12基因工程的基本操作程序1.pptx

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主要包括四个步骤：,（1）目的基因的获取,（2）,（3）将目的基因导入受体细胞,（4）目的基因的检测与鉴定,基因,表达载体,的构建,一、目的基因的获取,2、获取方法：,（1）从,基因文库,中获取目的基因；,（2）利用,PCR技术,扩增目的基因；,（3）通过DNA合成仪用化学方法直接,人工合成,。,1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的,基因,，也可以是一些具有,调控作用的因子,。,（一）从基因文库中获取目的基因,1.什么叫基因文库？,基因文库,基因组文库,部分基因文库,（如,cDNA,文库）,将含有某种生物,不同基因的许多DNA片断,，导入到,受体菌的群体,中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,（,1,）基因组文库的构建模式图,通过对,受体菌,的培养而储存基因,以目的基因转录成的,信使RNA,为模板，再,反转录酶,的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即,cDNA,，从而获得所需的基因。,（,2,）cDNA构建方法,-,反转录法,基因组,DNA,文库,cDNA,文库,（,3,）基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的构建,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA,聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，,RNA,聚合酶沿,DNA,分子移动，并以,DNA,分子的一条链为模板合成,RNA,。,转录完毕后，,RNA,链释放出来，紧接着,RNA,聚合酶也从,DNA,模板链上脱落下来。,启动子,：,位于基因,首端,的一段特殊的,DNA,片断，它是,RNA,聚合酶识别和结合的部位，有了它才能,驱动,基因转录出,mRNA,，最终获得蛋白质。,终止子,：是位于基因,尾端,的一段特殊的DNA片断，能,终止,mRNA的转录。,不能转录为信使,RNA,，不能,编码蛋白质。,：能转录相应的信使,RNA,，能,编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有,调控遗传信息表达的核,苷酸序列,，在该序列中，,最重要的是位于编码区上,游的,RNA,聚合酶结合位点,。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,补：真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：有,调控作用的核苷酸序列,，,包括位于编码区上游的,RNA,聚合酶结合位点,。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的,_ _,和具有调控作用的_,区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,基因组文库和部分基因文库的比较,文库类型,cDNA文库,基因组文库,文库大小,基因中启动子,基因中内含子,基因多少,物种间基因交流,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,基因表达的计算,在真核生物中，对应的是,的碱基数,DNA,mRNA,蛋白质,转录,翻译,631,氨基酸数,碱基数,？,补充资料,基因中外显子,思考：,如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列；,基因的功能；,基因在染色体上的位置；,基因的转录产物,mRNA,；,基因翻译产物蛋白质等特性。,注意：,基因文库,中不是直接保管相应基因，而是,保存受体菌,，菌中含基因。,（,1,）鸟枪法：,供体细胞中的,DNA,许多,DNA,片段,运载体,限制酶,与载体连接,受体细胞,产生特定性状,导入,外源,DNA,扩增,目的基因,分离,(,直接分离法,),多用于原核生物,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术。,多聚合酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,原理：,_,DNA,复制,前提条件：,_,；,有一段已知基因的核苷酸序列,（二）利用,PCR,技术扩增目的基因,变性、退火、延伸三步曲,变性：,加热至,90,95,双链,DNA,解链成为单链,DNA,退火：,冷却至,55,60,部分引物与模板的单链,DNA,的特定互补部位相配对和结合,延伸：,加热至,70,75,以目的基因为模板，合成互补的新,DNA,链,变性,退火,延伸,（二）利用,PCR,技术扩增目的基因,过程：,a,、,DNA,变性（,90-95,）：双链,DNA,模板,在,_,作用下，,_,断裂，形成,_,b,、退火（,复性,55-60,）：系统温度降低，引 物与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、延伸（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，从,引物的,5,端,3,端延伸，合成与模板互补,的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,高温,原料：,_,、,_,、,_,、,_,。,方式：以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循,环的次数）,结果：,四种脱氧核苷酸,DNA,引物,热稳定,DNA,聚合酶,指数,2,n,使目的基因的片段在,短时间内大量扩增,模板,DNA,PCR,的基本反应步骤,变性,90-95,C,延伸,70-75,C,退火,55-60,C,PCR,总结：,PCR,技术扩增与,DNA,复制的比较,PCR技术,DNA复制,相同点,原理,原料,条件,不同点,解旋方式,场所,酶,结果,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA,在,高温,下变性,解旋,解旋酶催化,体外,复制,细胞核内,热稳定的,DNA,聚合酶,细胞内的,DNA,聚合酶,大量的,DNA,片段,形成整个,DNA,分子,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的,mRNA,序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，,以单核苷酸为原料合成目的基因,。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,（三）化学方法人工合成目的基因,人工合成,(,基因比较小，核苷酸序列已知,),DNA,合成仪,从基因文库中获取,利用PCR技术扩增,利用化学方法人工合成,归纳：获取目的基因的方法,用一定的,_,切割,质粒，使其出现一个切,口，露出,_,。,用,_,切割目,的基因，使其产生,_,_,。,将切下的目的基因片段插入质粒的,_,处，,再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端或平末端,同一种限制酶,相同的黏性末端或平末端,切口,DNA,连接酶,1.,过程,:,二、构建,表达,载体,核心,质粒,DNA,分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同一种,过程,:,2.,构建,基因表达载体的目的,（,1,）使目的基因在受体细胞中,稳定存在,并可以,遗传给下一代,；,（,2,）使目的基因能够,表达和发挥,作用。,科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。,起初把苏云金芽孢杆菌的,抗虫基因,插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。,然后在插入抗虫基因的质粒中插入,启动子,(,抗虫基因首端,),，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入,终止子,(,抗虫基因末端,),，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料,:,3.,基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a,、目的基因,b,、启动子,c,、终止子,d,、标记基因,思考1：,表达载体为什么一定要有启动子？,（1）生物之间进行基因交流，,只有,使用,受体生物,自身基因的启动子才能有利于基因的表达；,（2）通过,cDNA文库,获得的,目的基因没有启动子,，只将编码序列导入受体细胞,无法转录,。,是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而,将有目的基因的细胞筛选,出来。,思考,3,：,标记基因有什么作用？,载体,与,表达载体,的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分,DNA,片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。,注意,用到的工具酶：,既用到,限制酶,切割载体，又用到,DNA,连接酶,将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。,启动子、终止子,对于目的基因表达必不可少。,目的基因不能单独进入受体细胞，,必需以表达载体的方式携带进去。,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,（一）转化：,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,（二）方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法（,最多,）,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca,2+,处理法,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,（,1,）农杆菌转化法,特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,Ti,质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并,整合,到受体细胞染色体的,DNA,上。,转化过程,:,Ti,质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,插入,植物细胞染色体,DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,基因枪法又称,微弹轰击法,，是,利用压缩气体产生的动力,，将包裹在金属颗粒表面的表达载体,DNA,打入受体细胞中,，使目的基因与其整合并表达的方法。,（,2,）基因枪法,适用于,单子叶植物,（,3,）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加,DNA,（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于,被子植物,2.将目的基因导入动物细胞,（1）方法：显微注射法,（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到,受精卵,中）,思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？,（,2,）操作程序,:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,常用法,：,常用菌,：,微生物作受体细胞原因：,过程：,Ca,2+,处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收,DNA,3.将目的基因导入微生物细胞,思考：为什么要用,Ca,2+,处理受体细胞？,用,Ca,2,处理，增加细菌细胞膜的通透性,Ca,2+,处理,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,一定,温度,重组表达载体,DNA,溶于缓冲液,受体生物,植物,动物,微生物,受体细胞,导入方法,受精卵,体细胞,受精卵,细胞,/,个体,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注,射技术,用,Ca,2+,处理成感受态细胞,归纳：,四、目的基因的检测与鉴定,分子检测:,是否插入目的基因,是否转录,是否翻译,鉴定:,个体生物学水平鉴定,1,、检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,首先取出转基因生物的基因组,DNA,；,（,1,）方法,:,DNA,分子杂交,（,DNA-DNA),（,2,）过程,:,将含目的基因的,DNA,片段用放射性同位素等作标记,以此做,探针,；,使探针和,基因组DNA杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体,DNA,中。,（一）检测,2,、检测目的基因是否转录出了,mRNA,3,、检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法,:,分 子 杂 交,(mRNA-DNA),方法,:,抗原,-,抗体杂交,过程,:,用上述探针和转基因生物的,mRNA,杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,。,过程,:,从转基因生物中提取蛋白质，用,相应的抗体,进行,抗原,-,抗体杂交，若出现杂交带,表明目的基因已形成蛋白质产品。,若不能表达，要对抗虫基因再进行,修饰,。,怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？,没有抗虫基因,的棉植株,有抗虫基因的棉植株,棉铃虫,虫没有死,虫被杀死,没有表达,目的基因表达,（二）鉴定（个体生物学水平）,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,类型,步骤,检测内容,方法,结果显示,分子检测,第一步,是否成功显示出杂交带,第二步,是否成功显示出杂交带,第三步,是否成功显示出杂交带,个体水平鉴定,包括抗虫、抗病的,接种实验,，以确定是否有抗性以及抗性的程度；,基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。,目的基因的表达和检测,转基因生物的,DNA,上是否插入目的基因,DNA,分子杂交,（,DNA,和,DNA,之间）,目的基因是否转录出,mRNA,分子杂交技术,（,DNA,和,mRNA,之间）,目的基因是否翻译出蛋白质,抗原,抗体杂交,提示：,DNA,分子杂交技术首先提取转基因生物的,DNA,，然后高温或提高,pH,解成单链，再与同位素标记的,DNA,探针杂交,；,抗原抗体杂交所用到的,抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出来的。,归纳:,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,Ca,2+,处理,（微生物）、,农杆菌转化法,（植物）、,显微注射法,（动物）,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,个体生物学水平的鉴定,思考：,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。,因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，,还需要有其他控制元件,，如启动子、终止子和标记基因等。,必须构建上述元件的,主要理由,是：,（,1,）生物之间进行基因交流，只有使用,受体生物自身基因,的启动子才能比较有利于基因的表达；,（,2,）通过,cDNA,文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（,3,）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（,4,）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子,（,增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置,(,上游或下游,),上都发挥作用。,）,等；,（,5,）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,1、为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过,PCR,方式从含有该基因的生物的,DNA,中，直接获得，也可以通过反转录，用,PCR,方式从,mRNA,中获得，不一定要构建基因文库。,但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,2 根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能导入单子叶植物的原因吗,?,若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做,?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；,要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的基因，使,T-DNA,转移并插入到染色体,DNA,上。,酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中,3、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,4.-,珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的,-,珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,（,1,）从小鼠中克隆出,-,珠蛋白基因的编码序列（,cDNA),。,（,2,）将,cDNA,前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。,（,3,）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明,-,珠蛋白基因已进入其中。,（,4,）培养进入了,-,珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取,-,珠蛋白。,演讲完毕，谢谢观看！,