基因工程所需的基本条本全套ppt.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Headline Text,HE Wenxing,UNIVERSITY OF,Jinan,Headline Text,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章基因工程所需的基本条本,基因工程操作过程,基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶,(,如限制性核酸内切酶，连接酶，,DNA,聚合酶等,),作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为,“工具酶”。,一类来源于原核生物的，能够识别双链,DNA,分子中某种特定核苷酸序列（回文序列，,48bp,），并切割,DNA,双链,使磷酸二酯键断开的核酸内切酶。,1.,定义,第一节 限制性核酸内切酶,（,Restriction endonuclease,）,II,型限制性内切酶：同型二聚体结构与,DNA,双链结合，两个催化,Mg2+,与,DNA,裂解位点相邻,限制性内切酶,EcoRI,的结构,（,2,）修饰（,Modification,）,细菌自身的,DNA,碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护,不能被自身的限制性内切酶识别切割。,2,、细菌的限制和修饰系统（,R/M,体系）,（,1,）限制（,Restriction,）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源,DNA,切成小片断。,研究发现，限制,-,修饰系统广泛存在在原核细菌中，与三个连锁基因相关：,Genes for restriction-modification enzymes are often clustered together in a region called an immigration control region.The immigration island from E.coli K-12 is about 14 Kbp.,噬菌体,DNA,进入细菌后，其基因组,DNA,被降解,3,、类型,分类的主要依据：,亚单位组成,识别序列的种类,是否需要辅助因子,分三类,(I,II,III),（,1,）酶结构,三亚基，包括：,R,（限制酶亚基）；,M,（甲基化酶亚基）；,S,（识别,DNA,序列亚基）,（,2,）切割位点,切割位点在识别位点,1000 bp,以外，无特异性,4,、,I,型限制性内切酶,首先由,M.Meselson,和,R.Yuan,在,1968,年从大肠杆菌,B,株和,K,株分离的，如,EcoB,和,EcoK,，研究较少。,Recognize site,cut,（,3,）结合方式,I,类限制性内切酶与,DNA,结合依赖,M,亚基与辅助因子,S-,腺苷甲硫氨酸（,SAM,）的相互作用。,例子：,EcoB,的识别序列为,T-G-A*-N,8,-T-G-C-T,A-C-T-N,8,-A*-C-G-A,EcoK,的识别序列为,A-A*-C-N,8,-G-T-G-C,T-T-G-N,8,-C-A*-C-G,II,类限制性内切酶,(93%),II,类限制性内切酶由等,1970,年首先在流感嗜血杆菌,Rd,型菌株中发现。目前已有,3000,多种,II,类限制性内切酶被分离，它是分子量较小的单体蛋白，识别和切割双链,DNA,分子时仅需要,Mg2+,识别和切割位点的序列有严格的特异性。,（,1,）酶结构,修饰和限制活性由分开的两个酶,(,甲基化酶和限制性内切酶,),来完成，其中甲基化酶由一条肽链构成，限制酶由相反方向结合的同源二聚体构成。,（,2,）识别序列,DNA,双链上的回文对称序列（旋转对称序列，反向重复序列），一般长,4-8bp,，与,DNA,的来源无关。,EcoR I,：,5-GAATTC-3,3-CTTAAG-5,EcoR V,EcoR I 5-GAATTC-3,3-CTTAAG-5,Pst I 5-CTGCA,G-3,3-G,ACGTC-5,产生粘性末端,EcoR V 5-GAT,ATC-3,3-CTA,TAG-5,产生平齐末端,（,3,）切割位点,识别位点处切开双链,DNA,，形成粘性末端（,sticky end,）或平末端（,blunt end,）。,几种,II,型限制性核酸内切酶的酶切位点,Pst,I,Provindencia stuartii,164,CTGCAG,GACGTC,Haemophilus influenzae,Rd,（,4,）粘性末端（,sticky ends,，,cohensive ends,）含有几个核苷酸单链的末端,分两种类型：,5,端凸出（如,EcoR I,切点）,G,AATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAA,G,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,EcoRI,等产生的5粘性末端,5,G-C-T,-,G,-,A,-,A,-,T,-,T,-,C,-,G-A-G 3,3,C-G-A,-,C,-,T,-,T,-,A,-,A,-,G,-,C-T-C 5,EcoRI 37,5,G-C-T,-,G,-,OH,P,-,A,-,A,-,T,-,T,-,C,-,G-A-G 3,3,C-G-A,-,C,-,T,-,T,-,A,-,A,-,P,OH,-,G,-,C-T-C 5,退火 4-7,5,G-C-T,-,G,A,-,A,-,T,-,T,-,C,-,G-A-G 3,3,C-G-A,-,C,-,T,-,T,-,A,-,A,G,-,C-T-C 5,OH,P,OH,P,Pst I,等产生的3粘性末端,5,G-C-T,-,C,-,T,-,G,-,C,-,A,-,G,-,G-A-G 3,3,C-G-A,-,G,-,A,-,C,-,G,-,T,-,C,-,C-T-C 5,PstI 37,5,G-C-T,-,C,-,T,-,G,-,C,-,A,-,OH,P,-,G,-,G-A-G 3,3,C-G-A-G,-,P,OH,-,A,-,C,-,G,-,T,-,C,-,C-T-C 5,退火 4-7,5,G-C-T,-,C,-,T,-,G,-,C,-,A,G,-,G-A-G 3,3,C-G-A,-,G,A,-,C,-,G,-,T,-,C,-,C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII,等产生的平头末端,5,G-C-T,-,C,-,A,-,G,-,C,-,T,-,G,-,G-A-G 3,3,C-G-A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C-T-C 5,PvuII 37,5,G-C-T,-,C,-,A,-,G,-,OH,P,-,C,-,T,-,G,-,G-A-G 3,3,C-G-A,-,G,-,T,-,C,-,P,OH,-,G,-,A,-,C,-,C-T-C 5,粘性末端促进连接便利,i,）不同的,DNA,双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接,。,ii,）同一个,DNA,分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,识别相同序列的限制性内切酶称同裂酶。,（,5,）同裂酶（,Isoschizomers),同序同切酶（完全同裂酶）：,识别位点和切点完全相同。,如,Hind,和,Hsu I,。,Hind 5-A,AGCTT-3,3-TTCGA,A-5,Hsu I 5-A,AGCTT-3,3-TTCGA,A-5,识别位点相同，但切点不同。,如,Xma I,和,Sma I,。,同序异切酶（不完全同裂酶）：,Xma I 5-C,CCGGG-3,3-GGGCC,C-5,Sma I 5-CCC,GGG-3,3-GGG,CCC-5,识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如,BamH I,、,Bgl,、,Bcl I,、,Xho,等,（,6,）同尾酶,(Isocaudamers,）,5-G,GATC,C-3,3-,CCTAG,G-5,BamH I,Bcl I,5-T,GATC,A-3,3-,ACTAG,T-5,5-,A,GATC,T-3,3-,TCTAG,A-5,Bgl,5-,U,GATC,Y-3,3-Y,CTAG,U-5,Xho,U,代表嘌呤；,Y,代表嘧啶。,5-,GATC,-3,3-,CTAG,-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。,5-G,3-C,CTAG,GATC,T,-3,A,-5,BamH I,Bgl,5-G,GATC,T,-3,3-C,CTAG,A,-5,BamH I,Bgl,Sau 3A,（,7,）,DNA,末端长度对限制酶切割的影响,Pst I,G,CTGCAG,C TGCA,CTGCAG,TGCA AA,CTGCAG,AACCAA,0 10 90,0 10 90,EcoR I,G,GAATTC,C CG,GAATTC,CG CCG,GAATTC,CGG,90 90 90,90 90,90,（,8,）酶切反应条件,缓冲液：,MgCl,2,、,NaCl/KCl,：提供,Mg,2+,和离子强度,Tris-HCl,：维持,pH,；,二硫苏糖醇（,DTT,）：保持酶稳定性；,牛血清白蛋白,BSA,等：有助于酶的稳定,反应温度：大多数为,37,反应时间：通常,1h,许多酶延长反应时间可减少酶量,终止酶切的方法：,a,、,10mM/LEDTA,b,、加热，大多数酶可用,65,温育,20,分钟失活,C,、苯酚抽提蛋白，然后用乙醇沉淀,DNA,一个酶单位（,U,）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为,37,）下，,50,L,反应体系中完全降解,1g DNA,所需要的酶量。,影响酶活性的因素很多，最重要的有：,A DNA,的纯度和甲基化程度,B,甘油的含量（不超过,5%,）,C,反应体系中的离子强度,D,反应体系的,pH,值,F,反应的温度条件（通常为,37,）,Buffer(10X)2.0,L,Water 16.5,L,DNA 1.0,L,Enzyme 0.5,L,Volume 20.0,L,酶单位的定义和影响酶活性的因素,酶 切 反 应 的 基 本 步 骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,CK,M,T,T,酶量的确定：,2-3,倍才能保证完全消化；,（,10,）双酶切反应,1,）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切,2,）对盐浓度要求不同的酶，也可采取同步双酶切：选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。,3,）如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。,3.III,类限制性内切酶（,1%,）,由,R,亚基和,MS,亚基二亚基组成双功能酶，其中,MS,亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。在切割位点下游,24-26bp,处，反应需要,ATP,、,Mg2+,和,SAM,（,S-,腺苷蛋氨酸）。,该类酶与,DNA,识别位点的结合严格依赖,ATP,。修饰作用和切割作用取决于两个亚基之间的竞争。修饰作用在识别位点内进行。切割序列位于识别位点一侧若干碱基对处，无序列特异性。在基因工程操作中用途不大。,EcoP15I,1973,年,H.O Smith,和,D.Nathans,提议的命名系统，命名原则如下：,三、限制性内切酶的命名,1.,用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成,3,个字母的略语表示寄主菌的物种名。,大肠杆菌（,E,scherichia,co,li,）用,Eco,表示；,流感嗜血菌（,H,aemophilus,in,fluenzae,）用,Hin,表示。,2.,用一个大写字母表示菌株或型。如,Ecok,EcoR,。,3.,如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如,EcoR I,，,EcoR V,。,限制性核酸内切酶的命名,四、影响限制性内切酶活性的因素,DNA,的纯度,DNA,中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、,SDS,、,EDTA,等都会影响酶的活性。,一般采取,纯化,DNA,，如用倍体积的冰冷乙醇沉淀,加大酶的用量,延长保温时间,扩大反应体积（,20,l,）,的甲基化程度,大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：,dam,甲基化酶（修饰,GATC,中的,A,）；,dcm,甲基化酶（修饰,CCA/TGG,的,C,）。,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株！,3.,温度,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是,37,o,C,，少数要求,40-65,o,C,。,酶,最适,温度,o,C,酶,最适,温度,o,C,酶,最适,温度,o,C,Apa I,Bcl I,Mae II,30,50,50,Apy I,BstE II,Mae III,30,60,55,Ban I,Mae I,Sma I,50,45,25,4.,缓冲液,(Buffer),是影响限制酶活性的重要因素。,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,缓冲液的化学组成,MgCl2,、,NaCl/KCl,：提供,Mg2+,和离子强度；,Tris-HCl,：维持,pH,；,二硫苏糖醇（,DTT,）：保持酶稳定性；,牛血清白蛋白,BSA,等：有助于酶的稳定；,第二节 基因工程中常用的,DNA,聚合酶,大肠杆菌,DNA,聚合酶,2.Klenow,片段,3.T4,噬菌体,DNA,聚合酶,4.T7,噬菌体,DNA,聚合酶,5.,反转录酶,6.,末端转移酶,共同特点,把,dNTPs,连续地加到引物的,3OH,端。,2.,主要区别,持续合成能力和外切酶活性不同。,如：,T7 DNA,聚合酶可以连续添加数千个,dNTPs,而不从模板上掉下来。其它几种,DNA,聚合酶只能连续添加,10,多个,dNTPs,就会从模板上解离下来。,常用的,DNA,聚合酶的特点,1.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,（,1,）大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,（,DNA Pol I,）的性质,一条多肽单链,5,3 DNA,聚合酶活性,5,3,外切酶活性，位于,N,端，用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉,N,端的,5,3,外切酶活性部分，就成为,Klenow fragment,3,5,外切酶活性。,底物：,dNTPs,（,dATP,、,dGTP,、,dCTP,、,dTTP,）,Mg2+,带有,3OH,游离端的引物,DNA,模板,（,2,）,DNA,聚合酶,I,的反应条件,-OH,5,3,dNTPs,5,G,-,C,-,T,-,C,-,A,-,G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,-,T 3,3,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,-,A,5,5,G,-,C,-,T,-,C A,-,G,-,C,-,T,-,G,-,G A,-,G,-,T 3,3,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,-,A,5,5,G,-,C,-,T,-,C,-,A-G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,-,T 3,3,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,-,A,5,（,3,）,DNA,聚合酶,I,基本用途：制备,32,P,标记的探针,DNAase I,DNA Pol I,Mg2+,5,dNTP,5,pp,p,dA（,a,-,32,P-dATP）,DNAase I,：,为一内切核酸酶，它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链,DNA,，形成单链切口,2.Klenow fragment,（,1,）,Klenow fragment,的性质,具有,5,3,聚合酶活性和,3,5,外切酶活性。（失去了,5,3,外切酶活性）。,DNA Pol I,Klenow fragment(76KD,）,枯草杆菌蛋白酶,3,端补平,补平限制性内切酶切后形成的,3,隐蔽端。,5,5,klenow,DNA 3,末端标记,在,3,隐蔽端加上放射性标记的,dNTP,。,klenow,（,2,）主要用途,3,隐蔽末端的,DNA,片断,Klenow fragment,补平,根据末端的顺序选择一种,-,32,P-dNTPs,末端标记的,DNA,限制性内切酶切,5-G3,3-CTTAA5,5-GAA3,3-CTTAA5,5-G,AA,TT3,3-CTTAA5,5-G3,3-CCTAG5,5-GG3,3-CCTAG5,5-GG,AT,C3,3-CCTAG5,EcoR I,BamH I,-,32,P-dATP,-,32,P-dGTP,25,o,C 1h,（,1,）,T4 DNA,聚合酶的性质,从,T4,噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。有,5,3,聚合酶活性和,3,5,外切酶活性（约为,Klenow,片段活性的,200,倍）。,3.T4 DNA,聚合酶,用,3,5,外切酶活性作用于末端制造出,3,隐蔽端。再利用它的,5,3,聚合酶活性补平，并加入放射性标记的,dNTP,。,5,5,3,3,5,5,3,3,T4 DNA,聚合酶,无,dNTPs,T4 DNA,聚合酶,有,dNTPs,5,5,当没有,dNTP,时，,T4DNA,聚合酶行使,3,5,外切酶功能，制造出,3,隐蔽端。,当有,dNTP,时，,T4DNA,聚合酶行使,5,3,聚合酶功能，填平,3,隐蔽端。,5.,逆转录酶,依赖,RNA,的,DNA,聚合酶（,RNA,指导的,DNA,聚合酶），,来源于,RNA,肿瘤病毒,最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（,avian myeloblastosis virus,AMV,）。作用：以,oligo dT,为引物（与,mRNA,的,polyA,尾巴互补结合），合成,cDNA,。,AAAAA,TTTTT,5,3,mRNA 5,cDNA,不需要模板的,DNA,聚合酶，随机掺入,dNTPs,5,p,3,HO,OH 3,p,5,末端转移酶,Mg2+dATP,5,p,3,HO,AAAAAAAAAAAA OH3,p,5,6.,末端转移酶,来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的,DNA,聚合酶。可在,cDNA,或载体的,3,末端加同聚物尾巴，便于克隆。,一、连接酶,1.,两种,DNA,连接酶,（,1,）大肠杆菌连接酶,:,只能连接粘性末端。,（,2,）,T4,噬菌体的连接酶,:,不但能连接粘性末端,还能连接齐平末端。,2.,连接条件,（,1,）必须是两条双链,DNA,。,（,2,）,DNA3,端有游离的,-OH,5,端有一个磷酸基团。,（,3,）需要能量,动物或噬菌体中：,ATP,大肠杆菌中,:NAD+,第三节 其它分子克隆工具酶,OH,P,3,、功能：,（,1,）修复,DNA,链上切口处的磷酸二酯键：,T4-DNA,连接酶,5,G,-,C,-,U,-,C,-,U,-,G,-,C,-,C,-,G,-,G,-,A,-,G,3,3,C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,nick,5,G,-,C,-,U,-,C,-,U,-,G,-,C,-,C,-,G,-,G,-,A,-,G,3,3,C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,（,2,）连接多个平头双链,DNA,分子：,5,G-C-T-C-A-G-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,3,3,C-G-A-G-T-C-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,5,5,G-C-T-C-A-G,-,OH,P,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,3,3,C-G-A-G-T-C,-,P,OH,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,5,T4-DNA,连接酶,4,、连接反应的温度,最佳温度：连接酶反应的最佳温度是,37,C,。,实用温度：在,37,下粘性末端的结合很不稳定，所以一般采用,416,C,。,插入片段与载体的浓度比例：,1020,倍（摩尔之比）,目的：增加插入片段与载体的接触机会，减少载,体自我连接的现象。,DNA,连接酶,DNA,连接酶的反应条件,Tris-HCl,MgCl2,10 mM,ATP,0.5-1 mM,DTT,5 mM,Volume,10-20 ul,4-15,4-16,hr,1,U DNA,连接酶的酶活性：在最佳反应条件下,16,反应 1 小时，完全连接 1,m,g,l,-DNA（Hind III,片段）所需的酶量,二、碱性磷酸酶,1.,碱性磷酸酶种类,从大肠杆菌中分离出来，具有抗热性。,Bacterial alkaline phosphatase,，,BAP,（,1,）细菌性碱性磷酸酶,（,2,）小牛肠碱性磷酸酶,Calf intestinal alkaline phosphatase,，,CIP,从小牛肠中纯化出来，,SDS,中加热,68,o,C,可完全失活。,2.,碱性磷酸酶的特性,催化脱掉,DNA,（或,RNA,）,5,端的磷酸根。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,碱性磷酸酶,3.,碱性磷酸酶的功能,（,1,）防止线性化的载体分子自我连接,单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。,AAGCTT,TTCGAA,Hind,酶切,A-OH,TTCGA-P,P-AGCTT,HO-A,碱性磷酸酶,5,5,5,A-OH,TTCGA-OH,HO-AGCTT,HO-A,OH,与,OH,不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。,但同一酶切后的外源,DNA,的,5,端有,P,，能与脱磷酸的载体,OH,连接。,A,TTCGA,AGCTT,A,AGCTT,A,A,TTCGA,连接酶,-OH,与,-OH,连不住,其中每条链上都有一个,nick,，但转入细菌后会被修复。,3,P-AGCTT,A-OH,5,3,HO-A,TTCGA-P,5,外源,DNA,四、核酸酶,1,、单链核酸外切酶：核酸外切酶,VII（ExoVII）,大肠杆菌的核酸外切酶,VII,不需要,Mg,2+,ExoVII,3,5,3,5,3,5,3,5,2,、双链核酸外切酶：核酸外切酶,III（ExoIII）,大肠杆菌的核酸外切酶,III,特异性地从3 端外切,ExoIII,3,5,3,5,Mg,2+,3,5,3,5,Exo,3,5,3,5,Mg,2+,3,、双链核酸外切酶：,核酸外切酶,（,Exo）,核酸外切酶特异性地从5 端外切,3,5,3,5,4,、单链核酸内切酶：,S1,核酸酶,S1,核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌,（,Aspergillus oryzae）,降解单链,DNA,的速度比降解双链,DNA,快75000倍,Zn2+,必需,最适,pH,需要,NaCl 10-300 mM,降解单链,DNA,的速度比降解单链,RNA,快7倍,一、载体的功能及特征,1,、定义：把目的基因通过运载工具送到受体细胞内，这种运载工具就叫载体（,vector),。,2,、载体的特征,1,）在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制起点）,2,）具有,多种单一,的核酸内切酶识别切割位点，供外源,DNA,片断插入，同时不影响复制,3,）有一定的选择标记，用于筛选,第四节 用于基因克隆的载体,3,、载体的种类,质粒载体（,plasmid,）,噬菌体载体（,phage,）,动物病毒（,virus,）,噬菌粒载体,考斯质粒（,cosmid,）,人造染色体（,artifical chromosome,）,二、质粒载体,质粒（,plasmid,）：独立于,染色体以外,的能,自主复制,的双链、共价、闭合、环状,DNA,分子,大小范围在,1kb-200kb,以上不等。,质粒,存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。,细菌的大质粒可含几百个基因，小质粒仅含,20,30,个基因。,致育质粒，,F,质粒（,fertility plasmid,），,编码有性生殖功能，带有,F,质粒的细菌为雄性菌，能长出性菌毛，无,F,质粒的细菌为雌性菌，无性菌毛。,耐药性质粒编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性，耐药性质粒分为二类，其中可以通过细菌间的接合进行传递的称接合性耐药质粒，又称,R,质粒,(resistance plasmid),。另一类是不能通过接合传递的非接合性耐药质粒，但它可通过噬菌体传递。,细菌粘附定植在肠粘膜表面是由,K,质粒决定的。,细菌素质粒,编码各种细菌产生细菌素，如,Col,质粒编码大肠杆菌素，对同品系或近缘的细菌具有抑制作用，实际是对产生细菌素细菌本身起保护作用。,代谢质粒,编码产生相关的代谢酶，如沙门菌发酵乳糖的能力通常是由质粒决定的。,细菌携带有哪种质粒，则有相应的功能，但也有某种质粒可同时决定几种功能，如,F,质粒除有致育性功能外，还能提供辅助质粒转移的能力，某些耐药性质粒上还带有编码毒力的基因，故带此种质粒的细菌，不仅获得了耐药性，而且致病性也得到了增强。,毒力质粒或,Vi,质粒（,virulence plasmid,）,编码与该菌致病性有关的毒力因子。,天然质粒用作载体的局限性,天然质 粒,相对分子质量,拷贝数,单一酶切位点,选择性标记,复制类型,pSC101,5.810,6,9.09 kb,13,EcoR I,tet,r,严紧,ColE1,4.210,6,20,EcoR I,大肠杆菌素,松弛,RSF2124,7.410,6,10,EcoR I(BamH I),amp,r,松弛,局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适,1.,质粒的空间构型：,共价闭合环状,DNA,（,C,ovalent,c,lose,c,ircular DNA,，,cccDNA,),，呈超螺旋（,s,uper,c,oil,，,SC,）,开环,DNA,（,open circular,，,ocDNA,），,一条链上有一至数个缺口。,线形,DNA,（,Linear,，,LDNA,）,DNA,超螺旋结构,质粒空间构型与电泳速率：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同，,scDNA,最快、,l DNA,次之、,ocDNA,最慢。,SC,OC,L,2,、质粒的基本性质,1,）质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的,DNA,复制系统进行自主复制。,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型。,严紧型质粒（,stringent plasmid,）,拷贝数少,，大约有,1-,几个拷贝。,松弛型质粒（,relaxed plasmid,）,拷贝数多,，有,1060,份拷贝。,2,）质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为,质粒的不相容性,，不相容性的质粒组成,不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1,、,pMB1,拥有相似的复制子结构，彼此不相容；,pSC101,、,F,、,RP4,拥有相似的复制子结构，彼此不相容。,质粒的不相容性分子机制：,两种含有,不同复制子结构,的不同质粒，在复制时各受,自己的拷贝数控制系统,的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定。因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。,两种含有,相似复制子结构,的不同质粒，在复制时受到,同一种拷贝数控制系统,的干扰，由于竞争作用致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。,质粒不亲和性,a,：在同一个细胞中含有两种不相容的质粒,b,：随着细胞的分裂质粒,分配到两个子细胞中去,c,：在下一次细胞分裂之前，质粒拷贝数加倍，但因为存在竞争，增加拷贝数不同,d,：两种不相容质粒拷贝数比例发生变化，最终产生出只含有一种类型质粒的子细胞,在大肠杆菌中的质粒，可以分为：,接合型质粒,:,能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），多为低拷贝的大质粒，含有完整的转移操纵子基因（,tra,）和转移起始位点。能在同种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移。,非接合型质粒,：不能在天然条件下独立地发生接合作用，多为高拷贝的小质粒，如大肠杆菌的,ColE1,、,RSF1010,等。由于缺少转移基因（,tra,），不能自主转移，但由于含有与,F,质粒类似的,bom,位点或诱动基因,mob,（,mobilization,），因而能被带有,tra,基因的转移性质粒诱动而发生转移。,3,）质粒的转移性,大肠杆菌接合（,conjunction,）,F,因子：又叫致育因子，在某些大肠杆菌中发现的一种最具代表性的单拷贝的接合型质粒，,94kb,，总共编码,19,个转移基因（,tra,），以三种形式存在。,3,、质粒上的标记基因,野生型的质粒,DNA,上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，但是,对,DNA,重组分子的筛选具有重要意义,包括：,物质抗性：,抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成：,细菌毒素、天然色素、有机碱,标记基因用途：,1,）选择标记基因：,鉴别目的,DNA,（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。,2,）筛选标记基因：,用于将携带了外源,DNA,片断的重组子挑选出来。,4、质粒的命名,用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。,如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。,5,、质粒载体的种类,1,）克隆,质粒,载体（,cloning vector,）：,主要用于扩增或保存,DNA,片断，其上有复制子，最好是松弛型高拷贝；,2,）表达,质粒,载体（,expression vector,）：,能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，,更要有强启动子,；,3,）穿梭,质粒,载体（,shuttle vector,）：,装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆。,这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。,1,）克隆,质粒,载体,天然存在的野生型质粒由于,分子量大,、,拷贝数低,、,单一酶切位点,少、,遗传标记不理想,等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：,pSC101,8.8 kb,拷贝数,5,、四环素抗性标记基因,Tet,r,ColE1,6.5 kb,拷贝数,20 30,、大肠杆菌内毒素标记基因,E1,RSF2124,ColE1,衍生质粒、氨苄青霉素抗性标记基因,Amp,r,组成,:,它由三部分组成：,来自,pSCl01,的四环素抗性基因,Tet,r,来自,RSF2124,的氨苄青霉素抗性基因,Amp,r,。,来自,ColEl,的衍生物,pMBl,的松弛复制起点,ori,常用质粒克隆载体：,pBR322,，,4376bp,pBR322,质粒载体的结构来源,特点,:,具有多个单一的限制性内切酶位点。,Tet,r,中有,BamH1,切点（,GGATCC,）和,Sal,切点（,GAATTC,），,Amp,r,中有,Pst,切点（,CTGCAG,）。,利用,ColEl,的复制子，所以在细胞中是多拷贝的。,重组克隆的“,插入失活,”筛选方法,外源基因插入在,Tet,r,中，基因型为,Tet,s,Amp,r,；,外源基因插入在,Amp,r,中，基因型为,Tet,r,Amp,r,；,Tet,r,：在含有四环素培养基可生长；,Tet,s,：在含四环素培养基上不生长；,Amp,r,：在含有氨卞青霉素培养基上不生长；,Amp,s,：在含有氨卞青霉素培养基上可生长；,而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。,这种在一个基因位点中插入外源,DNA,片段，从而使该基因活性丧失的现象叫,插入失活,（,insertional inactivation,）,。,pBR322,质粒载体,tet,r,基因插入失活效应,常用质粒克隆载体：,pUC,系列,pUC18/19,特点：,具有更小的分子量（,2686bp,）和更高的拷贝数（,500-700,个）。,具有多克隆位点，很方便插入外源基因,含有氨苄青霉素抗性基因,可用,-,互补,方法鉴别,(,含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的,LacZ,基因,),b,pUC18,/19：,正选择标记,lacZ,的显色原理,5-,溴-4-氯-3-吲哚基-,b-D-,半乳糖苷,X-gal,-,半乳糖苷酶的,-,肽段,lacZ,MCS,Plac,突变型,溴氯吲哚,LacZ:,大肠杆菌的编码,-,半乳糖苷酶基因，编码,1024,个氨基酸，切断乳糖的半乳糖苷键产生半乳糖和葡萄糖,LacZ:,编码,-,半乳糖苷酶,N,端,146,个氨基酸，这个编码区中插入了一个,MCS,，但它并不破坏读框，但是，若在该,DNA,小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无,-,互补能力的,-,半乳糖苷酶片段,X-gal,：,5-,溴-4-氯-3-吲哚基-,b-D-,半乳糖苷,，,也是,-,半乳糖苷酶的一种生色底物，经降解后可生成溴氯吲哚，呈蓝色，也使大肠杆菌菌落从白色转变为蓝色,-,互补,(Alpha complementation),：质粒中插入,lac Z,基因，编码,N,端,146,个氨基酸残基（,-,半乳糖苷酶的,片段）。突变型,lac-E.coli,可表达该酶的,片段（酶的,C,端）。单独存在的,及,片段均无,半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有,半乳糖苷酶活性，使,底物,X-gal,特异性变为蓝色化合物，这就是所谓的,-,互补。,Blue White,（,2,）表达质粒,1,）大肠杆菌中的表达质粒,包括启动子、操纵位点序列、多克隆位点、转录及翻译信号、质粒复制起点及筛选标记等,2,）真核表达质粒,酵母表达质粒,昆虫表达质粒,哺乳动物细胞表达质粒,1,）大肠杆菌中的表达质粒,启动子（,promoter,）：,是与基因表达启动相关的顺式作用元件，与,RNA,聚合酶特异结合，是基因转录的起始部位，分为两类：一类是,RNA,聚合酶能够直接识别的，另一类在与,RNA,聚合酶结合时需要蛋白质辅助因子存在。,序列特点：,上游有,-10,，共同序列,TATAAT,（,Pribnow box,）；,上游有,-35,，共同序列,TTGACA,Lac,启动子（,P,lac,）：中等强度启动子，一般带有,lacZ,基因片段，实现,-,互补。,噬菌体左臂（,P,L,),和右臂启动子（,P,R,),：是,噬菌体早期左臂和右臂转录控制区，启动效率高，广泛使用的原核生物启动子。,Trp,启动子（,P,trp,）：是强启动子，来源于大肠杆菌色氨酸操纵子，在富含,trp,的培养基中处于关闭状态，当,trp,水平下降，,P,trp,开始转录。,T7,启动子（,P,T7,）：来自于,T7,噬菌体晚期转录基因启动子，只能由,T7,聚合酶识别（其转录活性是大肠杆菌聚合酶,6,倍，因此,P,T7,转录活性高。,lac,操纵元结构,调节序列,结构基因,操纵子：以乳糖操纵子为例来说明,异丙基硫代半乳糖苷,(isopropylthiogalactoside,IPTG),就是其中一种很强的诱导剂，不被细胞代谢而十分稳定。,核糖体结合位点（,ribosome binding site,，,RBS,）：,大肠杆菌中翻译起始时，首先是核糖体,30S,小亚基识别并结合至,mRNA5,端的翻译起始部位，该部位就是,RBS,。,RBS,包括起始密码子,ATG,序列及其上游,SD,序列。,SD,序列：,ATG,上游,311,碱基处的保守序列,AGGAG,，可与小亚基中,16S rRNA 3,端富含嘧啶序列互补结合，,mRNA,必须有这一序列才能进入核糖体。,转录终止区（,terminator,）：,是,DNA,分子中决定,RNA,聚合酶终止转录的一段回文核苷酸序列。分为两类：不依赖,因子的终止子的回文序列中富含,GC,碱基对，在回文序列的下游方向又常有,6,8,个,AT,碱基对；而依赖,因子终止子中回文序列的,GC,对含量较少。在回文序