标记免疫分析技术1.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,体外分析技术,郑州大学第一附属医院核医学,阮 翘,临床核医学,诊断,治疗,体外分析技术,体内检查法,放射性核素显像,功能,（,非显像,）测定,临床核医学,体外分析技术,体外放射分析,体外非放射分析,一,.,体外放射分析,（,in vitro,radioassay,）,(,一）,.,概要：,1.,定义：,指在体外实验条件下，以,结合反应,为基础，以,放射性核素标记物,为示踪剂，以,放射性测量,为定量手段，对,微量物质,进行定量检测的一类核技术的总称。,1960,年由美国学者,Yalow,和,Berson,创立,放射免疫,分析。,使生物医学领域微量物质定量分析技术取得了划时代的进展。它使得那些原先认为是无法测定而又具有重要生物学意义的微量物质得以精确定量,.,从而为进一步揭开生命奥秘打开了一条新的道路，使人们有可能在,分子水平,上重新认识某些生命现象的生化生理基础。,1977,年，这项技术的发明者荣获诺贝尔生物医学奖。,.,放射免疫分析,(radioimmunoassay RIA),；,.,免疫放射分析,(immunoradiometric,analysis,IRMA),；,.,竞争性蛋白结合分析,(competitive,protein-binding analysis CPBA),；,.,放射受体结合分析；,.,放射性酶结合分析。,目前这些技术迅速渗透到医学科学的各个领域，如内分泌学、病毒学、药理学、血液学、免疫学、法医学、肿瘤学等，以及与医学生物学相关的学科，如农业科学、生态学及环境科学等。,测定的种类可包括生物体内所有具有,免疫原性的物质，如蛋白质，多肽，激素，药物，酶类，核酸，细胞因子等。,2.,特点,（,1,）灵敏度高（,10,-9,10,-15 g,),灵敏度是指可以检测到的最小化学量。,（,2,）特异性强,特异性是指测量方法中所用的抗体或结合剂对被测物质特异结合的性质，也是指它的专一性。,（,3,）放射性核素不引入人体。,（,4),操作简单，样品用量少，应用范围广。,（二）,.,基本原理,（以放射免疫分析为例）,免疫分析是以抗原与其特异性抗体的免疫反应为基础，利用待测抗原及定量标记抗原与限量的特异性抗体进行竞争性结合反应，以放射性测量为定量手段，检测待测抗原浓度的方法。其竞争抑制可用下式来表示：,1.,基本反应模式：,Ag,AgAb,+,Ab,*Ag *,AgAb,Ag:,未标记抗原（标准品或待测抗原）,;,*Ag:,标记抗原,;,Ab,:,抗体，,AgAb,:,未标记抗原抗体复合物，,*,AgAb,:,标记抗原抗体复合物。,反应体系的条件,：,（,1,）,.,标记抗原和未标记抗原免疫活性一致，共同竞争性与抗体相结合；,（,2,）,.,标记抗原、抗体量恒定，且标记抗原与未标记抗原量之和大于抗体上有效结合点的数目。,（,3,）,.,反应呈双向进行，当反应达到平衡时，反应式两端的摩尔浓度相对稳定；,（,4,）,.,标记抗原抗体复合物的生成量取决于未标记抗原的浓度，两者呈逆相关函数关系。,2.,竞争抑制曲线（标准曲线）,既用已知的不同浓度的标准品分别与定量的标记抗原和抗体进行免疫反应，当反应达到平衡时，分离结合及游离部分，并分别测量其放射性，则不同浓度的标准品就得到相应的不同标记抗原抗体结合率，以其为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，就可绘出一条竞争抑制曲线。,Ag,25,50,100,200,400,800,*,Ag,Ab,分离,B,、,F,B,1,%,B,2,%,B,3,%,B,4,%,B,5,%,B,6,%,1,2,3,4,5,6,B%,？,7,B,0,0,B,0,%,B%,B/F,60,3.,基本步骤,加样,(Ag*Ag,Ab,),温育（反应达到平衡）分离 放射性测量 数据处理 质量控制（评价）,（四）,.,基本技术,1.,标准品,(,standard preparation,),；,2.,标记抗原,(,labelled,antigen,),；,3.,特异性抗体,(,specific antibody,);,4.,合适的分离技术,(separation method).,1.,标准品,(,Standard preparation,),：,是放射免疫分析定量的依据，要求其与待测物化学结构免疫活性一致、性能稳定、不含干扰免疫反应物质。标准品浓度选择应满足生理病理范围。,2.,标记抗原,(,labelled,antigen,),：,a.,放射性核素的选择,-,125,I,，,3,H,，,14,C,；,b.,标记抗原与未标记抗原免疫活性一致；,c.,标记抗原有一定比度（比度指单位质量物质所具有的放射性强度,KBq/ug,）；,d.,放射化学纯度（标记抗原放射性占总放射性的百分比）：要求大于,95%,。,3.,特异性抗体,(,specific antibody,),要求：特异性强、亲和力大、合适的滴度,。,（,1,）特异性,(,Specificity,),：,测定方法中所用的抗体或结合剂对被测物特异结合的性质，指不受交叉反应物影响的程度。评价指标为交叉反应率。,鉴定方法,：,（,2,）亲和力,(,Affinity,),：,指配体与结合剂之间的结合强度，以抗体的亲和常数（,Ka,值）表示。,（,3,）合适的滴度,(,Titer,),：,指抗血清最佳稀释度的选择。,测定方法：把抗血清用缓冲液稀释成不同浓度，各取系列稀释度加入到试管中，然后加入一定量的标记抗原，按常规放免操作，反应达平衡后，分离结合与游离部分，测结合率；以稀释度为横坐标，以结合率为纵坐标绘制抗血清稀释曲线。,以结合,50%,标记抗原时所对应的稀释度为抗体的滴度，变化范围,40%-60%,之间,。,4.,合适的分离技术,(,separation method,),：,4.,合适的分离技术,(,separation method,),：,要求：,a.,使结合、游离部分分离完全；,b.,分离过程不破坏原平衡体系；,c.,分离方法简便迅速，非特异结合少，适合大批样品检测。,.,常用分离技术：,（,1,）沉淀法,(,precipitation method,),：,常用的试剂为有机试剂（如聚乙二醇,PEG,）,或中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等），其有很强的脱水作用，使抗体分子失去表面水壳层而沉淀下来，而抗原在同样浓度的分离剂中不会沉淀，从而达到分离结合 抗原和游离抗原的目的。,优点,：操作简便、分离迅速、试剂易得价廉。,缺点,：为非特异性结合高，易受蛋白浓度,、,PH,值、离子强度与环境温度等影响。,（,2,）双抗法,(,double antibody method,),：,为一种免疫分离技术，用第一抗体免疫另一动物得到抗抗体或称第二抗体，它能与第一抗体形成的复合物结合而沉淀下来。,优点,：稳定和非特异性结合低，是一种特异性分离技术。,缺点,：分离时间长，二抗用量大费用高，易受血清蛋白浓度及补体的干扰。,（,3,）沉淀加双抗法,双抗体法非特异结合低，但所需时间长，抗体用量大，,PEG,法操作简便快速，但非特异结合高。,采用双抗体与,PEG,联合使用，它既兼顾了双抗体法和沉淀法的优点，又克服了两者的缺点，使分离更快速，非特异结合低，二抗用量少，此方法目前已被广泛应用。,（,4,）固相法,(,solid phase method,),是将抗体（包括第一抗体或第二抗体）或抗原吸附在固相载体上完成，反应达平衡后，倒去上清液中的游离部分，直接测量固相的放射性活度即为结合部分,B,的量。,优点,：操作简便，不需离心，分离效果好、迅速、非特异结合低。,缺点,：制备较麻烦。,（,5,）活性炭吸附法,(,active carbon absorptive method,),利用表面活性物质能吸附小分子的游离部分，经过离心，,F,沉淀下来，,B,仍保留在溶液中，从而达到分离,B,和,F,的目的。常用的吸附剂有葡聚糖包被的活性炭（,DCC,）、,硅酸镁、滑石粉、离子交换树脂等。吸附法的优点是简单快速、价廉易得、不受反应体积的限制；缺点是非特异结合高，易受温度影响。,（,6,）磁化分离技术,是将磁化材料引入,RIA,体系，反应达到平衡后，借助磁力将,B,和,F,分离。按磁化材料的不同，可分为：磁化活性颗粒法、磁化固相抗体分离法。其优点为操作简便、快速、分离完全、非特异性结合低、重复性好、无需离心。适合大批样品检测。,