(2)第2章-基因工程(1-3).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,克隆的本意,是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体（植物界,试管植物；微生物,分裂增殖；动物界,孙悟空）。,克隆,吊兰，它能在每个嫩芽处都可长出一个新个体，这就是最自然的“克隆”现象。,自然界许多植物可以通过插条来实现个体繁殖。,无心插柳柳成荫,分子克隆,分子克隆基因克隆DNA重组DNA克隆,第,一,节 DNA重组的基本过程,目的基因的分离,选择合适的载体并进行,DNA,重组，获得重组,DNA,（酶切、连接）,将重组,DNA,导入宿主细胞（转化）,鉴定带有目的基因的克隆，检测目的基因的表达产物（检测）,人工基因合成法,2 cDNA法：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA单链，再通过DNA聚合酶I的作用，合成cDNA。或建立cDNA文库，再从中筛选目的基因。,3 化学合成法：多用于合成短的DNA片段,4 PCR法：已知DNA序列，根据序列设计引物用PCR直接扩增出相应的目的片段。,DNA合成仪,PCR扩增仪,2 目的基因与载体结合,用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成,重组子,。,提取质粒并用限制酶切割,用连接酶将目的基因和质粒连接,3 转化受体细胞并扩增,基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。,导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或者病毒侵染细胞的途径。通常还要对一些受体细胞进行增大通透性的处理（,感受态,）。,目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。,将目的基因导入受体细胞,将受体细胞进行扩增,重组DNA导入受体细胞的途径,一、外源DNA转化法,DNA直接导入宿主细胞,转化,（transformation）,转染(transfection),二、病毒（噬菌体）颗粒转导法,组装成病毒(噬菌体）颗粒后再感染细胞,外源DNA转化法,1、直接转化法,2、高分子化合物诱导转化法,3、电穿孔转化法,4、微弹轰击转化法,5、激光微束穿孔转化法,6、超声波处理转化法,7、脂质体介导转化法,8、体内注射转化法,9、花粉管通道转化法,10、精子介导法,11、磷酸钙转染法,（1）筛选标记基因,各种抗药性基因，如amp,r,、ter,r,、kan,r,等,（2）PCR,提取重组质粒DNA，用已知的特异引物扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测有无目的条带；,4 重组子的鉴定,（3）酶切,提取质粒DNA,，,用相应的内切酶酶切后电泳，根据电泳条带的数目、分子量大小分析确定；,（4）核酸杂交,用已知的特异DNA探针（probe）与变性重组质粒DNA杂交。有菌落杂交(colony hybridization);斑点杂交(dot blot);印记杂交（Southern blot）。,（5）测序,重组克隆载体pMD18-T-RIP双酶切电泳图,重组农杆菌PCR电泳图,表达产物的筛选与鉴定,遗传互补法使用受体菌是营养缺陷型,培养基是基础培养基,当目的基因在受体菌内表达时,受体菌的营养缺陷被纠正,因而在基础培养基上能生长.,免疫化学法该方法是用已知的抗体检查克隆菌株目的基因表达的蛋白抗原。如Western blot：提取克隆菌株菌体蛋白SDS-PAGE转印NC膜特异抗体酶标抗抗体 酶底物观察特异显色带。,小 结,基因工程的基本内容,基因操作,的基本步骤,基因操作,的工具,限制性内切酶,DNA连接酶,载体,目的基因与载体的重组,目的基因的检测和表达,将重组子导入受体细胞,第二节 基因工程常用的工具酶,在,生物工程中常用的各种工具酶指的是能用于,DNA,和,RNA,分子的切割、连接、聚合、反转录、修饰等有关的各种酶系。,1 核酸内切酶,2 DNA,连接酶,3,DNA,聚合酶,4,反转录酶（逆转录酶）,常 用 的 工 具 酶,工 具 酶 名 称 主 要 功 能,限制性内切核酸酶,在,DNA,分子内部的特异性的,restriction endonucleases,碱基序列内部进行切割,DNA,连接酶,将两条以上的线性,DNA,分子或片段,DNA ligase,催化形成磷酸二酯键连接成一个整体,DNA,聚合酶,I,通过向3端逐一增加核苷酸以填补双链,DNA,分子上的单链,DNA polymerase I,裂口，即5,3,DNA,聚合酶活性,与35及,5,3外切酶活性,多核苷酸激酶 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的,DNA polymerase kinease 5OH,末端上,反转录酶,以,RNA,为模板合成互补的,cDNA,链,reverse transcriptase,DNA,末端转移酶 将多聚物尾巴加到了线性双链,DNA terminal Deoxynuc,或单链,DNA,分子的3,OH,末端或,DNA,的3末端标,NTP,leatidy transferase,工 具 酶 名 称 主 要 功 能,碱性磷酸酶 去除,DNA,RNA,dNTP,的5磷酸基团,BAP orCIP,核酸外切酶,III,降解,DNA3OH,末端的核苷酸残基,exonuclease III,Taq,DNA,聚合酶,能在高温（72,）下,以,单链,DNA,为模板，,Taq,DNA polymerase,从5,3方向合成新生的互补链,核糖核酸酶 专一性降解,RNA,RNase,脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，水解单链或双链,DNA,DNase,常 用 的 工 具 酶 (,续,上,表,格),1 限制性内切酶（restriction endonuclease),指能专一地识别DNA分子上特定的碱基序列，并在该序列中进行切割的内切酶。,按限制性核酸内切酶的分解模式，分为三类,I,型,(,有识别位点,切割长短不一而无特异性),II,型,(,切后,IIa,含粘性末端；,IIb,为平末端),III,型,(,识别序列不对称，酶切位点不在识别位点上),均有特异性识别序列,识别的核苷酸序列一般在48个碱基对，多数为6个,大多数识别序列具有180度旋转对称的回文结构形式(palindromic sequence)，如,Bam,H I 酶的识别序列：,-GGATCC-,-CCTAGG-；,II,型,限制性内切酶的识别序列特点,回文序列,回文：原意指指顺读和倒读都一样的词语。,清代女诗人吴绛雪的四季回文诗,春：莺啼岸柳弄春晴，夜月明。莺啼岸柳弄春晴，柳弄春晴夜月明。明月夜晴春弄柳，晴春弄柳岸啼莺。夏：香莲碧水动风凉，夏日长。香莲碧水动风凉，水动风凉夏日长。长日夏凉风动水，凉风动水碧莲香。秋：秋江楚雁宿沙洲，浅水流。秋江楚雁宿沙洲，雁宿沙洲浅水流。流水浅洲沙宿雁，洲沙宿雁楚江秋。冬：红炉透炭炙寒风，御隆冬。红炉透炭炙寒风，炭炙寒风御隆冬。冬隆御风寒炙炭，风寒炙炭透炉红。,回文序列,反向对称,镜像对称,回文序列,双链中，如果两条互补链分开，每条链上的互补序列都有机会发生碱基配对而形成一个发夹,II,型限制性内切酶的切割方式,三种切割方式：,按切割位点相对于二重对称轴的位置来区分,一种是在对称轴5侧切割产生5粘端，,5-,NG,AATTCN-3,Eco,RI,5-NG AATTGN-3,3-NCTTAA,GN-5 3-NCTTAA CN-5 5,粘端,另一种是在对称轴的3侧切割产生3粘端，,5-,NCTGCA,GN-3,Pst,I,5-NCTGCA CN-3,3-NG,ACGTCN-5 3-NG ACGTCN-5 3,粘端,第三种切割方式是在对称轴处切割，就产生平末端,5-,NCCC,GGGN-3,Sma,I,5-NCCC GGGN-3,3-NGGG,CCCN-5 3-NGGG CCCN-5,+,+,+,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。,多克隆位点,一段序列上分布着多个单酶切位点，则这一段序列称为,多克隆位点,常见于各种基因工程载体中，以方便外源序列的插入,多克隆位点,2 DNA连接酶,催化DNA分子中5磷酸基与3羟基间形成磷酸二酯键的酶,需要ATP或NAD（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为辅助因子,底物的连接效率：,带缺刻的DNA 粘末端DNA 平末端DNA,连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键,来源：,大肠杆菌，以NAD为能源,T4噬菌体，以ATP为能源，可进行平末端DNA片段的连接，应用较广，最佳反应温度415（T4 DNA连接酶）,DNA连接酶的作用过程,3 DNA聚合酶,作用：在,DNA,模板链上将脱氧核苷酸连续地加到双链,DNA,分子引物链的3,OH,末端，催化核苷酸聚合成以模板互补的,DNA,序列,常用的,DNA,聚合酶：大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,、,Klenow,酶,、,T4DNA,聚合酶,、,T7DNA,聚合酶、,TaqDNA,聚合酶及反转录酶等。,共同特点：这些聚合酶的共同特点是具有催化核苷酸聚合能力，但在外切酶活性，聚合速率等方面就各有差别,Taq,DNA,聚合酶,（,Taq,DNA polymerase）,分离,：,从,耐,热的细菌,（,T.aquaticus,）,中,分离而来,酶活性,：,具有5 3聚合酶活性,、,依赖于,聚合作用的外切酶活性,耐热性,：,耐热的依赖于,DNA,的,DNA,聚合酶，最适反应温度为7280,应用性：,能以,高温变性后,的ss,DNA,为模板,，,以,四种,dNTP,为,底物,，以,分别结合在两端,扩增区,引物,为,起点,从53的,方向合成,新的,互补,链,DNA,主要用途,：,用于,PCR,在,体外进行扩增,DNA,4 反转录酶,（reverse transcriptase）,来源：逆转录病毒,作用：以RNA为模板催化合成DNA的反应，产物为cDNA,酶活性：5 3的DNA聚合酶活性，能以RNA为模板合成DNA；具RNA酶H活性，即核糖核酸外切酶活性，以3 5或5 3方向特异降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链,第三节 基因工程的常用载体,概念,：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制和功能基因表达调控系统的工具。,化学本质是DNA,功能,1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件,载体在基因工程中的必要性,目的外源DNA很难进入受体细胞,目的外源DNA一般不带复制子系统,目的外源DNA一般不具备表达的调控系统,载体应具备的条件,1.,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（,可转移性,）,2.具有与特定受体细胞相适应的,复制位点,或整合位点3.,分子量尽可能小,，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点（,多克隆位点,）5.具有合适的,选择性标记,自我复制表达，外源基因的插入不影响其功能的发挥，易于从宿主细胞分离出来,目的基因能否有效导入受体，并在其中高效表达，很大程度上取决于所用的载体。,按作用分：克隆载体(cloning vector),表达载体(expression vector)（原核、真核；胞内、分泌）,按来源分：,质粒载体,噬菌体载体,动物病毒载体,人工染色体载体,克隆载体,(cloning vector),用于在受体细胞中进行,目的基因扩增,的载体；,主要由质粒、cosmid质粒、噬菌体DNA、及真核生物病毒的DNA重组构建；,在实际的研究工作中，质粒最常用作克隆载体,天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实际应用的都是人工构建的质粒，常用载体pBR322、pUC 系列。,克隆载体的基本特点,(1)有,复制起点,（即本身为复制子），在宿主细胞中能自主复制；(2)具,多克隆位点,，允许外源基因插入后随载体分子一同进行复制；(3)必须有12个,筛选标记,，以赋予寄主细胞新的特性，便于重组子的筛选；(4),安全,；,（5）,分子量小,（质粒15kb时，将外源DNA转入E.coli的效率会大大降低），拷贝数多，易操作。,pBR322和pUC18克隆载体,pBR322,质粒载体 pBR322是一个使用非常广泛的质粒载体，但它带的多克隆位点较少，筛选程序较麻烦。,pUC18-T,pUC19克隆载体,筛选方法：培养基中加入IPTG、氨苄青霉素、X-gal，若菌落颜色为蓝色，表明未整合，若为白色，说明整合了目的DNA。,表达载体,(expression vector),目的基因在宿主细胞中得以表达,的载体；,可将目的基因导入适合的受体细胞，使之能够复制、转录和翻译；,针对不同的表达体系，须构建不同的表达载体,表达载体的基本特点,启动子、核糖体结合位点、转录、翻译的终止序列,筛选标记基因,多克隆位点,pET-28a原核表达载体,真核表达载体至少含两类序列,原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。,在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等,pCAMBIA 1300 植物表达载体,穿梭载体,(shuttle vector),又称双功能载体(bifunctional vector)。能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体,具有细菌质粒的复制原点和真核生物的自主复制原点，即既能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达,主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达。,柯斯质粒,（Cosmid),柯斯质粒可克隆携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点。,可以用于克隆大片段的外源DNA片段，用于构建基因组文库。,YAC载体,YAC载体是酵母人工染色体的缩写,真核生物的染色体有几个部分是最为关键的，一是着丝粒（CEN），它主管染色体在细胞分裂过程中正确地分配到各子细胞中；二是端粒（TEL）位于染色体的末端，他们对于染色体末端以及防止染色体被核酸外切酶切断具有重要的意义；三是自主复制序列（ARS），即在染色体上多处DNA复制起始的位点，跟质粒的复制起始位点有些相似。,可携带100万碱基以上的DNA大片段，既可保证基因结构的完整性，又可以大大减少核基因库所需的克隆数目。所携带基因可大可小，这一特性对于正在实施的各种基因组计划意义极大。,缺陷：插入片段重组率高。,