基因与基因工程优选ppt资料.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基因(jyn)与基因(jyn)工程,第一页，共62页。,一、基因(jyn)的基本概念,1822年7月22日生于奥地利莫拉维亚省的海因岑多夫村一个贫苦(pnk)农民家庭；,1828年，6岁的孟德尔开始接受系统的小学和中学教育；,1840年，以优异的成绩高中毕业，进入厄尔姆兹哲学学院进行了两年的大学预科学习；,1843年秋，进入布隆市的奥古斯汀基督教修道院当一名修道士，取教名格里高，时年21岁；,1.孟德尔遗传因子与基因(jyn),（1）孟德尔生平简介,第二页，共62页。,1847年，被任命为神父；,1849年，被委派到中学任希腊文和数学代课教师；,1851年，在修道院的资助下，进入维也纳大学深造；,1854年夏天，大学毕业，回到奥古斯汀修道院，开始了人生的新篇章；,1856年，开始长达8年之久的豌豆杂交实验；（修道院后花园）,1865年，在布隆市自然科学研究协会的年会上，公布了他的研究结果和理论解释；,1866年，发表著名论文植物杂交实验，首次提出了遗传因子、显性性状和隐性性状等遗传学概念；,1868年，当选奥古斯汀修道院院长，此后(c hu)再也无力从事研究；,1884年1月6日去世！,第三页，共62页。,后人在分析孟德尔成功发现遗传第一定律和第二定律的原因时，一致认为选择(xunz)豌豆为实验材料具有决定性的意义。,那么豌豆具有什么样的生物学特性呢？,（2）豌豆(wn du)的生物学特性,第四页，共62页。,a.不同的豌豆品系之间，通常存在着差异明显、易于区别而又稳定遗传的相对性状特征；（开紫花的豌豆植株）,b.豌豆花的结构比较特殊，具有雄配子的花药和具有雌配子的胚珠是由花瓣包裹着。因此它是一种(y zhn)严格的自花授粉植物；（豌豆花的结构）,c.豌豆具有较大型的花器官（即生殖器官），便于去雄，进行人工授粉实验。（豌豆人工授粉）,第五页，共62页。,（3）孟德尔的单因子(ynz)豌豆杂交实验 遗传因子(ynz)分离定律,1856年至1863年，孟德尔在奥古斯汀修道院的后花园进行了长达8年的豌豆杂交实验。他首先选择了七对区别(qbi)分明而又能稳定遗传的性状作仔细的观察。这七对性状是：,花着生的部位 腋生和顶生,种子的形状 圆形和皱形,种子内部颜色 黄色和绿色,花朵(hudu)的颜色 紫色和白色,植株茎杆长度 长茎和短茎,成熟豆荚外形 饱满和节缩,未成熟豆荚颜色 绿色和黄色,第六页，共62页。,Table 1.A summary of the seven pairs of contrasting traits and results of Mendel,s seven monohybrid crosses of the garden pea(,Pisum sativum,),第七页，共62页。,（4）孟德尔双因子豌豆杂交(zjio)实验数据统计,世代,种子表型,种子数量,比例,亲代,绿圆黄皱,F1代,黄圆,F2代,黄圆,315,9.84,黄皱,101,3.16,绿圆,108,3038,绿皱,32,1.0,总数556,第八页，共62页。,（5）遗传因子的自由组合定律(dngl)：,根据上述实验结果，孟德尔推想：由两对等位因子(ynz)杂交产生的杂种F1代植株，在形成配子过程中，两对等位因子(ynz)的分离是彼此独立互不相关的，而在形成合子的过程中，不同因子(ynz)之间又是自由组合的。这就是所谓的遗传因子(ynz)独立分配律，或叫自由组合律，亦即是孟德尔第二定律。,孟德尔还进行了多因子(ynz)豌豆杂交实验，其结果虽然比较复杂，但它同样遵循遗传因子(ynz)的独立分离和自由组合的原则。,第九页，共62页。,（6）孟德尔遗传因子被正式定名(dng mng)为基因,1909年，丹麦的一位生物学家约翰逊，根据希腊文“给予生命之义”创造了“基因”这个名词，用来代替孟德尔的“遗传因子”。,但是需要指出，约翰逊当时所说的基因，并不代表遗传物质实体，只是一种与细胞的任何可见的形态结果均无关系的抽象(chuxing)单位，也就是遗传性状符号！,第十页，共62页。,2、摩尔根的基因(jyn)论,（1）摩尔根生平(shngpng)简介,1866年9月25日，Thomas Hant Morgan出生于美国肯塔基州的列克星敦市的一个富裕家庭(jitng)。,1880年，14岁的少年摩尔根考入肯塔基州立学院预科班学习，两年后转入本科。,1886年，以全班第一名成绩从肯塔基州立学院毕业，进入约翰.霍普金斯大学从事实验胚胎学研究；,第十一页，共62页。,1890年，在约翰.霍普金斯大学获理学博士学位；,18911903年，在布林莫尔女子学院任教，同时在其它一些研究机构从事胚胎学方面的研究；19041928年，担任哥伦比亚大学动物学教授，进行遗传学与进化论领域的科学研究；,19271931年，担任美国科学院院长；,1928年退休，同年发表名著“基因论”；,19281945年，任加州大学生物学主任；,1930年，担任美国科学促进联合会主席；,1933年，获诺贝尔生理学及医学奖；,1945年12月4日，因动脉血管破裂(pli)在美国加州的帕萨迪纳市逝世。,第十二页，共62页。,（2）果蝇(u yn)的生物学特性,a.繁殖能力强，产卵数量多；,b.繁殖速度快，世代时间(shjin)短（9天左右）；,c.染色体数目少，仅4对，且形态各异，易于辨认；,d.拥有大量的各种突变体；,e.个体小，管理简单，对饲料无特殊要求。,第十三页，共62页。,（3）果蝇(u yn)的染色体组,性染色体指与生物个体的性别(xngbi)决定有直接关联的染色 体。例如果蝇的X染色体和Y染色体。,常染色体除了性染色体之外的，不直接参与生物个体性别(xngbi)决定的染色体叫常染色体。例如果蝇的第II对，第III对染色体，均为常染色体。,果蝇有4对染色体，其中(qzhng)1对为性染色体，其余3对为常染色体。,第十四页，共62页。,（4）果蝇眼色基因(jyn)的性连锁遗传,1910年，摩尔根及其助手从红严果蝇群体(qnt)中发现了一只白眼的雄果蝇，他们将白眼雄果蝇同来自同一父母的姊妹红眼雌果蝇交配，结果产生的F1代果蝇，无论是雄的还是雌的，无一例外都是红眼的。这个结果说明：,a.果蝇红眼是显性性状，白眼是隐性性状；,b.亲代白眼雄果蝇是隐性纯合子；,c.亲代红眼雌果蝇是显性纯合子；,摩尔根等人将上述所产生的F1代的红眼雄果蝇同红眼雌果蝇相互交配，产生的子二代（F2）果蝇中，红眼同白眼的比例恰好为3:1。但有趣的是，所有的白眼果蝇都是雄性的，没有一只是雌性。,第十五页，共62页。,这说明：白眼性状与性别有联系，摩尔根等人推测控制果蝇的白眼隐性基因是位于X染色体上。,摩尔根等人的工作，第一次将代表某一特定性状的基因，同某一特定的染色体联系起来了，从而建立(jinl)了基因的遗传物质基础，建立(jinl)了基因的染色体理论，使基因学说得到了普遍的承认。,第十六页，共62页。,（5）连锁与交换(jiohun)定律,基因的连锁与交换定律，是由美国著名的遗传学及胚胎学家摩尔根与他的学生所建立的。由于该定律极大(j d)地完善并丰富了孟德尔遗传学理论，因此后人将它与孟德尔第一遗传定律、第二遗传定律并列，称之为遗传学第三定律。,第十七页，共62页。,（6）摩尔根的学术(xush)贡献,摩尔根及其学术的工作，第一次将代表(dibio)某一特定性状的基因，同某一特定的染色体连系了起来，从而确证了基因的遗传物质基因，建立了基因的染色体理论，为基因工程的建立作了卓越的贡献。,摩尔根生活低调，衣着朴素，热心科研，勤奋工作，知道38岁才与其女友结婚。为了不影响科研工作，摩尔根借故没有出席诺贝尔奖的颁奖典礼。他总结自己为什么会在科学研究中作出诸多发现的原因时说“一靠勤奋，二靠实验材料得当，三靠愿意放弃没有任何证据的假说，最后还得少开些遗传学大会”。,第十八页，共62页。,3.基因(jyn)的载体是 DNA,在孟德尔和摩尔根的基因论被科学工作者广泛接受之后，关于基因的载体（或说是化学本质）是DNA还是蛋白质，一直(yzh)存在着两种不同的意见。,（1）1944年，O.Avery等人的肺炎链球菌毒性转化(zhunhu)实验证明，基因的载体是DNA，而不是蛋白质。,S型肺炎链球菌,具荚膜，光滑，有毒。,R型肺炎链球菌,无荚膜，粗糙，无毒。,第十九页，共62页。,结论(jiln)：,使肺炎链球菌毒力性状发生转化的因子是DNA，而不是蛋白质。这有力地证明基因(jyn)的遗传载体是DNA而不是蛋白质。,第二十页，共62页。,（2）1952年，A.D Hershey and M.Chase应用放射性同位素双标记技术，证明菌体的遗传物质（基因(jyn)的载体）也是DNA而不是蛋白质。,实验(shyn)现象：,用放射性同位素32P和35S分别标记噬菌体的内部DNA和外部蛋白质，然后感染寄主(jzh)细胞。结果发现只有32P标记的DNA注入大肠杆菌细胞。,结论,：,在噬菌体中，基因的载体也是DNA而不是蛋白质。,第二十一页，共62页。,DNA分子的半保留复制(fzh)模型,（3）1953年，J.Watson和F.Crick建立了DNA的双螺旋模型；1958年，M.Meselson和F.W.Stahl在此基础上发现了DNA分子半保留复制机理。从而解决了基因的自我复制和代代相传的问题。,至此，基因的分子本质是DNA而不是(b shi)蛋白质已是不争的事实！,第二十二页，共62页。,4.基因(jyn)的编码产物,基因是细胞中所有RNA及蛋白质分子的“蓝图”，有,些基因编码的最终产物(chnw)是RNA分子，例如rRNA基因、tRNA基因及其它小分子量的RNA基因等；而其它一些,基因编码的最终产物(chnw)是蛋白质，这些蛋白质是通过,mRNA中介合成的。,第二十三页，共62页。,5.遗传密码的破译DNA的核苷酸顺序(shnx)与蛋白质氨基酸顺序(shnx)关系,Beadle、Tatum和Ingram等人的工作，虽然确立(qul)了基因（DNA）与蛋白质多肽链之间的关系，也就是说蛋白质是由基因编码的，但是，基因的DNA分子是由4种不同的核苷酸（A、T、G和C）排列组合而成的，而蛋白质分子中的多肽链则是由20种氨基酸排列组合而成。那么基因DNA分子中的核苷酸碱基顺序，同蛋白质多肽链中的氨基酸顺序之间存在着什么样的关系呢？遗传密码的破译正确地回答了这个问题。,第二十四页，共62页。,（1）中心法则(zhn xn f z),1958年，F.Crick提出(t ch)了解释DNA，RNA及蛋白质三者关系的所谓中心法则：,DNA,RNA,蛋白质,根据中心法则DNA会自我复制，而RNA及蛋白质二者都不能够自我复制，因此(ync)生物体中能够永久保存代代相传下去的是DNA分子，或说是基因。,第二十五页，共62页。,DNA在复制(fzh)过程中双链解开，以单链形式作为合成自己互补链（cDNA）的模板，其碱基配对原则是：,腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）,鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）,在DNA到RNA的转录过程中，单链的cDNA则是作为指导RNA合成的模板。RNA可分成tRNA、rRNA、其它小分子RNA和mRNA，其中只有mRNA可转译成蛋白质。转录过程中的碱基配对原则：,腺嘌呤（A）尿嘧啶（U）,鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）,第二十六页，共62页。,（2）遗传(ychun)密码,遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的过程(guchng)，叫作基因的表达。它涉及遗传信息的转录和转译两个步骤。,转录根据碱基互补原则，遗传信息从DNA的核苷酸序列(xli)形式转换成RNA核苷酸序列(xli)形式的过程叫作转录，也叫RNA合成。,转译遗传信息从mRNA的核苷酸序列(xli)形式，转变成蛋白质多肽链氨基酸序列(xli)形式的过程叫作转译，也叫蛋白质合成。,第二十七页，共62页。,当我们思考转录和转译这两个过程时会发现，,转译与转录不同，它不是简单的核苷酸序列的转换过 程，而是将mRNA分子上的核苷酸语言翻译成蛋白质多肽链上氨基酸语言的负责过程，是涉及到两种不同语言信号(xnho)之间的更换问题。,因此，在从mRNA到蛋白质多肽链的转译过程中，,必定存在着一种特殊的遗传密码系统，才能够将,RNA分子上的核苷酸顺序，同蛋白质多肽链分子上,的氨基酸顺序联系。这种遗传密码在1966年已经完,全破译。,第二十八页，共62页。,（3）通用(tngyng)遗传密码表,第一位字母（5,-,末端）,第二位字母,第三位字母（3,-,末端）,U,U,C,A,G,U,C,A,G,Phe,Phe,Leu,Leu,Ser,Ser,Ser,Ser,Tyr,Tyr,Stop,Stop,Cys,Cys,Stop,Trp,C,Leu,Leu,Leu,Leu,Pro,Pro,Pro,Pro,His,His,Gln,Gln,Arg,Arg,Arg,Arg,U,C,A,G,A,Ile,Ile,Ile,Met,Thr,Thr,Thr,Thr,Asn,Asn,Lys,Lys,Ser,Ser,Arg,Arg,U,C,A,G,G,Val,Val,Val,Val,Ala,Ala,Ala,Ala,Asp,Asp,Glu,Glu,Gly,Gly,Gly,Gly,U,C,A,G,注1.Met和Val的密码子AUG和GUG，也叫起始(q sh)密码子，表中加方框表示。,注2.UAA、UAG及UGA三个密码子为终止密码子，表中以“Stop”表示。,第二十九页，共62页。,至此，基因的分子本质是DNA而不是(b shi)蛋白质已是不争的事实！,（1）中心法则(zhn xn f z),而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题。,例如Hpa和Msp就是一对具有(jyu)同样识别序列：的同裂,表达载体(zit)的结构,那么基因DNA分子中的核苷酸碱基顺序，同蛋白质多肽链中的氨基酸顺序之间存在着什么样的关系呢？遗传密码的破译正确地回答了这个问题。,(a)将硝酸纤维素滤膜铺放在生长着转化菌落的平板表面，使其中的质粒DNA转移到滤膜上；,按照细胞中是否存在真正有形的细胞核结构，可把生物分成真核生物和原核生物两大类。,从而解决了遗传信息的流向和表达问题。,（c）噬菌体载体；,第五十三页，共62页。,1840年，以优异的成绩高中毕业，进入厄尔姆兹哲学学院进行了两年的大学预科学习；,（限制片断切割）,UAA、UAG及UGA三个密码子为终止密码子，表中以“Stop”表示。,6.基因(jyn)的结构,按照细胞中是否存在真正有形的细胞核结构，可把生物分成真核生物和原核生物两大类。例如大肠杆菌细胞中的染色体并没有被核膜包围，因此没有真正的有形的细胞核结构，属于原核生物。而诸如高等植物(godngzhw)和动物，细胞中的染色体被核膜包围成一种有形的细胞核结构，属于真核生物。与此相应，也可把基因分成真核基因和原核基因两大类，两者在结构上是有差别的。,第三十页，共62页。,（1）基因(jyn)的基本组成部分,不管是真核基因(jyn)还是原核基因(jyn)，都具有如下4个基本的组成部分：,a.编码区包括起始密码子，终止密码子和氨基酸密码子；,b.非编码区5-末端非转译区，3-末端非转译区，真核基因(jyn),的间隔区；,c.启动区RNA聚合酶结合部位，由此启动基因(jyn)的转录作用；,d.终止区具有终止转录作用的功能。,第三十一页，共62页。,（2）原核蛋白质编码基因(jyn)的结构,基因(jyn),转录区,启动子,终止子,转录,ATG,TAA,5-UTR,3-UTR,转录终止位点,RNA起点,核糖体结合位点,第三十二页，共62页。,（3）真核蛋白质编码基因(jyn)的结构,基因(jyn),转录(zhun l)区,启动子,终止子,转录,ATG,TAA,5-UTR,3-UTR,多聚核苷酸化位点,RNA起点,初级RNA转录本,剪辑,ATG,TAA,5-UTR,3-UTR,多聚核苷酸化位点,RNA起点,核糖体结合位点,mRNA,基因,转录区,启动子,终止子,转录,ATG,TAA,5-UTR,3-UTR,多聚核苷酸化位点,RNA起点,初级RNA转录本,剪辑,ATG,TAA,5-UTR,3-UTR,RNA起点,mRNA,外显子,内含子,第三十三页，共62页。,二.基因工程(jyn gngchng)原理,1.基因工程诞生的基础(jch),（1）基因工程诞生的理论基础(jch),a.在上世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA,而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题。,b.在上一世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理(j l)，,从而解决了基因的自我复制和遗传传递的问题。,c.在上世纪50年代末期和60年代初期，,科学工作者相继提出了“中心法则”、,“操纵子学说”，并成功地破译了遗传密码，,从而阐明了遗传信,息流向和表达的问题。,第三十四页，共62页。,小结：基因工程诞生(dnshng)的理论基础是,（a）基因的分子(fnz)载体是DNA而不是蛋白质，,从而解决了遗传物质的基础问题。,（b）DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机理，,从而解决了基因的自我复制和遗传传递问题。,（c）“中心法则”、“操纵子学说”和遗传密码的破译，,从而解决了遗传信息的流向和表达问题。,第三十五页，共62页。,（2）基因工程诞生(dnshng)的技术基础：,（a）DNA分子体外切割(qig)与连接技术的建立；,（b）DNA分子核苷酸序列(xli)测定方法的发明；,（c）大肠杆菌遗传转化技术的建立；,（d）琼脂糖凝胶电泳技术的建立与应用；,（e）核酸杂交技术的建立，,(DNA片段的分离和酶切图谱的构建等),(Southern和Northern杂交术)。,第三十六页，共62页。,2.基因工程(jyn gngchng)（Gene engineering或genetic engineering）,定义：在体外试管中应用DNA重组技术将外源核酸分子（基因(jyn)）插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质重组体，并使之转移到原本没有这类分子（基因(jyn)）的受体细胞内，而能持续稳定地繁殖与表达。这样的过程叫做基因(jyn)工程，有时也叫做遗传工程。,第三十七页，共62页。,（1）基因(jyn)克隆与DNA克隆,a.在DNA克隆(k ln)中插入载体的DNA片段，绝大多数是不含有 基因编码序列的，或者说是不含有完整的基因编码序列的。,b.拿人的基因组DNA为例，全长达3109bP，但其中基因的编码序列不到2%。因此绝大多数DNA片段是不含有基因编码序列的。,b.基因克隆(k ln)实质上是指应用类似于DNA克隆(k ln)的技术，分离 纯化含目的基因的DNA片段的实验操作过程。,第三十八页，共62页。,（2）“克隆”一词的概念,在中文中“克隆”一词兼具名词、动词和形容词三种不同词义。,“克隆”作名词使用时，是指从一个共同的祖先(zxin)无性繁殖而 来的一群遗传同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊的生命群体；,“克隆”作为动词使用时，则是指从同一祖先(zxin)经过无性繁殖产生这类遗传上同一的DNA分子、细胞或个体的过程；,在中文中“克隆”还可作为形容词使用。例如克隆羊（Cloned sheep）。,第三十九页，共62页。,（3）名词“克隆(k ln)”的三种层次：,个体水平具有相同基因型的同一物种的两个或 多个个体。例如从同一个受精卵分裂而来的同卵双生子（monozygotic twins），便是属于同一克隆；,细胞水平从同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的细胞群体。（在细胞学、胚胎学中使用）；,分子水平在分子生物学中特指(t zh)带有一段插入DNA的载体分子/寄主细胞单位。例如大肠杆菌寄主细胞中的重组质粒载体，叫做克隆。,第四十页，共62页。,（4）基因克隆(k ln)步骤：,从 所选用的实验材料中分离、纯化(chn hu)基因组DNA，经适,当限制酶消化切割，产生出DNA限制片段群体,（限制片断切割）,在体外试管中将片段群体连接到载体分子上，形成重,组DNA分子（重组体）混合物,（体外重组）,将此重组DNA分子混合物转化到适当的受体细胞，,进行(jnxng)复制与繁殖,（遗传转化）,从大量的转化细胞群体（即DNA文库），筛选出获,得重组DNA分子（含目的基因）的转化子克隆,（转化子克隆的筛选）,从这些转化子克隆中，提取己经得到扩增的目,的基因，供进一步研究用,（目的基因分离）,将目的基因亚克隆在表达载体上，导入受体细胞，使之,在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类需要的产品,（目的基因的表达）。,第四十一页，共62页。,3.核酸内切限制酶-DNA分子(fnz)的“剪刀”,（1）定义：核酸内切限制酶（Restriction endonuclease），又叫做限制酶（Restriction enzyme），是一类能够识别(shbi)双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割双链DNA分子的核酸内切酶。因此有人形像地将核酸内切限制酶形象地比作DNA分子的剪刀。,自然界中存在着大量的核酸内切限制酶，迄今已经从各种不同的微生物中分离纯化出三千多种的核酸内切限制酶。它们总共能够识别(shbi)200种左右的不同的特异性识别(shbi)序列。,第四十二页，共62页。,（2）几种常用限制(xinzh)酶的识别序列,Bam,H I 5-GGATCC-3,3-CCTAGG-5,Eco,R I 5-GAATTC-3,3-CTTAAG-5,Hind,III 5-AAGCTT-3,3-TTCGAA-5,Pst,I 5-CTGCAG-3,3-GACGTC-5,第四十三页，共62页。,（3）DNA分子(fnz)的体外切割,a.体外切割在体外的反应体系中，在一定温度下保温（一般是37），核酸内切限制酶便可以对双链DNA分子进行切割作用。这种反应也叫作消化作用，或酶切消化作用。,b.粘性(zhn xn)末端DNA分子在限制酶作用下形成的，具有互补碱基的单链末端结构，它们之间可以通过互补碱基间的配对作用而重新连接起来。,第四十四页，共62页。,c.EcRI酶切（识别(shbi)位点为GAATTC）后，形成 5，-P的单链粘性末端,5-GAGATCTT,GAATTC,ATAAGTC-3,3-CTCTAGAA,CTTAAG,TATTCAG-5,5-GAGATCTT,G,-3,，,3-CTCTAGAA,C,TTAA-P-5,，,5,，,-P-AATT,CATAAGTC-3,3,，,-,G,TATTCAG-5,，,第四十五页，共62页。,d.Pst的识别位点及切割形成的3，-OH单链粘性(zhn xn)末端,5,-GGCCTT,C T G C A G,AATCGG-3,3-CCGGAA,G A C G T C,TTAGCC-5,5-GGCCTT,C,T G C-A-0H-3,3,-CCGGAA,G,G,AATCGG-3,3-0H-A C G T,C,TTAGCC-5,第四十六页，共62页。,（,4,）同裂酶、同尾酶和异裂酶,a.同裂酶（Isoschizomers),具有(jyu)同样的识别位点，产生同样的粘性末端，但是从不同的细分,离出来的，因而具有(jyu)不同名称的一类核酸内切限制酶。,例如Hpa和Msp就是一对具有(jyu)同样识别序列：的同裂,同裂酶形成同样的粘性末端，重组后识别序列不变！,b.同尾酶,（Isocaudamers）,一组来源不同、识别(shbi)序列各异，但能够切割形成相同粘性末端的核,酸内切限制酶。例如BanH、Bagl和Sau3A，即是组同尾酶，,第四十七页，共62页。,（,5,）,DNA,连接酶,（1）连接酶能够利用ATP分子中-磷酸集团的能量，通过催化两条并排的DNA链的5-P-集团和3-OH集团之间形成一个磷酸二酯键，而使两个(lin)DNA片段共价连接起来的核酸酶。,（2）连接(linji)条件：,a.被连接(linji)的两条DNA片段，一条链的3-末端具有一个游离的-OH集团；另一条的5-末端存在一个磷酸集团（P）。,b.在-OH和-P集团之间形成磷酸二酯键是一种需要能量的过程（ATP）。,c.最佳连接(linji)温度：416。,第四十八页，共62页。,4.基因(jyn)克隆的载体,（1）基因克隆载体的类型(lixng)：,（a）质粒载体；,（b）柯斯质粒载体；,（c）噬菌体载体；,（d）单链噬菌体载体；,（e）噬菌粒载体；,（f）酵母人工染色体载体,（g）YAC后载体,第四十九页，共62页。,（2）质粒载体,（a）质粒（Plasmid）的定义,一般指一类独立于细菌染色体DNA（染色体外）的自主(zzh),复制的共价、闭合、环形双链的DNA分子。,（b）质粒的一般特性,共价、闭合、环形(hun xn)双链的DNA分子（covalently closed circuler,DNA,cccDNA）,除了酵母杀伤质粒RNA外，所有的质粒都是DNA。,质粒DNA的复制必须依赖于寄主细胞提供核酸酶,及其他蛋白质分子。,第五十页，共62页。,（3）质粒DNA的分子构型,a.sc构型即cccDNA所呈现的超螺旋构型，走在凝胶的最前面；,b.OC构型即开环DNA（OC DNA）的构型，其中一条DNA链保持完整的环形(hun xn)结构，另一条链则出现一至数个缺口，走在凝胶的最后面；,c.L构型发生双链断裂形成的线性DNA的构型。通称L型，走在凝胶的中间部位。,第五十一页，共62页。,（4）质粒载体必须具备(jbi)的条件,a.一般具有(jyu)l个复制区或复制因子；,b.具有(jyu)l到2个抗生素抗性基因（供选择重组子）；,c.具有(jyu)若干种核酸内切限制酶的单个切点,（供外源DNA片段的插入）；,d.较小的分子量和较高的拷贝数,（质粒载体的克隆能力约5-6kb）。,第五十二页，共62页。,5.DNA分子(fnz)的体外重组,（1）粘性末端连接法：用同样的核酸内切限制酶，例如EcoR I，分别切割外源克隆的DNA和载体DNA，两者就会形成具有相同的互补的粘性末端，因此(ync)可荣誉地用DNA连接酶将它们连接起来。,第五十三页，共62页。,6.检测重组体克隆的菌落杂交(zjio)技术,(a)将硝酸纤维素滤膜铺放在生长着转化菌落的平板表面，使其中的质粒DNA转移到滤膜上；(b)取出滤膜，作溶菌、碱变性(binxng)、酸中和等处理后，置80下烤干；(c)带有DNA印迹的滤膜同32P标记的适当探针杂交，以检测带有重组质粒（含有被研究的DNA插入片段)的阳性菌落；(d)将放射自显影的X光底片同保留下来的原菌落平板对照，从中挑出阳性菌落，供进一步的分析研究。,第五十四页，共62页。,7.表达载体(zit)的结构,(大肠杆菌表达载体的结构成分),a.原核启动子参与控制真核基因转录与转译,的遗传元件。,b.标记基因抗菌素抗性基因。供选择转化子,用。,c.多克隆位点供外源基因的插入构建(u jin)重组体,分子。,d.终止序列包括转录终止子和转译终止子。,第五十五页，共62页。,8.克隆的真核基因(jyn)在大肠杆菌中表达,a.将外源基因的cDNA序列；,b.插入的片段保持正确的读码结构和正确的序列取向的条件下，克隆在大肠杆菌表达载体的适当的位点上；,c.置于原核启动子的控制下，从而能够在大肠杆菌细胞(xbo)中正确地转录和转译，并表达出所克隆的真核目的基因的蛋白质。,第五十六页，共62页。,9.基因工程(jyn gngchng)的应用,（1）植物基因工程在农业生产上的应用：a.提高农业生产的产量；b.改良 农作的品质；c.培育新的品种。,（2）基因工程在工业生产上的应用：a.纤维素的开发利用；b.乳制品的发酵；c.单细胞蛋白质的生产；d.酿酒工业上的开发。,（3）在医学卫生(wishng)上的应用：a.新药的开发和利用；b.遗传病的基因治疗；c.癌症的基因治疗；d.疾病个体化的症断与治疗；d.新疫苗的开发利用；e.新医药材料的开发利用。,（4）基因工程在环境卫生(wishng)上的应用：a.降解塑料等污染物质；b.农药污染的生物防治。,（5）基因工程在防空军事上的应用：基因高级材料研发和利用。,第五十七页，共62页。,第五十八页，共62页。,第五十九页，共62页。,第六十页，共62页。,谢谢(xi xie)大家 再见！,第六十一页，共62页。,第六十二页，共62页。,