HPLC色谱柱选择与维护保养_Agilent.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Agilent Technologies,*,页,HPLC,色谱柱选择与维护保养,Sa,安捷伦科技,安捷伦,HPLC,色谱柱选择,分离模式的选择,样品,溶于有机溶剂,溶于水,溶于四氢呋喃,非离子化,离子化,溶于有机溶剂,溶于水,溶于正己烷,溶于甲醇或甲醇/水,或乙腈或乙腈/水,用硅胶的正相模式,用键合相的正相模式,用键合相的反相模式,用键合相的反相模式,低分子凝胶渗透色谱,用键合相的反相模式,抑制电离反相键合相色谱,离子对键合相的反相模式,用硅胶的正相模式,离子交换模式,凝胶渗透色谱,凝胶过滤色谱,大孔填料的离子交换模式,用大孔填料的反相模式,分子量2,000,分子量2,000,反相分配色谱,极性:固定相 流动相,固定相-,极性,流动相(,己烷,庚烷,)-,非极性,极性,物质后出峰,正相色谱 20%,反相色谱,80%,正相&反相色谱,硅胶基质-,pH 38,Al,2,O,3,.,nH,2,O-,pH114,聚合物基质-,pH114,高或低,pH,下,硅胶会溶解,化学修饰困难,孔结构复杂,孔径不均匀导致柱效不够高,有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损,柱填料基质,C-18,柱-性能影响因素,键合类型,碳覆盖率,封端,化学性质,物理性质,硅胶纯度,色谱柱尺寸,颗粒形状,粒径,表面积,孔径,硅胶纯度,填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度,色谱柱尺寸,填料床的长度和内径,颗粒形状,球型或不规则型,粒径,平均颗粒直径,通常3-10,m,表面积,颗粒外表面和内部孔表面的总和,以,m,2,/gram,表示,孔径,颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300,色谱柱物理性质,C-18,柱-性能影响因素,键合类型,单体键合-键合相分子与基体单点相连,聚合体键合-键合相分子与基体多点相连,碳覆盖率,与基体物质相连的键合相的量,封端,键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来,色谱柱化学性质,C-18,柱-性能影响因素,A,类硅胶,Original ZORBAX SIL(1970s),由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的,pKa,低),导致碱性化合物发生拖尾,B,类硅胶(高纯),ZORBAX Rx-,Sil,(1987),由于金属含量低,硅羟基,pKa,高,碱性化合物不发生拖尾,Zorbax Rx-SIL:11,种金属 35,ppm,(,未检出其他杂质,4,000,选择 300,的孔径,大孔径填料适用于大分子分析,大孔径300,全多孔色谱柱,可用于分离蛋白质和多肽,分子量虽小但,hydrodynamic volume(,水动力学体积)较大的分子,Poroshell,色谱柱,高流速下,高柱效分析大分子的蛋白质和多肽,色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔,与孔内表面的键合相进行分离分配,300,孔径可改善蛋白质和多肽峰形,0.20,0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,300,SB-C18(300),SB-C18(80),PW 1/2,Leu Enkephalin,M.W.=556,Angiotensin,II(,血管紧张素,II),M.W.=1046,Insulin B,M.W.=3,496,Cyt,C,M.W.=12,327,Rnase,(,核糖核酸酶),M.W.=13,684,Lysozyme,(,溶菌酶),M.W.=13,900,孔径,分子量对峰宽的影响(梯度分离),选择合适的,填料孔径分析,大分子可获得,最佳峰形,300,孔径可改善大分子的峰形,色谱柱:4.6,x 150 mm,5 mm,流动相:60%,MeOH,:40%0.1%,三氟乙酸,流速:0.75,mL,/min,温度:,RT,检测器:,UV 282 nm,溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径,窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍,SB-C3 (80),300,SB-C3,(300),Pw,1/2,=0.442,Pw,1/2,=0.125,O,O,N,HO,HO,CHO,HO,O,H,O,H,O,O,O,O,O,O,O,CH,3,CH,3,OCH,3,OCH,3,CH,3,CH,2,CH,2,CH,2,CH,3,CH,3,CH,3,H,3,C,H,3,C,H,3,C,0 5 10,Time(min),0 5 10,Time(min),Tylosin,(,泰乐菌素),MW.926,分子量虽小但,hydrodynamic volume,(,水动力学体积)较大的分子,键合类型 -对色谱分离的影响,单齿键合：,提高传质速率,加快色谱柱平衡,双齿键合：,增加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样量,C-18,柱-性能影响因素,CH,CH,CH,CH,CH,CH,O,Si,O,O,O,O,Si,Si,Si,CH,CH,CH,CH,CH,CH,Si,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,Si,Si,O,O,Si,Si,O,O,碳覆盖率-对色谱分离的影响,高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长,低碳覆盖率：缩短运行时间,封端 -对色谱分离的影响,封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象,对于极性样品,未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异,C-18,柱-性能影响因素,固定相键合,二甲基硅烷,封端,四甲基硅烷,Si,O,OH,O,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,R=C8,C18,etc,.,O,OH,OH,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,+,+,Cl,CH,3,Si,CH,3,CH,3,OH,OH,OH,OH,CH,3,Cl,R,CH,3,(,TMS),传统键合及封端技术,取代基：五个,旁侧基团:异丙基,Zorbax StableBond,空间位阻保护-抗水解能力,键合相,流失,保留减弱,另一个裸露的硅羟基,潜在的拖尾因素,普通硅胶柱低,pH 2,不稳定,发生水解,安捷伦专利的空间位阻保护,液相柱-保留值与,pH,的关系,pH,变化值,0.1,R,S,变化值1.6,色谱柱：,Zorbax StableBond C18,4.6 X 250mm,5um,部件号：880975-906,流动相：27%甲醇：73%磷酸,pH 2.5&2.6,温度：50,0,C,流速：1.0,mL,/min.,1,2,3,4,6,7,5,0,1,2,3,4,5,6,Time(min),0,1,2,3,4,5,6,1,2,3,4,6,7,5,Time(min),pH 7.00,pH 7.25,色谱柱:,ZORBAX Eclipse XDB-C8,4.6 x 75 mm,3.5 m,流动相:44%25,mM,磷酸,pH 7.00:56%,甲醇,流速:1.0,mL,/min,温度:25,C,检测:,UV 250 nm,可电离的组份的分离可能会随,pH,变化发生显著变化,甚至很小的 0.050.25 个,pH,变化单位.,样品:,ketoprofen,ethyl,paraben,Hydrocortisone,fenoprofen,propyl paraben,Propranolol,ibuprofen,液相柱-保留值与,pH,的关系,0.25 个,pH,液相柱-保留值与,pH,的关系,pH,变化：,0.2个,pH,(7.07.2),保留时间改变：,1.2分钟(13.614.8分钟),保留时间随,pH,改变不明显,保留时间随,pH,改变,不明显(酸性环境中),保留时间,酸性组份,中性组份,碱性组份,方法稳定区,方法波动区(,pKa,+,1.5),方法稳定区,液相柱-保留值与,pH,的关系,液相柱-保留值与,pH,的关系,StableBond C18,pH 18,Bonus-RP,pH 29,Extend C18,pH 211.5,Eclipse XDB C18,pH 29,复杂组分的流动相,pH,选择技巧,色谱柱:,ZORBAX Extend-C18,4.6 x 150 mm,5 mm,流动相:30%缓冲液:70%,MeOH,pH 7,缓冲液20,mM,Na,2,HPO,4,pH 11,缓冲液 20,mM,TEA,流速:1.0,mL,/min,温度:,RT,检测器:,UV 254 nm,0 5,1,2,3,4,5,Time(min),7,6,Extend-C18,pH 7,1.,Maleate,马来酸盐,2.,Scopolamine,东莨菪碱,pKa,7.6,3.,PseudoEphedrine,假麻黄碱,pKa,9.8,4.,Doxylamine,抗敏安(多西拉敏),pKa,9.2,5.,Chlorpheniramine,氯苯吡胺,pKa,9.1,6.,Triprol,内径,ine,苯丙烯啶,pKa,6.5,7.,Diphenhydramine,苯海拉明,pKa,9.0,Extend-C18,pH 11,0 5 10,1,2,3,4,Time(min),6,5,7,高,pH,下,碱性成分的保留增加,待测物,pKa,+,1.5,以外,的流动相,pH,可保证方法的稳定性,Zorbax,色谱柱发展史,1973,ZORBAX SIL,发明专用于,HPLC,分离的球状、小颗粒硅胶(专利),1977,ZORBAX ODS,单官能团,单层键合相发明者之一,1978,ZORBAX column,首先推出色谱柱的质量信誉保证,1982,ZORBAX GF-250,改善了蛋白质尺寸分离的稳定性,1987,ZORBAX Rx-SIL,推出适合碱性化合物的,HPLC,分离的全新硅溶胶技术(专利),1990,ZORBAX,StableBond,增强了低,pH,条件下键合相的稳定性(专利),1996,ZORBAX Eclipse XDB,双封端技术提高了中等,pH,条件下键合相的稳定性(专利),1997,Zorbax,LC/MS column 15,和30,mm(3.5um),快速,高分辨率,高通量,LC/MS,色谱柱,1998,ZORBAX Bonus-RP,极性键合技术使碱性化合物的分离得到改善(专利),1999,ZORBAX,CombiHT,专为小规模组合化学样品制备设计的高通量色谱柱,1999,ZORBAX Eclipse,dsDNA,用于分析双链,DNA,的多孔硅胶柱,1999,ZORBAX Carbohydrate,分析单,双,三糖和糖醇的专用柱,1999,Zorbax,Extend C18,独特宽,pH,跨度,高,pH,下使用的硅胶基质色谱柱(专利),2001,Zorbax,SB-,aq,可在低,pH,下(18)使用100%水相的填料(专利),2002,Zorbax Poroshell,300SB,蛋白质高速,高效反相分离新填料,2002,ZORBAX 3.0mm,内径.3-,mm,柱径溶剂节省柱,2003,ZORBAX sub 2 micron1.8um,粒径的高通量,超高速色谱柱,(5月1日上市,),2003,ZORBAX,PrepHT,高通量全系列制备柱-分析柱向制备柱直接放大,(6月1日上市),键合相-适用,pH,范围,StableBond,pH 1-8,1.,使用空间位阻大的硅烷,2.未-封端,Eclipse XDB,pH 2-9,1.,致密键合的二甲基烷基硅烷,2.专利技术双-封端,Bonus-RP,pH 2-9,1.,极性烷基固定相,2.使用空间位阻大的硅烷,3.三封端,Extend-C18,pH 2-11.5,1.,独特的双齿键合结构,2.双封端,Si,O,Si,O,Silica Support,C18,C18,Si,O,NH,O,Silica-based,色谱柱,Packing with Alkyl/am,内径,e Stationary Phase,O,R,R,Si,OH,Si,O,Si,R,R,R,O,OH,R,CH,CH,CH,CH,CH,CH,O,Si,O,O,O,O,Si,Si,Si,CH,CH,CH,CH,CH,CH,Si,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,O,R,Si,Si,O,Si,O,R,R,1,CH,3,CH,3,CH,3,CH,3,R,R,1,CH,3,R,1,R,1,R,1,CH,3,R,1,1 1,Si,Si,PG,PG,PG,R,1,R,1,极性官能团,低,pH,下,分析酸性,碱性和中性组分,峰形优异,柱寿命长,中等,pH,下,分析酸性,碱性和中性组分,尤其碱性组分峰形优异,柱寿命长,中等,pH,下,分析酸性,碱性和中性组分,可用于100%全水相,尤其极性组分峰形优异,柱寿命长,中高,pH,下,分析酸性,碱性和中性组分,尤其碱性组分峰形优异,柱寿命长,SB-C18,80,A&300 A,pH:18,SB-C8,80,A&300 A,pH:18,SB-,苯基,80,A,pH:18,反相色谱柱,Bonus-RP,空间位阻保护+三封端,80,A,pH:29,Extend-C18,80,A&300 A,pH:211.5,Eclipse XDB,双封端,Eclipse XDB-C18,80,A,pH:29,Eclipse XDB-C8,80,A,pH:29,Eclipse XDB-,苯基,80,A,pH:29,StableBond,空间位阻保护,Poroshell,300SB-C18,实心核多孔壳,pH:18,SB-CN,80,A&300 A,pH:18,SB-C3,80,A&300 A,pH:18,Zorbax,产品系列,SB-AQ,空间位阻保护,80,A,pH:18,可使用,100%水相,Extend,双齿键合+双封端,低,pH,中,pH,高,pH,安捷伦,HPLC,色谱柱维护保养,Zorbax,色谱柱=高柱效+长寿命,min,0,0.5,1,1.5,2,Norm.,0,10,20,30,40,50,色谱柱:,ZORBAX SB-C18,4.6 x 30 mm,1.8um,流动相:60%甲醇:40 水,流速:1,mL,/min,温度:室温,检测:,UV 254 nm,柱效,进样次数#3#4,166356138,10068576372,20068826381,30068956381,40068836294,50068156312,60066876236,70066536115,80066956221,90067816300,68106302,1300 68586528,203468236343,1,2,3,4,样品,尿嘧啶,苯酚,4-,Cl,-,硝基苯,甲苯,色谱柱柱内体积和平衡时间,单次样品运行时间=分析时间+色谱柱平衡时间,色谱柱平衡时间=10倍柱内体积,流速,4.6,x 500.5,mL,5 min,4.6 x 300.3,mL,3 min,4.6 x 150.15,mL,1.5 min,4.6 x 1501.54,mL,15 min,2.1 x 500.10,mL,5 min60 sec,2.1 x 300.06,mL,3 min36 sec,2.1 x 150.03,mL,1.5 min18 sec,色谱柱柱内 平衡时间,尺寸体积 流速,(,mm)(,Vm,)1.0,mL,/min,色谱柱柱内 平衡时间,尺寸体积 流速,(,mm)(,Vm,)0.2,mL,/min 1.0,mL,/min,清洗液相色谱柱,冲洗色谱柱-用比,流动相更强的溶剂,反相色谱柱,用以下溶剂至少各25,mL,冲洗色谱柱(分析柱),不含缓冲盐的流动相,100%甲醇,100%乙腈,75%乙腈+25%异丙醇,100%异丙醇,100%二氯甲烷*,100%己烷*,*若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱,则在重新使用反相,流动相以前,必须用异丙醇冲洗色谱柱!,正相色谱柱,用以下溶剂至少各50,mL,冲洗色谱柱(分析柱),50%甲醇+50%三氯甲烷,100%乙酸乙酯,0.12,mm,内径管线用于毛细管,HPLC,中2.1内径色谱柱,0.17,mm,内径管线用于分析型,HPLC,中2.14.6内径色谱柱,0.25mm,内径管线用于半制备型,HPLC,中9.4内径色谱柱,0.5mm,内径管线用于制备型,HPLC,中21.2内径色谱柱,连接管线与接头,色谱柱:,StableBond,SB-C18,4.6 x 30 mm,3.5 mm,流动相:85%,H2O with 0.1%,三氟乙酸 :15%,ACN,流速:1.0,mL,/min,温度:35,C,50,m,L,柱外体积（管线）,4,3,2,1,Time(min),0.0 0.5 1.0 1.5 2.0,10,m,L,柱外体积,Time(min),0.0 0.5 1.0 1.5 2.0,4,3,2,1,样品:,1.苯丙胺酸,2.5-苯基,-3,6-,二氧-2-哌嗪乙酸,3.Asp-,Phe,4.,天冬甜素,HPLC,常用的色谱柱接头,Troubleshooting LC Fittings,Part II.J.W.Dolan and P.Upchurch.,LC/GC Magazine 6:788(1988),0.09,in.=2.33 mm,Swagelok,安捷伦1100液相,Parker,Valco,Uptight,0.09,in.=2.33 mm,0.08,in.=2.07 mm,0.09,in.=2.33 mm,0.13,in.=,3.37,mm,0.17,in.=,4.40,mm,Waters,Rheodyne,如果伸出的管线长度过长，可能漏液,螺母坡度不匹配，密封性差,死体积区,如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积,HPLC,常用的色谱柱接头,活塞杆与密封圈,蓝宝石活塞杆 1/包装部件号：5063-6586,活塞杆密封圈,（,Vespel,聚酰亚胺用于,反相,）2/包装部件号：5063-6589,*,己烷对,Vespel,聚酰亚胺有溶涨作用,活塞杆密封圈,（聚乙烯用于,正相,）2/包装部件号：0905-1420,样品:,尿嘧啶,苯酚,N,N-,二甲基苯胺,更换前 更换后,色谱柱:,Bonus-RP 4.6 x 75 mm,3.5 mm,流动相:30%,H,2,O,:70%,MeOH,流速:1.0,mL,/min,温度：室温,检测器:,UV 254nm,0.0 0.5 1.0 1.5,Time(min),2,1,3,0.0 0.5 1.0 1.5 2.0,Time(min),2,1,3,塔板数,USP,拖尾因子(5%),1.22351.72,2.34911.48,3.54321.15,塔板数,USP,拖尾因子(5%),1.36701.45,2.104571.09,3.100851.00,活塞杆与密封圈,检测器用灯,检测器用灯,检测器用灯,1.DAD,的氘灯替代,VWD,的氘灯,关闭灯电源,冷却5,min,以上,将,lamp,设定的,VWD configuration,的灯类型改为2140-0590,2.灯能量测试,以水为流动相,灯预热10,min,以上,在化学工作站,Diagnosis,状态下,进行波长校准,将紫外灯的使用时间归零,DAD,的氘灯替代,VWD,的氘灯,DAD,故障诊断与维护,要进行,DAD,故障诊断,单击,DAD,图标,然后选择,Show Module Test,选项,进入,DAD,测试选项画面,DAD,故障诊断测试共有8项内容：,DAD Self-Test,DAD Intensity Test,DAD Cell Test,常做的,DAD,维护：,更换灯,清洗或更换流动池窗,Diagnosis,界面故障原因分析,故障选择框,可能原因框,诊断过程故障分析,样品分析过程中故障分析,在,Diagnosis,画面中为用户提供了在诊断过程或样品分析过程中出现的问题以及可能的原因,样品溶剂溶解强度,样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰,色谱柱:,ZORBAX StableBond SB-C8,4.6 x 150 mm,5 mm,流动相:82%,H,2,O:18%ACN,进样体积:30,mL,A.,样品溶剂,100%乙腈,0 10,Time(min),1,2,B.,样品溶剂,流动相,0 10,Time(min),1,2,样品:,1.,Caffeine(,咖啡因),2.,Salicylamide,(,水杨酰胺),中性分析时为何要使用缓冲液？,色谱柱:,ZORBAX Eclipse XDB-C8,4.6 x 75 mm,3.5 m,流动相:44%,A:56%,甲醇,流速:1.0,mL,/min,温度:25,C,检测:,UV 250 nm,含缓冲液的流动相可改善保留,分离和色谱峰峰形.,样品:1.,ketoprofen,2.ethyl,paraben,3.hydrocortisone 4.,fenoprofen,5.,propyl paraben,6.,propranolol,7.ibuprofen,A=pH 7.0,水,A=pH 7.0,水+25,mM,磷酸缓冲液,0,1,2,3,4,5,Time(min),1,2,3,4,6,7,5,0,1,2,3,4,1,4,6,7,2,3,5,Time(min),0 2.5 5.0 7.5,Time(min),1,2,3,4,5,6,0 2.5 5.0,Time(min),1,2,3,4,5,6,增加缓冲液浓度减少拖尾,色谱柱:,ZORBAX Eclipse XDB-C8,4.6 x 150 mm,5 mm,流动相:40%磷酸盐缓冲液,60%,ACN,流速:1.5,mL,/min.,温度:40,C,USP,Tf,1.62,1.65,1.63,1.77,1.83,1.12,10,mM,磷酸盐,pH 7.0,USP,Tf,1.41,1.50,1.33,1.39,1.36,1.00,25,mM,磷酸盐,pH 7.0,在中等,pH,下,离子强度较高,能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾,样品:,Tricyclic,Antidepressants,（,三环抗抑郁剂）,1.,Desipramine,（,脱甲丙咪嗪）,2.,Nortriptyline,（,去甲替林）,3.,Doxepin,（,多塞平）,4.,Imipramine,（,丙咪嗪）,5.,Amitriptyline,（,阿米替林）,6.,TrImipramine,（,三甲丙咪嗪）,TEA,对碱性成分峰形的影响,0 2.5 5.0,Time(min),1,2,3,4,5,色谱柱:,ZORBAX Eclipse XDB-C8,4.6 x 150 mm,5 mm,流动相:85%25,mM,Na,2,HPO,4,:15%ACN,流速:1.0,mL,/min.,温度:35,C,USP TF 5%,1.1.29,2.1.33,3.1.63,4.2.35,5.1.57,No TEA,10,mM,TEA,USP TF 5%,1.1.19,2.1.18,3.1.20,4.1.26,5.1.14,Time(min),0.0,2.5,5.0,3,5,4,2,1,pH 7,样品:,1.,Phenylpropanolamine,（,去甲麻黄碱）,2.,Ephedrine（,麻黄素）,3.,Amphetamine（,苯丙胺）,4.,MethAmphetamine,（,脱氧麻黄碱）,5.,Phenteramine,（,苯丁胺）,竞争酸对酸性组分的峰形的影响,色谱柱:,ZORBAX StableBond SB-C18,4.6 x 150 mm,5 mm,流动相:40%,A:60%ACN,流速:1.0,mL,/min.,温度:室温,样品:,Ibuprofen（,异丁苯丙酸）,pKa,4.4,pH 3,5,mM,NaH,2,PO,4,T,f,=1.8,pH 3,5,mM,NaH,2,PO,4,1%,乙酸,pH 2.5,0.1%,三氟乙酸,T,f,=1.0,T,f,=1.09,A:,乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中,三氟乙酸由于所需浓度较低,可作为首选,色谱柱技术,5988-6467EN,流动相对色谱的影响(,TE40),液相色谱柱:,ZORBAX Eclipse XDB-C8,色谱柱尺寸:4.6,x 50 mm 3.5m,部件号:935967-906,UV:254 nm,流速:1,mL,/min.,室温,Uracil,Butylparaben,Naphthalene,Dipropylphthalate,Acenaphthene,尿嘧啶,尼帕尔金丁酯,萘,二丙基邻苯二甲酸酯,苊,刻度混合:,Dial-a-Mix,A:,水,B:,甲醇,用泵抽取50%,B,体积比混合:,Vol,/,Vol,250,mL,水+250,mL,甲醇,用泵抽取100%混合液,定容混合:,Mix-to-Mark,250,mL,甲醇,用水定容至500,mL,用泵抽取100%混合液,预混合（重量比混合）:,Premixed,(,w/w),200 g,甲醇+200,g,水,用泵抽取100%混合液,改变流动相配比方式,可增加柱效,（提高灵敏度）,液相分析-小诀窍,提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）,减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）,缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）,减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）,使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）,使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）,使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）,改变流动相,pH,，可增加柱效（提高灵敏度）,改变有机相%,，可增加柱效（提高灵敏度）,改变键合相,，可增加柱效（提高灵敏度）,改变有机添加剂,，可增加柱效（提高灵敏度）,改变流动相配比方式,，可增加柱效（提高灵敏度）,生化 多肽-,5988-6316EN,升温对于反相,HPLC,分离强疏水肽的影响(,B27),Polypeptide,流动相:,A:,含0.05%三氟乙酸的水,B:,含0.05%三氟乙酸的乙腈,2%,B/min,进样量:100,L(50g,的6,M,脲/5%乙酸),UV:210 nm,流速:,1,mL,/min,室温,液相色谱柱:,ZORBAX StableBond-C18,色谱柱尺寸:4.6,x 250 mm 5m,部件号:880975-902,室温,30,0,C,40,0,C,50,0,C,60,0,C,70,0,C,提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）,环保,样品:除草剂,流动相:52/48 0.1,M,乙酸钠/甲醇,pH 6,流速:0.45,mL,/min,温度:40,90,检测:,UV,除草剂:柱温的影响,Herbicides:Effect of Column Temperature,1.西玛津,2.敌草隆,3.扑灭津,4.扑灭净,5.异丙甲草胺,1.,Simazine,2.,Diuron,3.,Propazine,4.,Prometryn,5.,Metolachlor,液相色谱柱:,Zorbax StableBond-C18,色谱柱尺寸:4.6,x 150 mm,5m,部件号:883975-902,目录,P625,40,90,提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）,生物制药,液相色谱柱:,Zorbax 300 StableBond-C3,色谱柱尺寸:4.6,x 150 mm,5m,部件号:883995-909,肽类/蛋白质:升温对分离的影响,Peptides/Proteins:,Effect of Elevated Temperature,样品:多肽,流动相:,A=5:95,乙腈:水,0.10%三氟乙酸(,V/V%),B=95:5,乙腈:水,0.085%三氟乙酸(,V/V%),梯度:在 20,min,内 15-53%,后运行时间 12,min,流速:,l.0,mL,/min,温度:室温-60,检测:,UV 215 nm,1.亮氨酸脑啡呔,2.血管紧张素,II,3.,核糖核酸酶,A,4.,牛胰岛素,5.细胞色素,C,6.,溶菌酶,7.肌红蛋白,8.碳酸酐酶,1.,Leucine Enkephalin,2.,Angiotensin,II,3.,Rnase,A,4.Insulin(BOV),5.,Cytochrome,C,6.,Lysozyme,7.,Myoglobin,8.Carbonic,anhydrase,目录,P611,提高柱温，,可增加柱效,（提高灵敏度）,生物制药,液相色谱柱:,Zorbax StableBond-C8,色谱柱尺寸:,150 mm,5m,减小毛细管内径来提高,低浓度样品的检测灵敏度,Reducing Capillary ID to Improve Sensitivity,for Concentration-Limited Samples,流动相:60%乙腈/40%水,流速:内径 0.3,mm-4,uL,/min,内径 0.5,mm-10,uL,/min,内径 1.0,mm-50,uL,/min,内径 4.6,mm-1.0,uL,/min,温度:室温,检测器:,UV 254 nm,样品:200,ng,联二苯(100,nl,),目录,P611,减小柱径，可增加柱效（提高灵敏度）,色谱柱技术,5988-6454EN,使用小体积色谱柱对于检测器响应时间的重要性(,TE32),液相色谱柱:,ZORBAX StableBond-C18,色谱柱尺寸:4.6,x 15 mm 3.5m,部件号:831975-902,流动相:,乙腈,:1%,甲酸=32:68,UV:254 nm,流速:1.0,mL,/min.,30C,进样量:5,L,响应时间:4.0秒,响应时间:2.0秒,响应时间:1.0秒,响应时间:0.5秒,响应时间:0.1秒,尿嘧啶,乙酰水杨酸,N-,乙酰苯胺,Uracil,Acetylsalicylic acid,Acetanilide,缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）,色谱柱技术 5988-6428,EN,不同硅胶类型比较(,TE1),流动相:,含0.05%甲醇的二氯甲烷,液相色谱柱,toluene,benzanilide,phenol,benzyl alcohol,Zorbax,Sil,Spherisorb,Zorbax Rx-,Sil,甲苯,N-,苯甲酰苯胺,苯酚,苯甲醇,使用高纯硅胶，,可增加柱效,（提高灵敏度）,有机化学,5988-6366EN,pH,对苯胺取代物分析的影响(,ORCH1),流动相,25,mM,磷酸:甲醇=58:42,流速:,1,mL,/min,22C,液相色谱柱:,ZORBAX StableBond-C18,色谱柱尺寸:4.6,x 150 mm 5m,部件号:883975-902,对位甲氧基苯胺,间位苯甲胺,3-氨基-苯甲腈,对位氯苯胺,间位氯苯胺,邻位氯苯胺,p-,anisidine,m-,toluidine,3-amino-,benzonitrile,p-,chloroaniline,m-,chloroaniline,o-,chloroaniline,pH:2.5,pH:7.0,改变流动相,pH，,可增加柱效,（提高灵敏度）,生化 肽,5988-6293EN,三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响(,B10),Peptide,流动相:,A:,水和三氟乙酸,B:,乙腈和三氟乙酸,0-30%,B（30 min.,内）,流速:,1,mL,/min,UV:254 nm,进样量:6,uL,十肽菌素标样,S1-S5（,疏水性有略微差异）,40,C,液相色谱柱:,ZORBAX 300 SB-C8,色谱柱尺寸:4.6,x 150 mm 5m,部件号:883995-906,1.0%三氟乙酸,0.05%三氟乙酸,0.25%三氟乙酸,改变流动相,pH，,可增加柱效,（提高灵敏度）,食品分析,5988-6360EN,流动相强度对单糖和二糖分离的影响(,FD4),流动相:,乙腈/水如图,流速:1,mL,/min,示差折光检测器,液相色谱柱:,ZORBAX NH2,色谱柱尺寸:4.6,x 250 mm 5m,部件号:880952-708,果糖,葡糖,蔗糖,Palatinose,海藻糖,异麦芽糖,Fructose,Glucose,Saccharose,Palatinose,Trehalulose,Isomaltose,乙腈/水,70/30,乙腈/水,75/25,改变有机相%，,可增加柱效,（提高灵敏度）,色谱柱技术,5988-6468EN,有机改性剂和,pH,对于选择性的影响(,TE5),流动相:,25,mM,磷酸缓冲液,流速:,1,.0,mL,/min.,22C,液相色谱柱:,ZORBAX StableBond-CN,色谱柱尺寸:4.6,x 150 mm 5m,部件号:883975-905,anisidine,m-,toluidine,4-,cl,-aniline,3-,aminobenzonitrile,3-,cl,-aniline,2-,cl,-aniline,甲氧基苯胺,间位苯甲胺,4-氯-苯胺,3-氨基苯甲腈,3-氯-苯胺,2-氯-苯胺,42%甲醇：58%缓冲液 30%甲醇：70%缓冲液,pH 2.6,pH 3.0,改变有机相%，,可增加柱效,（提高灵敏度）,色谱柱技术,5988-6453EN,ZORBAX Eclipse,系列色谱柱的选择性(,TE31),液相色谱柱:,ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl,色谱柱尺寸:4.6,x 150 mm 5m,部件号:993967-912,流动相:,甲醇:水=,70:30,UV:254 nm,流速:1.0,mL,/min.,室温,Zorbax Eclipse XDB-,苯基,Zorbax Eclipse XDB-C8,Zorbax Eclipse XDB-C18,尿嘧啶,苯酚,4-氯-硝基苯,甲苯,萘,Uracil,Phenol,4-,Cl,-nitrobenzene,Toluene,Naphthalene,改变键合相，,可增加柱效,（提高灵敏度）,生物制药,液相色谱柱:,Zorbax Extend-C18,色谱柱尺寸:2.1,x 150 mm,5um,部件号:773700-902,三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类,RP-HPLCESI-MS,分离的选择性比较,Selectivity Comparison of TFA and,NH,4,OH for Peptide RP-HPLCESI-MS Analysis,流速:0.25,mL,/min.,温度:25,梯度:5-60%,B in 20 min.,LC/MS:,正离子,ESI-,Vf,70V,Vcap,4.5 kV,N2-35,psi,12 L/min.,300,样品:4,L(,各50,ng,),三氟乙酸条件:,A-0.1%,三氟乙酸水溶液,B-0.085%,三氟乙酸 80%的乙腈溶液,NH4OH,条件:,A-20,mM,NH4OH,水溶液,B-20,mM,NH4OH 80%,的乙腈溶液,目录,P613,改变有机添加剂，,可增加柱效,（提高灵敏度）,生化,肽,十肽菌素,5988-6299EN,酸对于反相肽的分离的影响(,B16),decapeptide,流动相:,A:,含相应的酸的水相,B:,含相应的酸的乙腈,0%-30%,B（30 min.,内）,进样量:6,L,肽标样,UV:254 nm,流速:,1,mL,/min,40C,液相色谱柱:,ZORBAX 300 SB-C8,色谱柱尺寸:4.6,x 150 mm 5m,部件号:883995-906,十肽菌素,S1,十肽菌素,S2,十肽菌素,S3,十肽菌素,S4,十肽菌素,S5,decapeptide,S1,decapeptide,S2,decapeptide,S3,decapeptide,S4,decapeptide,S5,0.1%三氟乙酸,0.025,M H,3,PO,4,改变有机添加剂，,可增加柱效,（提高灵敏度）,色谱柱技术,5988-6467EN,流动相对色谱的影响(,TE40),液相色谱