反向遗传学和其相关技术课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,反向遗传学和其相关技术,一、概述,（一）遗传研究的二条途径,1、表里：,正向遗传学研究,杂交或诱变表型观察遗传规律确定存在的基因及数目基因的功能及作用性质。,这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向遗传学采用的研究方法。,2、,里表：,反向遗传学研究,在已知DNA序列的基础上，通过DNA重组、定点突变、插入/缺失等,遗传修饰,手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规律。,与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传学技术。,（二）RNA病毒的反向遗传学,采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。,能够拯救病毒的遗传材料称为,感染性克隆,，一般是在,细菌质粒中含有整个病毒基因组的,cDNA,拷贝,，使得,cDNA,本身或从,cDNA,体外转录所得的,RNA,具有感染性。,RNA,病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列，检测被拯救的人工改造病毒的表型，可以在体内,(in vivo),有效地研究病毒基因结构、功能和病毒,-,宿主相互作用。,RNA,病毒的反向遗传操作,RT-PCR,构建,RNA,病毒的全长,cDNA,，并进行遗传修饰,与,RNA,聚合酶启动子结合,体外转录病毒,RNA,转录物,RNA,感染哺乳动物细胞,拯救到活病毒,拯救病毒的表型变化,病毒基因组的表达、调控、致病机理、,病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等,单正股RNA病毒：,RNA聚合酶,+,mRNA,+,+,+,中间型,结构蛋白,+,子代正股RNA,单负股RNA病毒：,RNA聚合酶,+,结构蛋白,子代负股RNA,逆转录病毒,：,RNA,RNA/DNA,中间体,逆转录酶,DNA/DNA,宿主,子代RNA,正股RNA与负股RNA病毒、逆转录病毒?,（三）真核生物的反向遗传学,采用反向遗传学鉴定基因功能是真核生物功能基因组学的主要内容。,研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。,利用基因敲除或基因沉默而产生的功能变化研究基因功能是主要的反向遗传学技术。,二、反向遗传学相关技术,1、基因的同源重组,2、基因的位点突变,3、基因沉默,基因敲除,利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。,通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。,1、基因的同源重组,完全敲除：通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除。,条件敲除：将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段。,完全敲除条件敲除特定组织/时间基因敲除,基因敲除,1）通过同源重组的基因敲除步骤,构建重组载体,重组DNA转入受体细胞核内,筛选目的细胞,转基因生物,重组载体的类型：,a)替换性载体系统：,包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分。,b)插入性载体系统：,插入基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段。,用替换型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验,2）Res同源重组系统,源于噬菌体Res重组酶的重组系统,Ha 和Hb:同源重组区域,Pa 和Pb:引物位点,sm:筛选标记,Red 同源重组技术用于基因打靶,3）Cre-LoxP同源重组系统,源自P1噬菌体的重组系统,属于传统的同源重组载体，但具有时空调控的功能。该系统由P1噬菌体的,Cre,重组酶和LoxP位点两部分组成。,Cre,重组酶：,由,Cre,基因编码，识别,LoxP,位点，,介导两个,LoxP,位点（序列）之间的特异性重组，使,LoxP,位点间的基因序列被删除或重组。,LoxP,位点：,由,2,个,13bp,的反向重复序列和,1,个,8bp,的间隔区域构成。,Cre酶,Cre酶,Cre酶,Cre重组酶,13bp的反向重复序列,Cre-LoxP 重组系统的特点,Cre,Cre,Cre,重组酶所催化的是一个可逆的重组事件,Cre,催化重组不需要任何辅助因子的参与,介导两个同向,LoxP,位点之间序列的插入,/,缺失（下左）,介导两个反向,LoxP,位点之间序列颠倒（下右）,介导两条含,LoxP,位点,DNA,链的交换或染色体易位。,Cre-Loxp gene knock-out system,4)高等动物基因敲除技术,真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。,显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方 便。,胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。,模式动物小鼠中完全基因敲除的步聚,近交系，白色，易产生免疫缺陷,2、基因的位点突变,1）点突变TILLING技术,TILLING(targeting induced local lesions in genomes),定向诱导基因组局部突变,，是一种快速有效地从由化学诱变剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。,先用化学诱变剂(,甲基磺酸乙酯，EMS)诱发产生一系列的,点突变,，再用设计的特异性引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物变性和退火形成异源双链核酸分子，再用特异切割错配的内切酶CELl酶切，最后变性处理后采用双色聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测分析。,（建池）,TILLING特点：,TILLING技术属于高频率点突变和PCR筛选相结合的技术，可发现基因的错义突变、基因截短型损伤等突变类型。,可获得大量的等位基因系列，对长度很小基因，复等位基因等具有独特的技术优势。,可诱导产生高频率的点突变，筛选目的基因需要较小的突变群体。,不依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统，无需耗时的转基因和复杂的组织培养。,需要知道所研究基因的序列。,2）随机插入突变,T-DNA,插入突变,以农杆菌介导的转化为基础的一种插入突变研究方法，根据插入位点的基因序列与植物表型变异等的相互关系可以从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。,构建T-DNA载体转化突变体的筛选及遗传分析分离T-DNA 插入位点的侧翼序列基因的定位、结构与功能分析。,T-DNA法敲除植物基因及突变体筛选：,a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段 引物。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。,b.PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。,T-DNA插入特点：,不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物中用,T-DNA,插入来敲除一个特定基因仍需要运气。,隐性突变与显性突变：隐性,表型的变化只能在转化体的部分后代中体现出来（基因敲除）；显性,可以在转化体中直接观察到（基因激活）。,某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不体现出功能的丧失。原因：重要的功能基因突变致死和冗余基因。,染色体重排：突变体表型与,T-DNA,插入无关。,效率不高，工作量大。建立饱和的突变体库。,转座子插入突变,利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。,由转座子引起的突变可以转座子DNA为探针，从突变体的基因组DNA文库中筛选到突变的基因，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因。,也可以利用PCR的方法扩增转座子的侧翼序列，进而得到完整的基因信息。,转座子插入特点：,插入的是完整的元件，便于分析。,可从插入位点切除，产生回复突变，因此不仅可以据此确认真正由转座子引起的突变，还可以进一步验证突变基因的功能。,转座子倾向于插入转座子的临近区域，可以用来研究基因组某一局部区域的结构。,通过不断跳动产生新的突变，相对较少的起始转化系就可以获得整个基因组的饱和突变，大大减少了工作量。,可以应用于转化效率不高的植物。,转座子系统,Ac/Ds,系统,由自主性元件（,Ac,）和非自主性元件（,Ds,）构成。,Ds,元件能够在,Ac,编码的转座酶的作用下移动，去除,Ac,元件可使其自身不能转座。,通过遗传杂交引入自主性元件，转座子插入序列可以重新移动。因此，,Ac/Ds,转座子插入系统只需要少量的转基因品系（启动品系）作为转座源即可。,在真核系统中，转座插入事件常不能产生可见的表型，这是因为功能基因的冗余或在早期产生致死效应。采用经修饰的转座子可克服这些困难。,修饰：转座因子后带一个报告基因，报告基因的表达只有在转座事件发生的情况下才能获得，这样就可以通过报告基因来检测转座子的表达情况。,修饰的Ac/Ds转座子系统,增强子陷阱,(enhancer trap),：转座子含有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告基因的表达只有在转座发生在内源增强子附近时才能获得。,启动子陷阱,(promoter trap),：转座子带有一个无启动子的报告基因，这个基因只有在转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游时才能表达。,修饰的方法-增强子陷阱与启动子陷阱,Mu转座子,系,统,转座子打靶载体是以两种噬菌体,Mu,为基础的,mini-Mu,转座子，每个转座子上都携带标记基因。,可以在拟删除基因两侧各插入一个,mini-Mu,转座子，然后在两个插入位点之间制造缺失。,这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分基因转移。,特点：,不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可,载体构建迅速，技术简单,载体可以携带多种不同抗性基因，可以同时处理多基因。,三、基因沉默技术,反义,RNA,RNA,干扰,（,RNAi,）,反义,RNA,技术,反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根据反义RNA的作用机制可将其分为三类：,1、反义RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA，从而直接抑制mRNA的翻译或被RNA酶,识别降解。,2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象的变化，从而抑制其翻译。,3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶mRNA的转录。,（一）概念,RNA干扰,(,RNA interference,，,RNAi,),：,与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种序列特异性转录后,基因沉默,现象。,RNA,干扰,基因沉默,转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing,TGS),转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS),基因沉默,转录水平的基因沉默（,TGS,）,是指基因在细胞核内,RNA,合成受到了阻止而导致基因沉默。,转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。,引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：,基因及其启动子甲基化,：,通常发生在,DNA,的,CG,序列的碱基上，该区,域,碱基甲基化往往导致转录受抑制,。,同源基因间的反式失活,：,拥有同源序列的沉默位点和其他位点的,DNA,的相互作用而引起的基因沉默,。,甲基化并失活的基因能作为一种“沉默子”，对其他具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。,后成修饰作用导致的基因沉默,：,指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。,这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。,后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。,重复序列,：,外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。,转录后水平基因沉默,（,PTGS,）,则是指基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的,mRNA,存在的现象。,引起转录,后,水平的基因沉默机制主要有以下几种：,共抑制,：,由,Napoli,在转,CHS,基因的矮牵牛花中发现,，,普遍存在于转基因植物中。,其,发生是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制。,具有同源性的外基因和内源基因在细胞核内的转录速率很高，但在细胞质内无,mRNA,积累，是典型的转录后水平基因沉默。共抑制的产生不仅同内、外源基因间编码区的同源性有关，还与控制外源基因的启动子的强度等因素有关。,基因压制,：,Cogoni,等,首先,在粗糙脉,孢,霉的转化实验中发现，外源基因可以抑制自身和相应内源基因的表达，他们把这一现象定为基因压制。基因压制是可逆的，而且这种逆转会伴随有外源拷贝的丢失。基因压制发生在转录后水平，导致已复制的稳定态,mRNA,大量减少。,RNA,干扰,：,指将与靶基因的,mRNA,同源互补的双链,RNA(,dsRNA,),导入细胞后并被切割成,21,23,个核苷酸长度的短核苷酸双链，在其它作用因子的参与下能够特异地与其同源的,mRNA,结合并导致其降解，从而产生相应的功能表型缺失。,RNAi 一种新的遗传工具,RNAi,是植物、果蝇、线虫和包括哺乳动物在内的许多生物抵抗病毒感染和限制转座子运动的一种自然存在的防御机制。,RNAi,可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，来制备特定基因缺失表型的个体，从而研究该基因的功能,.,这项技术在疾病的基因治疗上也有光明的应用前景。特别可以用于阻断某些突变基因的表达，或者由蛋白过量表达引起的疾病。,(二)、RNA干扰的发现,1994年 Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为,基因压制,(quelling)。,共抑制现象,(cosuppression),上世纪90年代初，,美国和荷兰的两个转基因植物实验组在对矮牵牛(,petunias,)的研究中发现:,转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制。,1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因实验中发现：,反义RNA与正义RNA（对照）都能切断par-1基因的表达。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。,Guo S,Kemphues KJ,Par L.,Cell,1995,81:611-620.,秀丽新小杆线虫转基因实验,反义RNA与正义RNA？,反义RNA,-,与靶核酸(如mRNA或有义DNA)链互补的RNA分子，可抑制靶核酸的功能。,正义RNA-,与mRNA对应的RNA分子。,RNA干扰的发现,1998年，Fire和Mello（美）首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的,基因沉默,。他们发现Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了,微量双链RNA,而引起：,将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级。该小组将这一现象称为,RNA干扰,。,Fire A,Xu S,Montgomery ME,et al.,Nature,.1998,391:806-811.,Negative,control,showing lack of staining in the absence of the hybridization probe.,（对照，缺,mex-3,，不着色）,(B)Embryo from,uninjected,parent showing normal pattern of endogenous,mex-3,RNA(purple staining).,（正常野生型，紫）,(C)Embryo from parent,injected with purified,mex-3,antisense RNA,.These embryos(and the parent animals)retain,mex-3,mRNA,although levels may be somewhat less than wild type.,（,野生型,+,反义,RNA,，浅紫）,(D)Late 4-cell stage embryo from a parent,injected with,dsRNA,corresponding to,mex-3,;no,mex-3,RNA is detected.(Templates used for interfering RNA and,in situ,probes were largely non-overlapping.),（野生型,+,双链,RNA,，不着色）,Effects of,mex-3,RNA interference on levels of the endogenous mRNA.Nomarski DIC micrographs show,in situ,hybridization,（原位杂交）of 4-cell stage embryos.,“沉默”是,金,Fire与Mello获2006年诺贝尔奖,在1999年一年内,发现RNA干扰现象广泛存在于植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物细胞中。2000年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在RNA干扰现象。,2000年提出RNAi作用机制模型。,Hannond SM et al.,Nature,2000,404(6775):293-296,Zamore PD.,Cell,2000,101(1):25-33,2001年，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。,Nature，,2001，411（6836）：494498,RNAi技术被Science评为2001年度的十大科技进展之一。,2002年5月，Lindenbach(美),双链RNA,艾滋病病毒,细胞,减少艾滋病病毒基因表达90%以上。,2002年7月,Novina等用RNAi技术实现了HIV1病毒的阻抑。,2002年7月,McCaffrey(美)等人,双链RNA+,肝炎病毒,-标志基因,鼠肝脏,抑制标志基因的表达/肝炎病毒基因的表达。,利用RNAi可以直接和有效地起到抗病毒的作用。,共抑制、基因压制和,RNAi,dsRNA,降解靶,mRNA,抑制靶基因的表达。均属于,PTGS,！,dsRNA,导入,线虫,RNAi,；,dsRNA,注射,线虫体腔,RNAi,；,dsRNA,浸润,线虫,/,dsRNA,的工程菌,喂养,线虫,RNAi,。,dsRNA,导入,植物,RNAi,；同样，,dsRNA,注射,植物韧皮部,RNAi,；吸附,500bp,基因片段的金属片,插入,植物,侵入点组织发生,RNAi,。,RNAi,普遍存在于各种生物中,具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达,mRNA,的生物学功能。,（三）、RNA干扰的机制,dsRNA,：双链,RNA,，包含正义链和反义链。,Dicer,：属于,RNase,家族,的一员,，是,dsRNA,的特异性核酸内切酶，,能以一种,ATP,依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链,RNA,。,siRNA,(small interfering RNA),：小干扰,RNA,，是长度为,21-23,个,nt,大小的双链,RNA,，为,RNAi,的关键效应分子。,名词解释：,Dicer contains two RNAse III domains,siRNAs,long dsRNA,siRNA,RISC(RNA-inducing silencing complex),：,RNA,诱导沉默复合物,，,是一种核蛋白复合物，,具有核酸内切、外切以及解旋酶活性。,RdRP,（,RNA-dependent RNA polymerases,）：,依赖,RNA,的,RNA,聚合酶，是,RNAi,的调节因子，使,RNAi,可以在生物体内传递。,RISC:RNA-Induced Silencing Complex,Exonuclease,Homology search activity,Endonuclease,Helicase,5,3,Target mRNA,OH3,5P,核酸外切酶,解旋酶,核酸内切酶,dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步：,第一步（起始阶段）,较长dsRNA在ATP参与下，被RNase的特异核酸酶切割加工成2123nt的，由正义和反义链组成的,小干扰RNA,（small interfering RNA，siRNA）。,siRNA的两条单链末端为5-磷酸和3-羟基，且3端均有2个突出的核苷酸。,Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。,步骤,第二步（效应阶段）,siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成,RNA诱导的沉默复合体,(RNA-induced silencing complex，RISC)。,活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。,RNAi的放大效应机制,siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。,新合成的长链dsRNA同样可被RNase核酸酶切割、降解而生成大量的,次级siRNA,。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为,随机降解性PCR,（random degradative PCR）。,Gisela Storz,Science,296(5571):1263-1265,2002.,异常的单链RNA,依赖RNA的RNA聚合酶,特异性核酸内切酶,RNA诱导沉默复合物,RNAi是转录后水平的基因沉默机制；,RNAi具有很高的特异性：,只有,dsRNA,才能诱导产生,RNAi,；,只有针对编码区的,dsRNA,才能产生有效的和特异性的干扰；,注射同源,dsRNA,可以引起内源性,mRNA,特异性的降解；,dsRNA,不得短于,21,个碱基，大于,30bp,的,dsRNA,不能在哺乳动物中诱导特异的,RNA,干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑制凋亡；,RNAi,具有,高效性,：,RNAi,抑制基因表达具有很高的效率，可达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的,dsRNA,分子就能完全抑制相应基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的；,RNAi干扰的几个重要生物学特征,RNAi,具有很好的,稳定性,：,siRNA,分子,3,端有突出的非配对碱基的双链分子，在细胞内可稳定存在,3-4d,，以,3,端悬垂,TT,碱基的双链,RNA,尤为稳定，半衰期远长于反义寡聚核苷酸。,RNAi,的,可传播性和遗传性,：,RNAi,抑制基因表达的效应可以长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传给,F1,，但,F2,往往恢复为野生型。,RNAi,效应的依赖性：只有连续产生,dsRNA,才能产生长期效应，否则只产生短暂的沉默反应。,RNAi,作用迅速，,mRNA,快速降解；,miRNA及其作用机制,miRNA(m,icroRNA),:,微小RNA，指长度约2125nt的小分子单链RNA，位于基因组的非编码区，进化上高度保守，可在,翻译水平上,对基因表达进行调节的RNA家族。其介导的沉默机制也属于转录后的基因沉默。,miRNA基因的表达具有特定模式:阶段特异性和组织特异性，在不同组织中表达有不同类型的miRNA，在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA 表达。,miRNA的作用机制,相同点:,长度都约,22,nt,左右；,同是,Dicer,产物，因此具有,Dicer,产物的特点；,二者生成都需,Argonaute,家族蛋白的存在；,同是,RISC,的组分。,miRNA与siRNA比较,来源不同：,siRNA,来源于转基因或病毒,RNA,，由长,dsRNA,转变而来；,miRNA,来源于内源转录本，是细胞内,RNA,的固有组分之一，由具有发夹状结构的,pre-,miRNA,转变而来；,结构不同：,siRNA,主要以双链形式存在，其,3,端存在,2,个非配对的碱基，通常为,UU,；,miRNA,主要以单链形式存在；,对靶,RNA,的特异性不同：,siRNA,与靶,mRNA,完全互补配对结合；,miRNA,与靶,RNA,并不完全互补，存在错配现象。靶序列有一个核苷酸突变，就会影响到,siRNA,的作用功能，但不会影响到,miRNA,的功能；,作用形式不同：,siRNA,主要在转录后通过降解,mRNA,发挥作用，而,miRNA,只在蛋白质翻译水平上负调控靶基因的表达。,不同点:,（四）、RNA干扰的研究方法,一般技术路线,（五）、RNA干扰的应用,1.基因功能研究,由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。,已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生,类似基因敲除的效应,。,与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。,2.病毒性疾病的治疗,使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。某研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5（化介素受体，,HIV-1的辅因子,）进入人体外周淋巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。,艾滋病,2.病毒性疾病的治疗,Shlomai和Shaul设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载体：pSUPER,X-siRNA,和pSUPER,core-siRNA,。已转染含1.3 X wt HBV基因质粒载体的Huh7细胞再被 X-siRNA或 core-siRNA转染后，core蛋白水平分别降低了89%、63%，转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%，但转染core-siRNA对HBsAg表达无明显影响,（X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物，而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。,HBV（乙肝病毒）,2.病毒性疾病的治疗,Randall等证明了针对HCV RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCV RNA降低80倍；将siRNA 转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCV RNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等 也证明了,siRNA特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。,HCV（丙肝病毒）,2.病毒性疾病的治疗,RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。,严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，,SARS,)的防治研究，RNAi也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的治疗。,脊髓灰质炎病毒/SARS,3.肿瘤治疗,用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。,(1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因。,(2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达。,(3)RNAi可应用于抑制基因扩增。,Li等在3个,肝癌,细胞系Hep3B、HepG2、SNU449中对cyclin E的研究中发现，,转染siRNA组48 h后生长抑制均达到90，,而对照组无作用，3天后凋亡率分别为16、44和3l，而对照组仅为l。,3.肿瘤治疗,Survivin基因,是迄今为止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成员，可通过,抑制caspase级链反应下游的caspase3，caspase7发挥其抗凋亡作用。,现在研究已证实survivin基因参与了肝癌的发生与发展，并且还与化疗的耐药性相关。降低survivin基因在肝癌细胞中的表达不仅可诱导肝癌细胞的凋亡、抑制肝癌细胞的生长，还可增强其对化疗的敏感性，从而提高肝癌治疗的整体疗效。,CHENG等通过,RNAi抑制肝癌细胞,SMMC7721中,survivin基因的表达,，使细胞株中survivin基因表达几乎缺失，凋亡指数增加156，肝癌细胞生长被抑制。,肝癌,Survivin,基因表达抑制,3.肿瘤治疗,MDR,(Muhidrug resistance 多药耐性)是肿瘤化疗失败的主要原因，形成MDR的最常见的因素是肿瘤细胞MDR基因编码的糖蛋白过度表达，其中，MDR1对于细胞的多重耐药性起着重要的作用。Nieth等表明，特异siRNA可以抑制MDR1基因的表达，从而显著降低肿瘤细胞的耐药性。,PLK1,基因在多种癌症中都呈高度表达，当使用RNAi技术减少其表达后，所有癌细胞的PLKlmRNA和蛋白水平都有显著降低，如MCF-7乳腺癌细胞的PLKlmRNA下降了70%，蛋白水平下降了90%，而且细胞凋亡率提高了百分之几至50%不等。所以，PLK1的siRNA具有抵抗癌细胞的增殖作用，是一种治疗癌症的新途径。,MDR/PLK1,基因表达抑制,4.药物开发,利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快药物开发的研制速度大有益处。在药物开发过程中，用RNAi技术可以对靶基因的功能进行分析，有助于搞清药物的作用机制以及与基因编码产物，及与相应化合物的相互作用，从而更正确地发现药靶，开发更有效的候选药物。,