DNA,钠盐沉淀出来（,也可用,0.15 MNaCL,液反复洗涤细胞破碎液除去,RNP,再以,1MNaCL,提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿,-,异醇法除去蛋白）。,1.,浓盐法,注意,以稀盐酸溶液提取,DNA,时,加入适量,去污剂,如,SDS,可有助于蛋白质与,DNA,的分离。,在提取过程中为抑制组织中的,DNase,对,DNA,的降解作用,在氯化钠溶液中加入,柠檬酸钠,作为金属离子的烙合剂,.,通常用,0.15MNaCL,0.015M,柠檬钠,并称,SSC,溶液,提取,DNA.,2.,阴离子去污剂法,用,SDS,或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取,DNA,。,由于细胞中,DNA,与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取,DNA.,3.,苯酚抽提法,苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了,DNase,的降解作用。,用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与,DNA,联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶,。,蛋白分子溶于酚相，而,DNA,溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含,DNA,的水相。,利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀,DNA,。此时,DNA,是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的,DNA,保持天然状态。,4.,水抽提法,利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去,RNA,，然后将沉淀溶于水中，使,DNA,充分溶解于水中,离心后收集上清液；,在上清中加入,固体氯化钠,调节至,2.6M,。加入,2,倍体积,95%,乙醇,立即用搅拌法搅出；,然后分别用,66%,80%,和,95%,乙醇以及丙酮洗涤；,最后在空气中干燥,既得,DNA,样品。,此法提取的,DNA,中蛋白质含量较高,故一般不用。,5.,沸水浴法（提取大肠杆菌质粒,DNA,）,1.,在,Eppendorf,管中加入,110 ml,的,STET,（使用前加入溶菌酶至终浓度为,5 mg/ml,）（蔗糖,8,，,Triton X-100,5,，,Tris-HCl(pH8.0),50 mM,，,EDTA(pH8.0),50 mM,）溶液，挑入米粒大小的菌团，充分悬浮并混匀。,2.,上述菌体悬浮液,沸水煮,30,秒,。,3.,迅速放置于,常温,下,15000 rpm,离心,15,分钟。,5.,沸水浴法（提取大肠杆菌质粒,DNA,）,4.,用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入,100 ml,的,异丙醇,，充分混匀后,4,，,15000 rpm,离心,20,分钟。,5.,弃上清液，加入,70%,冰乙醇,400 ml,，,4,，,15000 rpm,离心,5,分钟。,6.,沉淀凉干后用,50 ml,无菌重蒸水溶解。,7.,取,5 ml,电泳检测。,6.,碱变性法,原理：,碱变性抽提质粒,DNA,是基于染色体,DNA,与质粒,DNA,的变性与复性的差异而达到分离目的。,在,高,pH,值,条件下，染色体,DNA,的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒,DNA,的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离；,当,pH,值调至至中性,时，变性的质粒,DNA,又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体,DNA,不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体,DNA,与不稳定的大分子,RNA,、蛋白质,SDS,复合物等一起沉淀下来而被除去。,核酸提取的经典案例,主要案例,碱变性法制备大肠杆菌质粒,DNA,大肠杆菌染色体,DNA,的抽提,CTAB,法提取植物基因组,DNA,6.,碱变性法（制备大肠杆菌质粒,DNA,）,1.1.5 ml,培养物,6000 rpm,，,4,离心,10,分钟，弃去上清液。,2.,加入,100 ml,溶液,I,悬浮菌体，室温放置,5,分钟。,3.,加入,200 ml,溶液,II,，立即轻轻混匀，室温放置至溶液几乎澄清。,4.,加入,150 ml,溶液,III,，轻轻混匀，冰浴,30,分钟。,5.4,，,15000 rpm,离心,20,分钟，收集上清液。,6.,上清液中加入等体积的,苯酚,饱和溶液（,400 ml,）,氯仿,，充分混匀，,4,，,15000 rpm,离心,20,分钟，将上清液转移至另一离心管。,6.,碱变性法（制备大肠杆菌质粒,DNA,）,7.,在上清液中加入,400 ml,氯仿,溶液，混匀，,10000 rpm,离心,10,分钟，将上清液转移至另一离心管。,8.,在上清液中加入,400 ml,异丙醇,，,20,放置,30,分钟，,4,，,15000 rpm,离心,20,分钟。,9.,用,400 ml 75%,的,冰乙醇,洗涤一次，凉干。,10.,加入,50 ml,无菌重蒸水溶解质粒,DNA,。,11.,取,2 ml,作酶切电泳检查。,6.,碱变性法,-,试剂,溶液,I,：,D-Glucose,50 mmol/L,，,Tris-Hcl,（,pH 8.0,）,50mmol/L,，,EDTA,（,pH 8.0,）,10mmol/L,121,消毒,20,分钟，使用时加入溶菌酶，终浓为,5mg/ml,溶液,II,：,SDS,1%,NaOH,0.2 mol/L,溶液,III,：,KAc,（,pH5.5,）,3 mol/L,溶液,-,溶菌液,1,溶菌酶：,它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的,-1,，,4,糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中,pH,小于,8,时，溶菌酶作用受到抑制。（保持碱性和较低的离子强度环境）,葡萄糖：,增加溶液的粘度，维持渗透压，防止,DNA,受机械切力作用降解。,溶液,-,溶菌液,2.EDTA,的作用,：（,1,）螯合,Mg,2,、,Ca,2,等金属离子，抑制脱氧核酸酶对,DNA,的降解作用（,DNase,作用时一定的金属离子作辅基）。（,2,）,EDTA,的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。,溶液,-,NaOH-SDS,液,NaOH,：,核酸在,pH,大于,5,，小于,9,的溶液中，是稳定的,。但当,pH12,或,pH3,时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液,中的,NaOH,浓度为,0.2mol/L,加抽提液时，该系统的,pH,就高达,12.6,因而促使染色体,DNA,与质粒,DNA,的变性,.,溶液,-NaOH-SDS,液,SDS,：,SDS,是离子型表面活性剂。它主要功能有：,（,1,）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。,（,2,）解聚细胞中的核蛋白。,（,3,）,SDS,能与蛋白质结合成为,R-O-SO3,R+-,蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是,SDS,能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用,RNase,去除,RNA,时）受到干扰。,溶液,-3MOL/LNaAc(pH4.8),溶液,NaAc,的水溶液呈碱性，为了调节,pH,至,4.8,必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是,NaAc-HAc,的缓冲液。用,pH4.8,的,NaAc,溶液,是,为了将,pH12.6,的抽提液调回,pH,至中性,使变性的质粒,DNA,能够复性,并能稳定存在。而高盐的,3Mol/LNaAc,有利于变性的大分子染色体,DNA,RNA,以及,SDS-,蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与,SDS-,蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。,大肠杆菌染色体,DNA,的抽提,大肠杆菌传一代后,30ml,液体,LB,培养基以,10%,接种量,培养,6,小时,，,6000rpm,，,4,，离心,10,分钟收获菌体沉淀。,沉淀中加入,3.6 ml,Buffer A,（含溶菌酶,5 mg/ml,），旋涡振荡混匀，,37,保温,30,分钟。,加入,400 ml 10%,SDS,使最终浓度为,1%,，混匀，,37,保温,30,分钟或澄清即可。,加入,10 ml 20 mg/ml,的,ProK,至最终浓度为,1 mg/ml,，,60,保温,60,分钟。,加入,1 ml,预先冷冻的,5 mol/L NaCl,至最终浓度为,1 mol/L,，充分混匀后冰浴,30,分钟。,4,，,15 000 rpm,，离心,30min,。,大肠杆菌染色体,DNA,的抽提,取上清加入等体积（,5 ml,）的,苯酚,饱和溶液，充分混匀后,4,，,15000 rpm,，离心,30,分钟。,取上清加入等体积的,氯仿,充分混匀后,13000 rpm,，,4,，离心,10,分钟。,取上清加入,0.8 V,（,4 ml,）,异丙醇,充分混匀后,-20,放置,30,分钟以上，,4,，,15000 rpm,，离心,30,分钟。,弃上清，沉淀用,3ml 70%,的,冰乙醇,洗涤，,4,，,15000 rpm,，离心,5,分钟。,弃上清，沉淀于,37,凉干后，用,1 ml ddH2O,溶解并移入,Eppendorf,管中。,取,5 ml,电泳。,CTAB,法提取植物基因组,DNA,CTAB,(,十六烷基三乙基溴化铵,),是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（,0.7 mol/L NaCl,）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（,0.3 mol/L NaCl,）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将,CTAB-,核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。,最后通过乙醇或异丙醇沉淀,DNA,，而,CTAB,溶于乙醇或异丙醇而除去。,实验程序,1.,在,2mL,离心管中，加入,500l,的,2,CTAB,和,20 l-,巯基乙醇,65,预热。,2,嫩的组织材料,1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌,ddH2O,冲洗,2,次，放入经液氮预冷的研钵中，加入,液氮研磨,至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到,1mL,混匀后置,65,水浴中保温,45-60min,，并不时轻轻转动试管。,注：,冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性,Dnase,有可能降解,基因组,DNA,。,实验程序,3,加等体积的,氯仿,/,异戊醇,，轻轻地颠倒混匀，室温下,10 000rpm,离心,10 min,，移上清至另一新管中。,4,向管中加入,1/100,体积的,RNase A,溶液，置,3720-30min,。,5,加入,2,倍体积的,100%,乙醇,或,0.7,倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，,-20,放置,30 min,或,-80,放置,10min,，,12 000rpm,离心,10-15min,回收,DNA,沉淀。,6,用,70%,乙醇,清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌,ddH2O,中。,7 0.8%,琼脂糖凝胶电泳检测,基因组,DNA,的完整性。,核酸提取的注意事项,注意事项,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融,提取血液基因组,DNA,时，要选择有核细胞（白细胞）,组培细胞培养时间不能过长，否则会造成,DNA,降解,含病毒的液体材料,DNA,含量较少，提取前先富集,注意事项（细胞破碎）,材料应适量,，过多会影响裂解，导致,DNA,量少，纯度低,针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式,：,植物材料液氮研磨,动物组织匀浆或液氮研磨,组培细胞蛋白酶,K,细菌溶菌酶破壁,酵母破壁酶或玻璃珠,高温温浴时，定时轻柔振荡,注意事项（分离与纯化）,采用吸附材料吸附的方式分离,DNA,时，应提供相应的缓冲体系,采用有机（酚,/,氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔,离心分离两相时，应保证一定的转速和时间,针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,注意事项（沉淀、溶解）,当沉淀时间有限时，用,预冷的,乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分,沉淀时加入,1/10,体积的,NaAc,（,pH5.2,，,3M,），有利于充分沉淀,沉淀后应用,70,的乙醇洗涤，以除去盐离子等,晾干,DNA,，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）,若长期储存建议使用,TE,缓冲液溶解,TE,中的,EDTA,能螯和,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,pH,值为,8.0,，可防止,DNA,发生酸解,核酸提取的常见问题与对策,常见问题与对策,DNA,中含有蛋白、多糖、多酚类杂质,DNA,在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应,DNA,中残留有金属离子,重新纯化,DNA,，去除蛋白、多糖、多酚等杂质,重新沉淀,DNA,，让酒精充分挥发,增加,70,乙醇洗涤的次数（,2-3,次）,问题一：,DNA,样品不纯，抑制后续酶解和,PCR,反应。,原因,对,策,问题与对策,材料不新鲜或反复冻融,未很好抑制内源核酸酶的活性,提取过程操作过于剧烈，,DNA,被机械打断,外源核酸酶污染,反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融,液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液,在提取内源核酸酶含量丰富的材料的,DNA,时，可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔,所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌,将,DNA,分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,问题二：,DNA,降解,对,策,原因,问题与对策,实验材料不佳或量少,破壁或裂解不充分,沉淀不完全,洗涤时,DNA,丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料,动植物要匀浆研磨充分；,G,菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁,高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加,PK,的用量）,低温沉淀，延长沉淀时间,加辅助物，促进沉淀,洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,问题三：,DNA,提取量少,对,策,原因,核酸提取的相关说明,为什么用无水乙醇沉淀,DNA?,在用无水乙醇沉淀,DNA,时，为什么加,NaAC,或,NaCL?,加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再用,SDS,与,KAc,来处理,?,为什么在保存或抽提,DNA,过程中，一般采用,TE,缓冲液？,如何选择聚乙二醇,(6000),的浓度来沉淀,DNA?,抽提,DNA,去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好,?,为什么用酚与氯仿抽提,DNA,时,还要加少量的异戌醇,?,为什么要用,pH8,的,Tris,水溶液饱和酚,?,呈粉红色的酚可否使用,?,如何保存酚不被空气氧化,?,为什么用无水乙醇沉淀,DNA?,乙醇的优点,：可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对,DNA,很安全,因此是理想的沉淀剂。,原理：,DNA,溶液是,DNA,以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺,DNA,周围的水分子,使,DNA,失水而易于聚合。,在用无水乙醇沉淀,DNA,时，为什么要加,NaAC,或,NaCL,在,pH,为,8,左右的,DNA,溶液中,DNA,分子是带负电荷的,加一定浓度的,NaAC,或,NaCL,使,Na,+,中和,DNA,分子上的负电荷,减少,DNA,分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成,DNA,钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分,DNA,形成,DNA,钠盐而聚合,这样就造成,DNA,沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好,.,在沉淀的,DNA,中,由于过多的盐杂质存在,影响,DNA,的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀,.,加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用,SDS,与,KAc,来处理,?,加进去的,Rnase,本身是一种蛋白质,为了纯化,DNA,又必须去除之,加,SDS,可使它们成为,SDS-,蛋白复合物沉淀,再加,KAc,使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的,SDS-,蛋白质复合物,使沉淀更加完全。也可用饱和酚，氯仿抽提再沉淀，去除,Rnase,。在溶液中，有人以,KAc,代替,NaAc,，也可以收到较好的效果。,为什么在保存或抽提,DNA,过程中，一般采用,TE,缓冲液？,在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑,DNA,的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用,。,在,DNA,反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用,Tris-HCL(pKa=8.0),的缓冲系统,由于缓冲液是,TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存,DNA,时,大都采用,Tris-HCL,系统,而,TE,缓冲液中的,EDTA,更能稳定,DNA,的活性,.,如何选择聚乙二醇,(6000),的浓度来沉淀,DNA?,采用,PEG(6000),沉淀,DNA,，大小不同的,DNA,分子所用的,PEG,的浓度也不同,PEG,的浓度低,选择性沉淀,DNA,分子量大,大分子所需,PEG,的浓度只需,1%,左右,小分子所需,PEG,浓度高达,20%.,选择性沉淀,4.3Kb,的,pBR322,质粒,DNA,每毫升加入,0.4,毫升的,30%PEG,其最终,PEG,浓度为,12%.PEG,选择性沉淀,DNA,的分辩率大约,100bp.,抽提,DNA,去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好,?,苯酚：,使蛋白质变性，同时抑制了,DNase,的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与,DNA,联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而,DNA,溶于水相。,氯仿：,克服酚的缺点；加速有机相与水相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的痕量酚。（酚易溶于氯仿中）,经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的,DNA,分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层,。,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约,10%-15%,的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的,DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走,DNA,。所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合,(1:1),使用。,（利用氯仿除酚）,为什么用酚与氯仿抽提,DNA,时,还要加少量的异戌醇,?,在抽提,DNA,时,为了混合均匀,必须剧烈振荡数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。,加入异戌醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生,。,一般采用氯仿与异戌醇为,24:1,之比。也可以采用酚,氯仿与异戌醇之比为,25:24:1(,不必先配制,可在临用前把一份酚加入一份,24:1,的氯仿互异戌醇即成,),，同时异戌醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。,为什么要用,pH8,的,Tris,水溶液饱和酚,?,呈粉红色的酚可否使用,?,如何保存酚不被空气氧化,?,因为酚与水有一定的互溶。苯酚用水饱和的目的是使其抽提,DNA,过程中,不致吸收样品中含有,DNA,的水分,减少,DNA,的损失。,用,Tris,调节至,pH,为,8,是因为,DNA,在此条件下比较稳定,.,在中性或碱性条件下,(pH5-7),RNA,比,DNA,更容易游离到水相,所以可获得,RNA,含量较少的,DNA,样品。,保存在冰箱中的酚,容易被空气氧化而变成粉红色的,这样的酚容易降解,DNA,一般不可以使用。,1,.,传统的分离方法是用,oligo(dT)-,纤维素柱分离,mRNA,2,.,把,oligo(dT)-,磁珠同总,RNA,混合，在强磁场下分离,mRNA,3.,用蔗糖梯度离心,mRNA,核糖体复合体（溶解细胞）来分离,mRNA,三,种分离,mRNA,的方法,用纤维素纯化,poly(A)mRNA,的流程图,Chapter 3-2 How to assay NA,Wellcome to Genetic Engineering,By Nieguangjun,E-mail:n.g.jason,Methods,分光光度法,二苯胺法,定磷法,电泳检测法,分光光度法,原理：,构成核酸的嘌呤和嘧啶环的共轭双键系统使核酸在,260nm,波长处有最大吸收峰，其光密度值与单位体积核酸含量成正比。,方法：,核酸种类及其存在状态不同，其光密度值与核酸含量的比值有异，,浓度计算,：,1 OD 260,相当于,dsDNA 50g/mL,，,ssDNA33g/mL,和,ssRNA 40g/mL,。,纯度计算,：从,OD260,：,OD280,的值可定性,DNA,并了解核酸的纯度，纯的,DNA(RNA),制品的比值为,1.8(2),。,二苯胺法测定,DNA,含量,DNA,分子中,2-,脱氧核糖残基,在酸性溶液中加热降解，产生,2-,脱氧核糖并形成,-,羟基,-,酮基戊酸，后者与二苯胺试剂反应产生,蓝色化合物,，其反应如下图。,蓝色化合物在,595nm,处有最大吸收，且,DNA,在,40,g-400,g,范围内时，吸光度与,DNA,浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。,定磷法测定,DNA,核酸经浓硫酸或高氯酸高温水解后，释放出无机磷。在酸性条件下，,磷酸,与钼酸铵结合，生成磷钼酸铵黄色沉淀,：,PO,4,3-,+3NH,4,+,+12MoO,4,+24H,+,=,（,NH,4,）,3,PO,4,12MoO,3,6H,2,O,+6H,2,O,在过量（,NH,4,）,2,12MoO,4,存在时，黄色沉淀溶解于过量的磷钼酸盐溶液中。当有还原剂存在时，,Mo,6+,被还原成,Mo,4+,，此,4,价钼再与试剂中其他的,MoO,4,2-,结合成,Mo,（,MoO,4,）,2,或,Mo,3,O,8,，呈蓝色。该产物在,660nm,处有最大的光密度峰，其峰值与光密度成正比。求得单位体积的含磷量除以,9.0%,既可得单位体积,RNA,的量，或除以,9.2%,则为,DNA,的含量（测,DNA,时）。核酸制品中微量的无机磷，非核酸的有机磷、硅酸盐、铁离子以及酸度过高或偏低都会影响定磷法的测定结果；但其灵敏度高，最低可测到核酸,10g/ml,的水平，准确性较好。,定磷法测定,DNA,电泳检测法,原理：,琼脂糖是一种直链多糖。它是由,B,D,吡喃半乳糖和,3,，,6,脱水半乳糖以,1,，,3,糖苷键相连的双糖聚合物，链状琼脂糖分子之间相互以氢键交联。形成网络系统。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，也不会引起核酸分子的变性，而且不吸附被分离的物质，因此成为基因工程上首选的凝胶剂。当核酸分子在琼脂糖凝胶电场中时，分子上带电基团在,pH8.0,条件下带负电荷，在电场作用中移向正数，至使核酸分子在琼脂糖凝胶电泳中有其迁移率。,迁移率与下列因素有关：,电泳检测法,电泳检测法,1.,核酸分子的大小,：在相同的条件下，不同大小的核酸分子的迁移率不同，小分子的迁移率大，大分子的迁移率小。其中线状双链,DNA,分子在一定浓度琼脂糖上电泳的速度与线状双链,DNA,分子的分子量对数成反比（图,3,1,）；所以根据迁移率大小可测定,DNA,分子的大小。不过实际应用时，通常将待测定的,DNA,和已知分子量大小的标准,DNA,片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可知该样品的分子量大小。,2,、迁移率与核酸构象有关,琼脂糖凝胶电泳可以鉴别分子量相同但构型不同的,DNA,分子。在依常规方法抽提的质粒,DNA,通常具有三种不同的构象,:,超螺旋型（,SC,）、线形（,L,）和开环型（,OC,）。这三种构型分子有不同的迁移率。在一般情况下,超螺旋型（,SC,）迁移速度最快，其次为线状（,L,）分子,最慢的为开环型（,OC,）分子。若提取到的质粒,DNA,样品中,还有染色体,DNA,或,RNA,在琼脂糖凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带,由此可分析样品的纯度,(,图,3,2),。,凝胶电泳，,DNA,移动距离和分子量关系（缓冲液,0.5TBE,0.5ug/ml,溴化乙锭电泳条件,1v/cm 16,小时）,提纯和未提纯质粒,DNA,电泳图,迁移率与电泳条件的关系,低电压时,，线状,DNA,片段的迁移速度与电压成正比，当,电压高,时，大分子量,DNA,片段的迁移速度就不再与电压成正比，所以,电压一般不超过每厘米,5,伏,。电泳液采用缓冲液，以保证较稳定的,pH,值。,pH,值的剧烈变化会影响,DNA,分子所带的电荷，因而影响正常的电泳速度。电泳温度一般不影响电泳，但若因,电压过高,，引起发热将会导致胶融解。所以可采用冷却循环系统。,迁移率与琼脂糖浓度的关系,浓度越大，迁移率越低,，当样品的,分子量较大,时，宜用较稀的琼脂糖浓度，,分子量小,时，浓度可选用大些，通常可选用,0.7%,浓度的凝胶。此浓度下分离,DNA,分子的范围为,0.8,10 Kb,。当核酸样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入在紫外线照射下能发射荧光的溴化乙锭（,EB,），,EB,就插入,DNA,分子中，形成荧光络合物，使其发射荧光增强几十倍，这样极其微量的,DNA,也可观察到。例如用肉眼观察，可检测到,0.05ug,0.1ug,的,DNA,。,迁移率与琼脂糖浓度的关系,材料,1,、,DNA,样品样品,A,：,DNA,（限制性核酸内切酶,EcoRI,，,HindIII,酶切后样品）样品,B,：染色体,DNA+RNA,样品,C,：质粒,DNA,（三种构型,DNA,）,2,、电泳缓冲液：,Tris,乙酸,0.04mol/L PH8.00.002mol/L EDTA,3,、加样缓冲液：,0.25%,溴酚兰,40%w/v,蔗糖,4,、溴化乙锭溶液：,0.05mg/ml,溴化乙锭,/,水,5,、琼脂糖,6,、水平式微型电泳槽；电泳仪；微量取样器，玻片等。,缓冲溶液配制表,缓冲溶液,工作溶液,储存溶液（每升）,TBE,0.5x,5x,0.045mol/L Tris-,硼酸,54 g Tris,碱,0.001mol/L EDTA,27.5g,硼酸,20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0),6x,样品缓冲液,0.2%,溴酚蓝,储存温度,4,50%(w/v),蔗糖水液,实验步骤,1,、用胶纸带把,电泳槽,两端封好，以免凝胶溶液漏出，将电泳槽置于平面水平。,2,、选择孔径适宜的,点样板（梳板,）。将梳板置于距凝胶槽一端一厘米并与该端平行的位置。梳板垂直架在槽上，使梳板底部不要触到槽底部，大约相距,1,毫米左右。,3,、称取,琼脂糖,0.3,克置三角瓶中，加入,40,毫升电泳缓冲液，于电炉上加热，至琼脂糖完全,融化,，取少量凝胶溶液沿胶带纸边缘封好，防止倒凝胶板时出现渗漏。,4,、在凝胶溶液中加入,0.4,毫升,溴化乙锭,溶液（,EB,最终浓度为,0.5ug/ml,）摇匀，待凝胶溶液冷却至,55,（手摸烧瓶不烫手）轻轻地倒入水平微型电泳槽内。除掉气泡，或用梳板将气泡排至凝胶边缘。,5,、室温下，凝胶放置,30,分钟，待其凝固后，拔去梳板，保持电样孔完好。除掉防渗漏的胶带纸。把制备好的装凝胶块的微型电泳槽，放入水平大电泳槽，点样孔一端应在大电泳槽电极负极一端。然后在水平大电泳槽内加入电泳缓冲液，使其液面高于凝胶,1,毫米左右。,实验步骤,6,、,按以下混合好样品（以下为参考值，可视实际样品作调节）。,2,微升样品,A,，,2,微升加样缓冲液，,10,微升电泳缓冲液。,2,微升样品,B,，,2,微升加样缓冲液，,10,微升电泳缓冲液。,2,微升样品,C,，,2,微升加样缓冲液，,10,微升电泳缓冲液。,7,、在玻片上各把上述样品混合均匀，用微量取液器分别吸取样品，小心将样品注入点样孔内，记录样品的点样顺序。,8,、点样孔那端的电泳槽负极连接电泳仪负极，另一端连接电泳仪正极，打开电泳仪电源开关（每次打开电源开关时，应检查电压旋扭是否置于零位），调电压至,5v/cm,（以水平大电泳槽的两极算距离）。,9,、待溴酚兰带走入凝胶,6,厘米后，小心取出微型电泳槽，勿使凝胶滑出，置于保鲜纸上，放在紫外检测仪上，打开紫外灯，观察电泳结果，绘好,DNA,区带电泳图。,【,注意事项,】,1.,溴化乙,啶是一种强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴手套。,2.,紫外线对人体，尤其是眼睛有危害性。为减少紫外线照射，必须确保紫外线光源受到遮蔽。,基因工程：第,三,章,Questions,核酸提取的原则和要求？,核酸提取的一般步骤？,核酸提取的常用方法有哪些？,核酸提取过程中,SDS,、,CTAB,、,EDTA,有何作用？,核酸提取过程中乙醇（无水和,70%,）有何作用？,如何除蛋白？,如何破细胞？在破细胞时需要注意哪些事项？,如何防止内源性核酸酶对核酸的损失？,检测核酸浓度和纯度的方法有哪些？基本原理？,基因工程：第,三,章,GAME IS OVER.,