仪器分析-第三章高效液相色谱分析.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章,高效液相色谱分析,基本要点：,1,、了解高效液相色谱法的优点及适用范围；,2,、了解高效液相色谱仪的主要部件及高效液相色谱法基本流程；,3,、理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围；,4,、理解各种分离方式的原理及选择原则。,第一节 概述,以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（,HPLC,）。,液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。,HPLC,是在经典液相色谱法的基础上，于,60,年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法。又因分析速度快而称为高效液相色谱法。,二、,HPLC,的特点和优点,1,、,HPLC,特点：,（,1,）高压,-,压力可达,150,300Kg/cm2,。色谱柱每米降压为,75Kg/cm,2,以上。,（,2,）高速,-,流速为,0.1,10.0ml/min,。,（,3,）高效,-,可达,5000,塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达,100,种。,（,4,）高灵敏度,-,紫外检测器灵敏度可达,0.01ng,。同时消耗样品少。,2,、,HPLC,与经典液相色谱相比有以下优点：,（,1,）速度快,-,通常分析一个样品在,15,30min,，有些样品甚至在,5min,内即可完成。,（,2,）分辨率高,-,可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。,（,3,）灵敏度高,-,紫外检测器可达,0.01ng,，荧光和电化学检测器可达,0.1pg,。,（,4,）柱子可反复使用,-,用一根色谱柱可分离不同的化合物。,（,5,）样品量少，容易回收,-,样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。,三、,HPLC,与,GC,比较,HPLC,的保留值等色谱分析有关术语以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性以及所用基本理论（塔板理论与速率理论）与,GC,一致。但,HPLC,由于自身的一些特点，与,GC,比还是有一定差别，主要有以下几方面：,1,、应用范围不同,GC,：,适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的,20%,。,HPLC,：,适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的,80%,。,GC,：,流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。,2,、流动相不同,HPLC,：,流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和,pH,值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选项择性。,3,、操作条件不同,GC,：,加温操作。,HPLC,：,室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。,1,、涡流扩散项,H,E,H,E,=A=2d,p,式中,为填充不均匀因子，当固定相为,40,50,m,时,值为,1,2,；,d,p,为填充固定相的平均粒径，颗粒小时，可降低,A,。,2,、分子扩散项,H,L,式中，,r,为柱中填料间的弯曲因子,(,r,0.6,),；,D,M,为溶质在液体流动相中的扩散系数,(,D,M,10,-5,cm,2,/s,),；,u,为液体流动相在填充柱中的平均线速,(,cm,s,),。,由于,D,M,数值很小，因此,H,L,项对总板高的贡献也很小，在大多数情况下可假设,H,L,0,。,3,、传质阻力项,C u,可分为固定相传质阻力项,Hs,和流动相传质阻力项。,（,1,）固定相传质阻力项,Hs,对液液色谱可表示为：,式中：,q,为常数,q,=2/3,（对均匀液膜，对大孔固定相,q,=1/2,，对球形非多孔固定相,q,=1/30,）；,k,为容量因子；,d,f,为固定液液膜厚度；,D,L,为溶质在固定液中的扩散系数，,cm,2,/,s,；,u,为液体流动相在柱中的平均线速，,cm/s,。,对液固色谱可表示为：,式中：,t,a,为样品分子在液体流动相中的平均停留时间；,t,d,为样品分子被吸附在固定相表面的平均停留时间；,k,、,u,同前。,(2),流动相传质阻力项,又分为移动流动相的传质阻力项,H,MM,和滞留流动相的传质阻力项,H,SM,移动流动相的传质阻力对板高的贡献可表示为：,式中，,为色谱柱的填充因子，对短的、内径粗的柱子,数值较小；,d,p,为固定相的平均粒径；,D,M,为溶质在液体流动相中的扩散系数,(,D,M,10,-5,cm,2,/s,),；,u,同前。,滞留流动相的传质阻力对板高的贡献可表示为：,式中，,为孔洞中滞留流动相在总流动相中占有的百分数；,r,0,为颗粒内部孔洞的弯曲因子；,k,、,d,p,、,D,M,、,u,同前。,二、范第姆特方程的表达,在高效液相色谱中，对液液分配色谱，范第姆特方程的完整表达形式为：,简化表达式为：,三、方程的讨论,HPLC,与,GC,的,H-u,曲线比较：,1,、在,HPLC,中，由于使用固定相与流动相与,GC,不同，,H-u,曲线的最低点远低于,GC,。,2,、,HPLC,中，流动相粘度远远,4,、由低的,u,opt,值可看出,H-u,曲线具有平稳的斜率，表明采用高的液体流动相流速时，色谱柱效无明显的损失，这也是,HPLC,的快速分离的基础。,3,、由低的,H,min,值可看出，,HPLC,色谱柱要比,GC,填充柱有更高的柱效。,高于气相色谱，纵向扩散对峰型的影响很小。,5,、在,u,等于或稍大于,u,opt,时，速率方程中的分子扩散项,B/u,较小，可以忽略不计，而只有两项，因而范第姆特方程的形式为：,H A+C u,从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：,进样时间要短。,填料粒度要小。,改善传质过程。,过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。,适当的流速。,以,H,对,u,作图，则有一最佳线速度,u,opt,，在此线速度时，,H,最小。一般在液相色谱中，,u,opt,很小（大约,0.03,0.1mm/s,），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在,1mm/s,的条件下操作。,较小的检测器死体积。,第三节 高效液相色谱仪,典型的高效液相色谱仪是由,高压输液系统,、,进样系统,、,分离系统,、,检测系统,和,色谱数据处理系统,（色谱工作站）五个基本部分和相关辅助部件构成。,一、高压输液泵及梯度洗脱装置,1,、高压输液泵,高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。,基本要求：,流量稳定，其,RSD,应,0.5%,，这对定性定量的准确性至关重要；流量准确可调，,0.1,10ml/min,，输出压力高，一般应能达到,150,300kg/cm,2,；液流稳定，无脉动；死体积小，要求小于,0.5ml,。密封性能好，耐腐蚀。,泵的使用及注意事项：,防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接砂滤棒。,流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。,因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇,-,水）。,2,、梯度洗脱装置,梯度洗脱类似,GC,的程序升温。是使流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子，并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆满的选择性分离。,泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。,输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。,流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，,泵就无法正常工作。,内梯度：,利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,外梯度：,一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：,要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。,梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。,混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。,每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让,1030,倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。,二、进样装置,通常使用耐高压的六通阀进样装置。,六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种：,用部分装液法,进样量应不大于定量环体积的,50%,（最多,75,），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。,用完全装液法,进样量应不小于定量环体积的,5,10,倍（最少,3,倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。,六通阀使用注意事项：,样品溶液进样前必须用,0.45nm,滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。,转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏,。,为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。,三、色谱柱,色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。,柱效以理论塔板数计，大约可达,5,16,万,/m,。对于一般的分析只需,5000,塔板数的柱效；对于同系物分析，只要,500,即可；对于较难分离物质对则可采用高达,2,万的柱子，因此一般,10,30cm,左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。,柱子内径一般为,1,6 mm,。常用的标准柱型是内径为,4.6,或,3.9 mm,，长度为,15,30 cm,的直形不锈钢柱。填料颗粒度,5,10 m,。,发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。,避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，进样时阀的转动不能过缓。,应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。,一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。,选择使用适宜的流动相（尤其是,pH,），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶,“,饱和,”,，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。,避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。,经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。,在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的,20,倍左右，即常规分析需要,50,75ml,。,四、检测器,作用：用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。,目前最常用的检测器主要,有：,紫外,-,可见检测器,荧光检测器,示差折光检测器,电化学检测器,质谱检测器,1,、紫外吸收检测器,紫外吸收检测器是目前,HPLC,中应用最广泛的检测器。它灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱，它要求被检测样品组分有紫外吸收，使用的洗脱液无紫外吸收或紫外吸收波长与被测组分紫外吸收波长不同，在被测组分紫外吸收波长处没有吸收。,光源,检测室,光栅,二极管阵列检测器,2,、荧光检测器,是一种高灵敏度、有选择性的检测器，可检测能产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物，再进行荧光检测。其最小检测浓度可达,0.1,ng,ml,，适用于痕量分析；一般情况下荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高,2,个数量级，但其线性范围不如紫外检测器宽,。,荧光检测器结构示意图,光源,检测器,滤光片,检测室,3.,示差折光检测器,是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高，在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。,对所有溶质都有响应，某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差检测器检测。,电化学检测器主要有安培、极谱、库仑、电位、电导等检测器，属选择性检测器，可检测具有电活性的化合物。目前它已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医药等的测定中获得了广泛的应用。其中，电导检测器在离子色谱中应用最多。,电导仪,电极,电极,电导检测器,4,、电化学检测器,5,、与检测器有关的故障及其排除,（,1,）流动池内有气泡,如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状,峰,，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的办法除去气泡（最好不连接色谱柱）；或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多，以免流动池破裂。,（,2,）流动池被污染,无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用,1mol/L,硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。,（,3,）光源灯出现故障,紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。,（,4,）倒峰,倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的。,第三节 液相色谱分离原理,高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、,液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。,1,、液固色谱法,使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度,5,0,m,。,适用于分离分子量,200,1000,的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。,2,液液色谱法,使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，,分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。,分离过程是一个分配平衡过程。,涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如,C18,、,C8,、氨基柱、氰基柱和苯基柱。,液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法,(NPC),和反相色谱法,(RPC),。,正相色谱法：,采用极性固定相,(,如聚乙二醇、氨基与腈基键合相,),；流动相为相对非极性的疏水性溶剂,(,烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。,常用于分离中等极性和极性较强的化合物,(,如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。,反相色谱法：,一般用非极性固定相（如,C,18,、,C,8,）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。,适用于分离非极性和极性较弱的化合物。,RPC,在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个,HPLC,应用的,80%,左右。,随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的,pH,值。,正相色谱法与反相色谱法比较,正相色谱法 反相色谱法,固定相极性高中中低,流动相极性低中中高,组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出,从上面可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。,3,、离子交换色谱法,固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理,是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。,缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的,pH,值和离子强度影响。,pH,值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。,离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。,4,、离子对色谱法,是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。,分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。,分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。,离子对色谱法常用,C,18,，流动相为甲醇,-,水或乙腈,-,水，水中加入,3,10mmol/L,的离子对试剂，在一定的,pH,值范围内进行分离。被测组分保留时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其,pH,值、离子强度有关,。,5,、排阻色谱法,固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。,第四节,HPLC,固定相,上节讲了高效液相色谱法的主要类型及其分离原理，本节介绍一下各种类型液相色谱所用的固定相。,一、液,液色谱法及离子对色谱法固定相,与,GLC,类似，,LLC,的固定相也是在担体上涂渍一层固定液构成，或使用化学键合相。,1,、担体,所用的担体可分为如下几类：,(1),全多孔型担体：,HPLC,早期使用的担体与,GC,类似，是颗粒均匀的多孔球体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的,100,m,全多孔型担体。,其缺点是,：,填料的不规则性和较宽的粒度范围会导致填充不易均匀，柱效低；填料孔径分布不一，并存在“裂隙”在填料深孔中形成滞留液体（液坑），溶质分子在深孔中扩散和传质慢，使色谱峰变宽，柱效下降。,HPLC,在,20,世纪,70,年代初开始使用,10m,全多孔型担体，它是由,nm,级的硅胶微粒堆积而成,为,5m,或稍大的全多孔小球。,其优点是：,颗粒小而均匀，传质快（距离短），柱效高。,(2),表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）：,它是直径为,30,40m,的实心核,(,玻璃微珠,),，表层上附有一层厚度约为,1,2m,多孔表面,(,多孔硅胶,),。,其优点是：,孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快，易于填充均匀，柱效高。,其缺点是：,柱子容量低、需要配用高灵敏检测器。这种担体目前应用较为普遍。,2,、固定液,液,液色谱流动相和固定相都是液体，因此要求两相要互不相溶。在液,-,液色谱中常用的固定也只有极性不同的几种，如,，,-,氧二丙腈、聚已二醇,-400,和角鲨烷等。,3,、化学键合固定相,将固定液机械的涂在担体表面上构成的这种固定相，在实际使用时存在不少缺点，,20,世纪,60,年末发展起来了一种新型的固定相,-,化学键合固定相。,即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面。根据在硅胶表面,(,具有,Si,OH,基团,),的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型,(Si,O,C),；硅氧硅碳键型,(Si,O,Si,C),硅碳键型（,Si,C,）和硅氮键型（,Si,N,）四种类型。,化学键合固定相具有如下一些特点：,表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；,无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；,可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析；,有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。,二、液固吸附色谱法固定相,采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。,三、离子交换色谱法固定相,1,、薄膜型离子交换树脂,即以薄壳玻璃珠为担体，在它的表面涂约,1%,的离子交换树脂而成。,2,、离子交换键合固定相,用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体（如微粒硅胶）表面。,树脂类别：,（,1,）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）；,（,2,）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）。,四、排阻色谱法固定相,1,、软质凝胶：,如交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用于水为流动相，在常压下使用。,2,、半硬质凝胶：,如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶（交联聚苯乙烯凝胶），是应用最多的有机凝胶，适用于非极性有机溶剂。,3,、硬质凝胶：,如多孔硅胶、多孔玻璃等，多孔硅胶是用得较多的无机凝胶。,化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。,近年来发展起来的可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。用它做固定相，色谱柱易填充均匀；柱压、流动相流速、,pH,值或离子强度对分离的影响小，适用于较高流速下操作。,第五节,HPLC,流动相,在气相色谱中，载气是惰性的（与组分分子之间的作用力可忽略不计），常用的只有三四种，他们的性质差异也不大，所以要提高柱子的选择性，只要选择合适的固定相即可。但在液相色谱中，当固定相选定后，流动相的种类、配比能显著的影响分离效果，因此，流动相的选择也非常重要。,选择流动相（又称为：淋洗液，洗脱剂）时应注意下列几个因素。,(1),流动相纯度：,防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,(2),避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。,如在液,-,液色谱中，流动相应与固定液互不相溶，否则，会使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,(3),对试样要有适宜的溶解度：,试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,(4),溶剂的粘度小些为好：,否则，会降低试样组分的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。,(5),应与检测器相匹配：,例如，当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液,-,液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在,低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。,常用溶剂的极性顺序：,水,(,最大,),甲酰胺,乙腈,甲醇,乙醇,丙醇,丙酮,二氧六环,四氢呋喃,甲乙酮,正丁醇,乙酸乙酯,乙醚,异丙醚,二氯甲烷,氯仿,溴乙烷,苯,四氯化碳,二硫化碳,环己烷,己烷,煤油,(,最小,),。,除此之外，在选择溶剂时，溶剂的极性是最重要的依据，有时还需要采用二元或多元组合溶剂作为流动相，以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。选择时要参阅有关手册，并通过实验确定。,第六节 色谱分离方法的选择,要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。,选择色谱分离方法的主要根据是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。,1,、相对分子质量,对于相对分子质量较低（一般在,200,以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在,200,2000,的化合物，可用液固吸附、液,-,液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于,2000,，则可用空间排阻色谱法。,2,、溶解度,水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液,-,固色谱法。,3,、化学结构,若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分,配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。,第七节 高效液相色谱仪应用实例,气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于,400,以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的,75%,80%,）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占,20%,，而能用液相色谱分析的约占,70,80%,。,1.,环境中有机氯农药残留量分析,固定相：薄壳型硅胶,(37,50m),流动相：正己烷,流速：,1.5mL/min,色谱柱：,50cm2.5mm(,内径,),检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,2,、稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相：十八烷基硅烷化键合相,流动相：,20%,甲醇,-,水,100%,甲醇；线性梯度淋洗，,2%/min,流速：,1mL/min,柱温：,50C,柱压：,70104Pa,检测器：紫外检测器,3,、阴离子分析,双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱,(3250mm),流动相：,0.003molL,-1,NaHCO,3,/0.0024molL,-1,Na,2,CO,3,，流量：,138mL/hr,。,七种阴离子在,20,分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在,3,50ppm,。,作业：,P,109,页,1,、,2,、,3,、,4,、,5,、,6,、,8,、,9,、,10,、,11,、,12,。,