基因工程载体构建蛋白表达.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程载体构建蛋白表达,载体构建与蛋白表达,原核表达载体构建,真核,表达载体构建,提高蛋白表达的途径,真核细胞与原核细胞的比较,特征,原核细胞 真核细胞,细胞膜,有（行使多种功能）有,核膜,无,有,染色体,裸露,DNA,，无组蛋白,DNA,与组蛋白结合,核外,DNA,含有质粒,DNA,线粒体与叶绿体,DNA,胞质区域化,简单（无细胞器）复杂有各种细胞器,细胞骨架,无 有（,MT,、,MF,、,IF,）,核糖体,70,S,型（,30,S,和,50,S,）,80,S,型（,40,S,和,60,S,）,细胞增殖,无丝分裂 有丝分裂、减数分裂,原核细胞与真核细胞的区别,原核表达与真核表达的区别,原核基因表达以操纵子形式进行,转录和翻译几乎同时进行,真核转录在核内进行，先形成,hnRNA,再加工剔除内含子，外显子相连，,5,端加帽，,3,端加,poly A,尾巴。,翻译在胞浆的核糖体上进行,乳糖操纵子学说,(,原核基因的表达调控,),真核细胞的复制、转录、翻译,mRNA,剪切,利用受体菌蛋白的特异性抗体、配体或底物亲和层析等技术，较容易地分离融合蛋白，然后通过蛋白酶水解，特异性裂解外源目的蛋白与受体菌蛋白之间的肽键，最终得到外源目的蛋白。,信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部氨基酸为疏水性氨基酸。,分泌信号序列-引导分泌蛋白从胞内到胞外，并对蛋白质翻译后加工起作用。,The promoter of AOX1 can be activated strongly by carbinal.,据悉UAAU为有效终止密码子。,（一）高效表达外源基因的基本策略,-表达中等外源蛋白。,DNA复制及重组载体的选择系统,巴斯德毕赤酵母表达系统的优点,真核细胞与原核细胞的比较,外源基因的高表达产物在原核细胞中积累，并致密地聚集在一起形成的一种不溶性蛋白质结构。,34%YNB,410-5生物素，2%葡萄糖，1.,组成型启动子：T7噬菌体启动子,无 有（MT、MF、IF）,每个表达单元都含有独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码。,二、常见的原核细胞表达载体系统,待整合的外源基因两侧必须带一段与染色体完全同源的的序列。,第一节 外源目的基因在原核细胞中的表达,原核基因表达载体的构成,常见的原核细胞表达载体系统,外源目的基因在原核细胞中的表达形式,在原核细胞中高效表达目的基因,一、原核基因表达载体的构成,DNA,复制及重组载体的选择系统,复制子,:,扩增,选择标记：筛选,外源基因的转录系统,启动子,抑制物基因,转录终止子,蛋白质的翻译系统,核糖体结合位点,翻译起始密码子,翻译终止密码子,启动子,多克隆位点,终止子,ATG,TAA,目的基因,DNA,复制起始位点,耐药性基因,阻遏物基因,表达载体,pBR322old-style general purpose plasmid,4362 bp,DNA,复制及重组载体的选择系统,复制子,：包含复制起始位点（,ori),和有关序列在内的,DNA,片段。,常见复制子有,pMB1,p15A,Col E1,和,pSC101,等。,前,3,者为松弛复制型，含,pSC101,复制子的质粒载体严谨复制型。,选择标记,：抗生素抗性基因,外源基因的转录系统,启动子,:,能被宿主,RNA,聚合酶特异识别和结合并指导目的基因转录的,DNA,序列。启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用的位置特性和种属特异性。,诱导型启动子：,Lac,、,Trp,、,Tac,等,组成型启动子：,T7,噬菌体启动子,抑制物基因,:,其产物是控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。适当的诱导条件可使拟制物失活，启动子功能恢复。,转录终止子：,终止,RNA,聚合酶转录的,DNA,序列。,本正终止子：不需要其他蛋白辅助因子，,依赖终止信号的终止子：依赖专一蛋白辅助因子（如,因子）,防止转录过头,3,）蛋白质的翻译系统,影响翻译起始的因素：起始密码子、核糖体结合位点,(SD,序列,),、起始密码与,SD,序列之间的距离和碱基组成、,mRNA,的二级结构、,mRNA,上游的,5,端非翻译序列和蛋白编码区的,5,端序列,核糖体结合位点,翻译起始密码子,翻译终止密码子,核糖体结合位点,：原核生物转录起始位点,(RBS),下游的一段,DNA,序列，,由,SD,序列和起始密码子组成,。,SD,序列大约,3-9bp,位于,ATG,上游,3-11bp,处。,SD,序列可与核糖体,16S rRNA,特异配对而与宿主核糖体结合。大肠杆菌,SD,序列为,5,A,GGAG,G3,，其中,GGAG 4,碱基发生任何改变均大幅度降低翻译效率。,翻译起始密码子：,一般为,ATG(AUG),编码甲硫氨酸,(Met),也有采用其他密码子。,影响翻译效率的因素有,：,SD,序列、翻译起始密码子、,SD,序列和翻译起始密码子之间的距离和碱基组成等。据报道，,SD,序列后面为,AAAA,或,UUUU,时，翻译起始效率最高，而当为,CCCC,或,GGGG,时效率最低。,翻译终止密码子,：它核糖体相遇时，能使核糖体从,mRNA,模板上脱落，终止翻译过程。大肠杆菌中多肽链的释放由释放因子,RF1,和,RF2,调控。,RF1,识别,UAA,和,UAG,RF2,识别,UAA,和,UGA,，故选,UAA,作终止密码子。可将几个终止密码子串联。据悉,UAAU,为有效终止密码子。,二、常见的原核细胞表达载体系统,P,lac,启动子表达系统,P,L,和,P,R,启动子表达载体系统,T7,噬菌体启动子表达载体系统,三、外源基因在原核细胞中的表达形式,包涵体,融合蛋白,寡聚型外源蛋白,分泌型外源蛋白,（一）包涵体,外源基因的高表达产物在原核细胞中积累，并致密地聚集在一起形成的一种不溶性蛋白质结构。或许也有一些受体细胞本身的蛋白质。,包涵体具有正确的氨基酸序列，但空间构象错误，故没有生物学活性。,需要复性,（二）融合蛋白,定义,：将外源目的蛋白的基因与受体菌自身蛋白基因重组，但不改变两个基因的阅读框而表达出的蛋白。,外源基因,宿主基因,融合蛋白的特点,1.,稳定性好,单独的外源蛋白尤其是小分子蛋白，很容易被原核细胞中的蛋白水解酶所降解。,融合蛋白中，外源蛋白在菌体自身蛋白的引导下，能正确折叠，形成杂合构象，封闭了暴露在分子表面的蛋白酶切割位点。,融合蛋白的特点,2.,表达效率较高,转录和翻译由宿主菌的固有设施控制。,3.,易于分离纯化,利用受体菌蛋白的特异性抗体、配体或底物亲和层析等技术，较容易地分离融合蛋白，然后通过蛋白酶水解，特异性裂解外源目的蛋白与受体菌蛋白之间的肽键，最终得到外源目的蛋白。,（三）寡聚型的外源蛋白,多,个外源蛋白基因串联,多表达单元的重组,多顺反子重组,多编码序列重组,多表达单元的重组,：,每个表达单元都含有独立的启动子、终止子、,SD,序列、起始密码和终止密码。,-,表达分子量较大的蛋白，,不需要裂解处理。,启动子相互竞争,A,B,C,Promoter,SD,SD,SD,多顺反子重组,：,多拷贝的外源基因有各自的,SD,序列、翻译起始和终止密码，但转录在共同的转录启动子和终止子下进行。,-,表达中等外源蛋白。,A,B,C,Promoter,SD,SD,SD,多编码序列重组,：,多个基因串联，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。,A,B,C,Promoter,蛋白酶切位点,(,四,),整合型外源蛋白,将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区，使之成为染色体结构的一部分，而稳定遗传,本质为,DNA,同源交换。,待整合的外源基因两侧必须带一段与染色体完全同源的的序列。同时将可控的表达元件和选择性标记基因连接在一起。,一般选择不能自主复制的质粒或温度敏感型质粒。,（五）分泌型外源蛋白,通过运输或分泌方式穿越细胞外膜进入培养基。,需在,N,端加,15-30,个氨基酸组成的,信号肽序列,。信号肽,N,端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部氨基酸为疏水性氨基酸。当蛋白分泌到大肠杆菌细胞内外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶切割。,分泌型表达的优点,能使蛋白正确折叠,分泌到胞外周质的蛋白较稳定，不易被胞内的蛋白酶降解，不含氨基端甲硫氨酸（,Met),。,简化了发酵后处理工艺。,缺点：表达量不高，有时信号肽不被切割或切割不当。,四、在原核细胞中高效表达目的基因,（一）高效表达外源基因的基本策略,（二）目的基因表达水平的提高与检测,（一）高效表达外源基因的基本策略,载体构建的优化,选用强启动子、强终止子,使,SD,序列与核糖体,16S rRNA,的碱基完全配对,调整,SD,序列与起始密码,ATG,之间的距离,防止核糖体结合位点附近序列转录后的,mRNA,形成二级结构,提高稀有密码子的表达频率,通过点突变方法改造外源基因的稀有密码,构建基因高表达受体菌,大肠杆菌缺乏翻译后加工和蛋白质折叠系统,提高外源基因表达产物的稳定性,提高外源基因表达产物的稳定性,采用分泌型表达系统,表达为融合蛋白,构建包涵体表达系统,选用蛋白酶缺陷型菌株作为受体菌,外源蛋白中对水解酶敏感的序列进行修饰和改造,（二）目的基因表达水平的提高与检测,采用定点诱变技术，使核糖体结合位点,(SD,序列，起始密码子,ATG),的周围碱基发生改变，去除该区域的二级结构，以便提高基因表达水平。,利用不同表达水平的宿主菌株,在目的基因,DNA,下游接一段,DNA,序列，可以稳定,mRNA,从而提高翻译效果。,通过改变温度、核糖体结合位点、启动子强度、质粒拷贝数或诱导物的量,目的基因表达产物的检测,SDS-PAGE,和放射自显影,第二节 外源目的基因在真核细胞中的表达,真核表达载体的功能元件,酵母表达系统,真核表达载体的功能元件,启动子元件,增强子元件,加,Poly(A),信号,剪接信号,与翻译相关的元件,增强子元件,增强子：能够增强启动子转录活性的,DNA,序列。可以在转录起始位点上游或与启动子相距较远的位置上起作用。,可以将几个增强子串联使用，从而大幅度提高启动子的转录水平。,二、酵母表达系统,酵母基因表达载体的组成元件,酵母基因表达载体的类型,表达外源基因的酵母宿主菌,酵母基因表达载体的组成元件,DNA,复制起始序列,选择（筛选）标记,启动子,分泌信号序列,终止子,有丝分裂稳定区,启动子,长度约,1-2kb,。其上游有各种调控序列，例如上游激活序列、上游阻遏序列、组成型启动子序列等。启动子下游有转录起始位点和,TATA,序列。,TATA,序列可被转录因子蛋白识别、结合并形成转录起始复合物。,强启动子：酵母磷酸甘油酯激酶,(PGK),、甘油醛磷酸脱氢酶,(GAPDH),基因启动子等,分泌信号序列,分泌信号序列,-,引导分泌蛋白从胞内到胞外，并对蛋白质翻译后加工起作用。,有,-,因子前导肽序列，蔗糖酶信号肽序列，酸性磷酸酯酶信号肽序列等。其中酿酒酵母,-,因子,prepro,信号序列最经典,。,理论上，可将外源基因与其天然信号序列、酿酒酵母,-,因子前导肽或毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽等任意一种结合共阅读框融合，构建分泌型表达质粒。,酵母基因表达载体的类型,自主复制型质粒载体,整合型质粒载体,着丝粒型质粒载体,酵母人工染色体,表达外源基因的酵母宿主菌,酿酒酵母,高密度培养产生乙醇积累，限制了酵母的继续生长和蛋白分泌,巴斯德毕赤酵母,甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基因的高效表达，如,AOX1,的表达产物可在细胞中高水平积累。,Yeast Expression System,30 years ago,Koichi Ogata discovered some yeast could live using carbinal as sole carbon source.,The promoter of,AOX1,can be activated strongly by carbinal.Whereas that of AOX2 can only be weekly elicited.So,the former was employed widely in lab research and industrial scale up.,SDS-PAGE和放射自显影,需在N端加15-30个氨基酸组成的信号肽序列。,Expression Vectors,酵母基因表达载体的类型,一、原核基因表达载体的构成,多个基因串联，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。,Plac启动子表达系统,表达外源基因的酵母宿主菌,有（行使多种功能）有,巴斯德毕赤酵母表达系统的优点,多个基因串联，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。,据悉UAAU为有效终止密码子。,以,AOX1,为启动子，以,AOX1,基因缺失突变体为受体细胞，可高效表达外源基因。,或用组氨酸脱氢酶突变体作为受体细胞，从而对携带,his,标记基因的转化子进行筛选。,还有蛋白酶缺陷宿主菌,巴斯德毕赤酵母表达系统的优点,优点,：,与酿酒酵母相比，产酒精较少,适合高密度培养,由于培养基,pH,较低并含有甲醇，不易污染,分泌外源蛋白能力较强，而自身蛋白较少，故易于纯化,缺点,：,氧气的成本,先培养，后诱导的两个步骤,Expression Vectors,pPIC3.5:,毕赤胞内表达,pPIC3.6K:,毕赤胞内表达，,kanamycin,抗性，用,G418,筛选外源基因多拷贝转化子,pPIC9,：毕赤分泌表达，采用,因子信号肽序列,pPIC9K,：毕赤分泌表达，采用,因子信号肽序列,kanamycin,抗性，用,G418,筛选外源基因多拷贝转化子,宿主菌与转化方法,GS115,Electroporation(,电转化,),培养基,YPD:1%Yeast extract;2%peptone;2%D-Glucose,用于,GS115(his4),的培养,MD,平板：,1.34%YNB,410,-5,生物素,，,2%,葡萄糖，,1.5%,琼脂粉，,用于,His,+,转化子筛选,MGY,培养基：,1.34%YNB,410,-5,生物素，,5%,甘油，,1%,酵母提取物，,2%,蛋白胨，,用于酵母生物量的积累,MM,培养基,:1.34%YNB,410,-5,生物素，,0.5%,甲醇，,用于外源蛋白诱导表达,Flowsheet of yeast expression system,重组质粒用限制酶线性化,电转化,MD,平板筛选,His,+,转化子,以,5,AOX,和,3,AOX,引物进行,PCR,验证,MGY,培养基摇菌,MM,培养基，甲醇诱导,SDS-PAGE,感谢观看,