单克隆抗体与基因工程抗体的制备.ppt

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物：,BALB/,c,小鼠,7,12,周龄,20g,25g,体重,（二）免疫脾细胞,细胞性抗原：,（,1,2,）,10,7,/,只，不加佐剂，,2,3,周重复一次,可溶性抗原：,首次，完全福氏佐剂,+100,微克抗原，,3,6,周,100,200,微克抗原，融合前,3,天，加强免疫,免疫小鼠,细胞融合剂：,PEG:,分子量,4000,的,PEG,是最常用的细胞融合剂,作用机理：,诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合,作用特点：,随机发生的，不同厂商、批号、分子量的,PEG,，其纯度与毒性有所不同,骨髓瘤细胞与淋巴细胞,(1:3-10),50%,PEG 1min,内加完;,10,ml,培养液,终止反应,融合方法,表达载体 2L,作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同,A G A T C T,T载体的特点是将普通的克隆载体切成线状，并使之在3 末端含有一个凸出碱基T；,5、用凝胶成像系统进行分析。,Host chromateme,McAb与PcAb的比较,Foreign DNA to be inserted,由一个B淋巴细胞增殖而成的细胞集团,阳性重组子的PCR鉴定,全自动高压灭菌锅、恒温水浴槽、高速冷冻离心机、超净,许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。,SP2/0,细胞与脾细胞的比例为,1,：,2,5,1ml 50%,的,PEG,（无菌，预温,37,）在,1,分钟内滴完,静置,45,秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止,PEG,作用,根据细胞数量加入,HAT,培养基，使之分加到,96,孔板中时每孔细胞数为（,0.5,1.5,）,10,5,个。融合后,7-14,天，换用,HT,培养液,细胞融合,7,20,天出现克隆,HAT,筛选,挑克隆,融合细胞的早期培养,HAT,培养基：,H,（,Hypoxanthine,）,:,次黄嘌呤,A,（,Aminopterin,）：,氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断,DNA,合成主要途径,T(Thymidine),：,胸,腺嘧啶核苷；,“,核苷酸前体,”,，供细胞通过替代途径合成,DNA,杂交瘤细胞的选择性培养,HAT,选择作用：,淋巴细胞：,不能生长，,5,7,天死亡；,DNA,合成的主要途径被,A,阻断,骨髓瘤细胞：,不能生长，,5,7,天死亡；,HGPRT,缺乏，,DNA,合成的替代途径受阻,杂交瘤细胞：,长期生长繁殖,利用淋巴细胞的,HGPRT,，将,H,合成为嘌呤碱并最终与,T,一起合成,DNA,从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息,从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力,有限稀释法,特点：,不需任何特殊设备,克隆出现效率高,实验室常用方法,方法：,细胞悬液通过系列稀释,每个培养孔含,0.5,1,个细胞,阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存,单克隆抗体的制备,经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。,一、单克隆抗体的产生,动物体内诱生方法：,每次用,BALB/c,或,F1,代小鼠，（,5,10,）,10,5,/,只,体外培养法：,中空纤维培养系统,单抗含量不高，牛血清,Ab,难以去除,腹腔注射法,盐析沉淀,亲和层析,离子交换层析,二、,McAb,的纯化,Ig,类型、亚类测定：,双扩法或,ELISA,法,特异性测定：,抗原类似物的交叉反应,效价测定：,用腹水或培养液的稀释度表示,表位测定：,几株单抗是否为不同表位特异的,用竞,争抑制法，相加指数法及微机集群分析,亲和性测定：,测定亲和常数,K,杂交瘤细胞染色体：,秋水仙素裂解法，小鼠,B,细胞染色体,40,条，,SP2/0,细胞,68,条，杂交瘤细胞一般,100,多条,McAb,靶抗原分子量：,常用,western blot,三、单克隆抗体的性质鉴定,四、单克隆抗体的特性,高度特异性,高度的均一性和可重复性,弱凝集反应和不呈现沉淀反应,对环境敏感性,（一）单克隆抗体的特性,优点：,在体外,“,永久,”,地存活并传代,用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗,单克隆抗体的优点与局限性,局限性：,固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体,制备技术复杂、费时费工、价格较高,McAb,Pc,Ab,抗原要求,可以不纯 纯度高,得量,高 低,特异性,高 低,稳定,低 高,沉淀反应,无 有,成本,高 低,McAb,与,Pc,Ab,的比较,McAb and PcAb,基因工程抗体制备,基因工程抗体,(Genetic engineering antibody),根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。,将小鼠,Ig,基因敲除，转染人,Ig,基因，在小鼠体内产生人,Ab,，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体,一、人源化抗体,Fab,：,抗原结合片断,Fv,：,可变区片段,ScFv,：,单链可变区片段,SdAb,：,单区抗体,二、小分子抗体,其它生物活性蛋白融合,三、抗体融合蛋白,许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。,四、双特异性抗体,定义：,将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在,HIV,等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性,五、噬菌体抗体库技术,原理与操作技术,基因工程亦称遗传工程，即利用,DNA,重组技术的方法，把,DNA,作为组件，在细胞外将一种外源,DNA,（目的基因）和载体,DNA,重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因,DNA,在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（,cloning,，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。,基因工程的操作技术,Foreign DNA to be inserted,Plansmid vector,Joining,Recombinant DNA molecule,Introduction into host cells by transformation of viral infection,Host chromateme,Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule,Cloning,+,1,、体外基因重组,目的基因的制备,载体的构建：质粒或噬菌体,目的基因与载体重组,2,、,重组体,DNA,的转化增殖和表达,转化,筛选,增殖和基因表达,PCR(,聚合酶链式反应,),PCR,技术,原理,示意图,靶序列,变性和引物复姓,循环,1,循环,2,循环,3,变性和引物复姓,链延伸,Tag,酶,链延伸,抗原的原核表达,以脂肪酸结合蛋白（,FABP,）为例：,首先要合成或购买表达,FABP,的基因序列并设计合成引物,ATGGTGGACGCTTTCCTGGGCACCTGGAAGCTAGTGGACAGCAAGAATTTCGATGACTACATGAAGTCACTCGGTGTGGGTTTTGCTACCAGGCAGGTGGCCAGCATGACCAAGCCTACCACAATCATCGAAAAGAATGGGGACATTCTCACCCTAAAAACACACAGCACCTTCAAGAACACAGAGATCAGCTTTAAGTTGGGGGTGGAGTTCGATGAGACAACAGCAGATGACAGGAAGGTCAAGTCCATTGTGACACTGGATGGAGGGAAACTTGTTCACCTGCAGAAATGGGACGGGCAAGAGACCACACTTGTGCGGGAGCTAATTGATGGAAAACTCATCCTGACACTCACCCACGGCACTGCAGTTTGCACTCGCACTTATGAGAAAGAGGCATGA,上游引物：,HF15 CG,GAATTC,ATGGTGGACGCTTTCCTGGGC 3,下游引物：,HF25 GC,CTCGAG,TCATGCCTCTTTCTCATAAGT 3,基因序列,酶切位点,NdeI,XbaI,C,A,T,A,T,G,G,T,A,T,A,C,T,C,T,A,G,A,A,G,A,T,C,T,T,A,T,G,A,C,T,A,G,A,T,C,C,A,G,T,A,T,C,T,A,G,A,T,限制性内切酶,限制性内切酶可识别特定位点并切割,DNA,产生粘性末端或平端的外源片段，经,DNA,的纯化处理后用于连接反应。,通过扩增获取足够的联结片段,PCR,扩增,实验步骤,去离子水,缓冲液,dNTP,引物,模板,DNA,聚合酶,混匀,1,、按下列体系配制反应混合液，混匀，,Template cDNA,5.0 L,10buffer,2.5 L,MgCl,2,（,25mmol/L,）,1.0L,Primer1(10mol/L),0.5 L,Primer2(10mol/L),0.5 L,dNTP,（,2 mmol/L,）,2.0 L,Taq,酶（,5U/L,）,0.25L,加,ddH,2,O,至,50 L,2,、,PCR,反应循环条件设置,94,变性反应,1min,；,55,退火反应,45s,；,72,延伸反应,1min,。,进行,25,个循环后，最后一个循环,72,延长至,10min,。迅速冷却,4,。,实验结果,1 2,1.PCR,产物,2.Marker,PCR,产物的琼脂糖凝胶电泳,PCR,片段的,TA,克隆,实验原理,T,载体的特点是将普通的克隆载体切成线状，并使之在,3,末端含有一个凸出碱基,T,；,Taq,DNA,聚合酶具有末端转移酶的活性，可在,DNA,片段的,3,末端添加一个核苷酸，通常为,A,。因此，,Taq,DNA,聚合酶扩增的产物可与,T-,载体进行粘端互补连接，达到高效克隆的目的。因为,TA,克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为,Taq,聚合酶,PCR,产物的最佳克隆方法。,试剂与器材,1,、材料,：纯化的,PCR,产物,2,、试剂,（,1,）,LB,液体培养基,（,2,）,1.5%,琼脂,LB,固体培养基,（,3,）,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-,半乳糖苷（,X-gal,）储存液,(20mg/mL),（,4,）异丙基,-,-D-,硫代半乳糖苷（,IPTG,）储液,(20mg/mL),（,7,）,pEASY-Blint,载体系统,3,、仪器,全自动高压灭菌锅、恒温水浴槽、高速冷冻离心机、,超净工,作台、恒温摇床、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统,实验步骤,PCR,产物,T,载体,连接缓冲液,连接酶,室温,10min,转化大肠杆菌,37,过夜,铺平板,TA,质粒的构建,连接反应一般在灭菌的,0.5mL,离心管中进行。,10L,体积反应体系中：,pEasy,载体,1L,纯化的,PCR,产物,3L,轻轻混匀，室温下放置反应,10min,。,全自动高压灭菌锅、恒温水浴槽、高速冷冻离心机、超净,复性缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.,C A T A T G,固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体,Foreign DNA to be inserted,第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody),不产生Ig的重链和轻链,McAb靶抗原分子量：常用western blot,适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,2、加入终浓度为1mmol/L的IPTG。,PCR技术原理示意图,经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。,融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。,从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力,针对多种抗原决定簇的混合抗体,制备技术复杂、费时费工、价格较高,2、过硫酸铵（聚合的引发剂）,转化,（,1,）取一装有的,100L,感受态细胞的,EP,管，加入上一步联结产物，冰浴上放置,30min,。,（,2,）将该,EP,管放入预加温至,42,的水浴中，热激,45s,，快速转移到冰浴中放置,2 min,。,（,3,）向每个,EP,管加入,500,L,的,LB,培养基，转移至,37,恒温摇床上，,150r/min,，温育,45 min,以复苏菌株。,（,4,）将,200,L,上述培养物加到含,100,g/mL,氨苄青霉素的,LB,平板上（平板表面涂有,20mg/mL,的,X-gal 40,L,和,20mg/mL,的,IPTG 40,L,），以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面。,（,5,）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，,37,过夜培养。,实验结果,重组载体的蓝白筛选,连接,C,A,T,A,T,G,G,T,A,T,A,C,T,C,T,A,G,A,A,G,A,T,C,T,实验原理,试剂与器材,1,、材料,纯化的片段及载体,2,、试剂,（,1,）,LB,液体培养基,（,2,）,1.5%,琼脂,LB,固体培养基,（,3,）,T4,连接酶及缓冲液,3,、仪器,全自动高压灭菌锅、恒温水浴槽、高速冷冻离心机、,超净,工作台、恒温摇床、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统,实验步骤,表达载体,目的片段,Solution I,16,30min,转化大肠杆菌,37,过夜,铺平板,表达载体的构建,连接反应一般在灭菌的,0.5mL,离心管中进行。,10L,体积反应体系中：,目的片段,3L,表达载体,2L,Solution I 5L,轻轻混匀，,16,30min,。,重组子的鉴定,质粒的提取,阳性重组子的酶切鉴定,阳性重组子的,PCR,鉴定,实验结果,诱导表达,实验步骤,1,、将工程菌接种,LB,液体培养基中，,37,振摇培养,OD,600,=0.6,2,、加入终浓度为,1mmol/L,的,IPTG,。,3,、继续培养,5,小时。,表达产物的,SDS-Page,鉴定,实验原理,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质及小分子核酸进行量化、比较和特性鉴定的一种快速方法。在蛋白质样品中加入,SDS,后，所有的蛋白质分子都与,SDS,结合并带有负电荷，因此蛋白质在电场中的移动主要取决于蛋白质分子量的大小，而于蛋白质本身的等电点无关。,为了增加分辨率通常采用不连续凝胶体系，该体系是由浓缩胶、分离胶两部分组成。浓缩胶与分离胶由于有不同的凝胶浓度和缓冲液,pH,值，蛋白质样品在浓缩胶中受到浓缩效应、电荷效应和分子筛效应的影响，可被浓缩成一条极为狭窄的条带，因此当蛋白质 样品进入分离胶时就形成了彼此分离的清晰条带，大大提高了分辨率。,试剂与器材,试剂,1,、丙烯酰胺溶液中含有甲叉双丙稀酰胺,2,、过硫酸铵（聚合的引发剂）,3,、四甲基乙二胺（加速剂，可加快聚合的速度）,仪器,垂直板电泳槽和电泳仪,实验步骤,1,、倒制胶板。将两玻璃板密封好，将所需浓度的分离胶溶液按比例加入烧杯混匀。倒入密封好的玻璃板间隙中，用少量正丁醇覆盖液面，以隔绝空气，并产生整齐的上液面。胶液的聚合大约需要半小时，随后倒掉胶板上沿的液体并加入配置好的浓缩胶溶液，插入梳子，聚合后移去梳子。,2,、加样与电泳 蛋白质样品在加样前需要和样品缓冲液混合并煮沸,5min,，使蛋白质发生溶解、变性。,3,、将制胶板中的密封胶条除去，装入电泳槽，在正负极水槽中加入电极缓冲液，将预处理后的蛋白质样品加入对应的梳空，装好电泳槽，接好电源，开始电泳。,4,、染色与脱色 电泳结束后，分离玻璃板，取出凝胶进行染色，可将无色的凝胶直接放入考马氏亮蓝中振荡染色约,1h,，再转入脱色液中脱色。,5,、用凝胶成像系统进行分析。,实验结果,、,低分子量标准蛋白,3,、,经,IPTG,诱导的工程菌,、,未经,IPTG,诱导的工程菌,1 2 3 4,表达产物的分离纯化,胞内产物,胞外产物,细胞破碎,固液分离,包含体,细胞碎片分离,变 性,复 性,浓 缩,初步分离,高度纯化,发酵液,细胞分离,在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。包含体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作,实验原理,试剂与器材,试剂,洗涤缓冲液（,50mmol/L Tris-HCl,，,1mmol/L EDTA,，,pH8.0,）,洗涤液（,20mmol/L Tris-HCl,，,1mmol/L EDTA,，,2mol/L Urea,，,0.5%Triton X-100,，,pH8.0,）,溶解液（,10mmol/L Tris-HCl,，,8mol/L Urea,，,50mmol/L,-,巯,基乙醇，,1mmol/LMEDTA,，,pH8.0,）,稀释液（,3mol/L Urea,，,10mmol/L Tris-HCl,，,pH8.0,）,复性缓冲液（,10mmol/L Tris-HCl,，,1mmol/L EDTA,，,pH8.0,）,器材,低温高速离心机、,超声波粉碎仪、光学显微镜,材料,透析袋、烧杯等,实验步骤,包含体分离,包含体溶解,包含体复性,菌体裂解,包涵体洗涤,先用洗涤缓冲液离心洗涤菌体,3,次后用洗涤缓冲液将菌体稀释成,1g/10ml,浓度混悬液，在冰浴下超声破碎菌体，然后,4,、,10000g,离心,20,分钟，收集包含体沉淀。,用包含体洗涤液离心洗涤包含体（,4,、,10000g,离心,20,分钟），,2,3,次，包含体洗涤液体积为包含体沉淀的,20,倍以上。,以每克包含体与,50ml,包含体溶解液的比例配成混悬液，室温搅拌,15,小时，然后,15,、,15000g,离心,20,分钟留取上清，即得,血管抑素,抽提液。,用稀释液将血管抑素抽提液稀释至蛋白浓度为,500g/ml,，然后用,40,倍体积的复性缓冲液,4,下透析,12,小时，然后更换透析液继续透析,24,小时。,分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技术分为,：,Ion exchange chromatography(IEC),Reversed phase chromatography(RPC),Hydrophobic interaction chromatography(HIC),Affinity chromatography(AC),样品的层析纯化,感谢观看,