各类干细胞应用特点研究比较.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,干细胞研究的重要性：,美国,Science,杂志,1999,年,将“干细胞研究的新发现”列入十大科技进展之首,2000,年,再次入选年度十大科技进展,2002,年,列入值得关注的六大科技领域之一,至今,干细胞各领域的研究飞速发展,美国加州,每年提供干细胞研究经费达,3,亿,美元,我国有关干细胞的研究也十分活跃，已有多个有关干细胞的“,973”,项目，召开过多次全国性或国际性学术会议，出版过多本专（译）著。“,863”,计划近期将为干细胞研究提供,2,亿,元人民币的经费。,干细胞治疗的特点,1.,一次性介入，永久性治疗；,2.,不需要完全了解疾病发生的确切机理；,3.,可应用于自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。,（,2,）转录因子的调控,在胚胎干细胞的发生中，转录因子,Oct4,是必需的。,Oct4,是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是,FGF-4,等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。,Oct4,缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团,白血病抑制因子（,LIF,）,Tcf/Lef,转录因子,外源性调控,干细胞的分化还可受到其,周围组织,及,细胞外基质,等外源性因素的影响,（,1,）分泌因子,间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活,.,有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是,TGF,家族和,Wnt,信号通路。,干细胞的分化还可受到其,周围组织,及,细胞外基质,等,外源性因素的影响,（,1,）膜蛋白介导的细胞间的相互作用,有些信号是通过细胞,-,细胞的直接接触起作用的。,-Catenin,就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。穿膜蛋白,Notch,及其配体,Delta,或,Jagged,也对干细胞分化有重要影响,.,干细胞的分化还可受到其,周围组织,及,细胞外基质,等外源性因素的影响,（,3,）整合素（,Integrin,）与细胞外基质,整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。,1,整合素,干细胞的分类及特点：,胚胎干细胞,成体干细胞,诱导分化干细胞（iPS）,，可诱导分化为机体,胚胎干细胞,成体干细胞,来自胚泡的内细胞群,来源于骨髓、外周血、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、齿髓、肝、皮肤、胃肠道粘膜层和胰腺等,发育全能性，可诱导分化为机体,分化较局限，部分成体干细胞（造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞）有一定跨系、跨胚层的“可塑性”,无限的自我更新能力,病理条件下才显出一定的自我更新潜能,增殖能力强，便于应用,增殖能力较弱，故不能完全取代胚胎干细胞,细胞可不断增殖，“永生化”，移植后有形成肿瘤的可能性,成瘤的可能性很小,不能自体移植,自体移植可避免免疫排斥,有伦理问题,分离和使用不存在伦理问题,胚胎干细胞,衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；,永生化,(immortal),；,能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；,有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；,能参与胎儿所有组织的发育过程；,胚胎干细胞的性质,胚胎干细胞系的建立过程,ES,细胞研究的趋势,改善,ES,细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得,ES,细胞的方法。,定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病的治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题。,成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较，,成体干细胞能否替代胚胎干细胞？,胚胎干细胞的特点,增殖速度,：,18,24h,分裂增殖一次,hES,必须在含有白血病抑止因子（,LIF,）的培养基及成纤维细胞饲养层,(freeder cell),条件下才能保持繁殖而不分化。,hES,体外培养要解决的关键问题是维持细胞的分裂增殖而抑止其分化。,具有分化形成外、中、内三个胚层的潜能。,能形成嵌合体动物，从而成为联系细胞和个体之间的桥梁。,鉴定,：,人胚胎干细胞特异表面抗原的表达,胚胎阶段特异性抗原,:,SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4,Thmoson,分离的,hES,阴性 弱阳性 强阳性,Gearhart,分离的,hES,阳性 弱阳性 阳性,小鼠,ES,阴性 阴性 阳性,鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。,Gearhart,等认为,SSEA-1,阳性,可能是源于原始生殖细胞的多能干细胞分化的标志,.,细胞膜表面有特殊的标记：,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,a,胚胎干细胞具有正常稳定的二倍体核型和带型。,b,胚胎干细胞具有较高的,端粒酶活性,及,碱性磷酸酶,的表达。,人胚胎干细胞系端粒酶活性都很高，说明其可在体外未分化状态进行长期培养。,鉴定,.,具有转录因子,Oct-4,的表达,Oct-4,只限定在多潜能细胞中表达。,人和小鼠的胚胎干细胞都表达转录因子,Oct-4,，当胚胎干细胞分化时，其表达能力大大降低。,Oct-4,可能是哺乳动物不同发育阶段多潜能细胞所特有的少数特异的调控分子之一。,胚胎干细胞鉴别鉴别,不被,Hoechst33342,和,Rhodamine123,染色,能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植,入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤,可诱导分化为各种成体干细胞,注：人胚胎干细胞具有自我更新和多潜能的特性，以及以下一些特征：,1,）可以从囊泡的内细胞团中分离出来；,2,）在体外的增殖力非常强；,3,）在继代的培养过程中保持正常的多倍体核型；,4,）可以分化为三个胚层的细胞；,5,）具有端粒酶活性,内细胞群的细胞,可以发育成除了胎盘以外的完整个体，因而这些细胞被认为具有,全能性,。,胚胎干细胞的优点,全能性,1.ES,细胞的,全能性,主要体现在以下几方面：,形成畸胎瘤。将,ES,细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；,形成类胚体。培养,ES,细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目。能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、具有三个胚层组织；,直系分化。通过控制,ES,细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，,ES,细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因,NeuroD2,和,NeuroD3,转人,ES,细胞，可使之分化为神经细胞；,形成嵌合体。将,ES,细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（,chimera,），,ES,细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为,ES,细胞的标准。,ES,细胞生物学特性,细胞形态结构及核型,细胞的高度分化潜能,碱性磷酸酶的表达,胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达,1.,各种动物的,ES,细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。,2.ES,细胞与卵圆柱期（,egg cylinder stage,）胚胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似，而与,ICM,细胞有差异。,3.,细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。正常,ES,细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。,4.ES,细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个,ES,细胞和分化的扁平状上皮细胞。,5.ES,细胞增殖迅速，每,1824 h,分裂增殖,1,次。,6.,此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。,1,、,ES,细胞形态结构及核型,2,、,ES,细胞的高度分化潜能,ES,细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点,1.ES,细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。,2.,在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，,悬浮培养中：“简单类胚体”,“囊状胚体”,细胞分化物。,3.ES,细胞可进行诱导分化,*用,RA,（维生素,A,酸或视黄酸）作诱导,90,以上的,ES,细胞分化为神经胶质细胞。,*聚集培养的,ES,细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。,*将,ES,细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表,3,个胚层细胞。,*用,ES,细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。,3.,碱性磷酸酶的表达,许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（,AKP,）表达，小鼠的,EC,细胞和,ES,细胞中均含有丰富的,AKP,。而在已分化的,EC,细胞和,ES,细胞中,AKP,呈弱阳性或阴性。猪、兔的,桑椹,胚和早期囊胚,AKP,呈阳性。因此，,AKP,常用来作为鉴定,EC,细胞或,ES,细胞分化与否的标志之一。,4,、胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达,早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（,SSEA,1,）。在胚胎的原始外胚层细胞、,ES,细胞、,EC,细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到,SSEA,1,的表达。小鼠,SSEA,1,的表达自,8,一细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚,ICM,细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分,ICM,呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，,SSEA,也常作为,ES,细胞鉴定的一个标志。,ES,细胞的应用前景,（,1,）,ES,细胞在动物克隆及人类治疗性克隆中的应用,（,2,）在转基因动物中的应用,（,3,）制备嵌合体动物,ES,研究面临的难题,1,、体外培养,ES,细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态。如何平衡这一对矛盾,必须筛选适宜的培养条件。目前在,ES,细胞研究中存在着建系成功率也不高等问题,只在小鼠中建立了稳定的,ES,细胞系，家畜、人类细胞系建立的最佳条件仍无定论。,2,、,ES,细胞高度未分化,具有形成畸胎瘤的可能性,因此在使用,ES,细胞进行治疗前必须首先体外诱导,ES,细胞分化产生某种特异的组织细胞或设计自杀基因,当移植的细胞向肿瘤发展时,自杀基因能启动自毁机制使其凋亡。但如何诱导,ES,细胞定向分化成单一类型的分化细胞,是至今仍未解决的难题。因此，必须寻找各种细胞定向诱导分化的条件和方法，以及不同干细胞的表面标志和分选技术，从而得到所需要的细胞或组织。,3,、,ES,细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程,很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。即便是发育完整的来自自然机体的器官,要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到,器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。,4,、最大的障碍来自于伦理学问题，特别是,ES,细胞应用受到伦理、法律、宗教以及社会因素的强烈反对，有些国家甚至明令禁止进行人类,ES,细胞研究。无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看，人类,ES,细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响，但随着观念的改变，人们会逐渐认识到,ES,细胞对临床医学及生物学理论研究的重要作用。,WASHINGTON The US National Institutes of Health(NIH)could provide funding for research,on human embryonic stem cells as early as the,spring if new guidelines,published by the NIH,last week after widespread public consultation,are formally approved.,Nature 402,566(1999),TOKYO,Japans cloning ban will still allow stem,cell experiments,Nature 404,321(2000),LONDON European panel rejects creation of,human embryos for research,Nature 408,277(2000),伦理学问题：,Stem cell research quidline,DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES,Public Health Service,National Institutes of Health,National Institutes of Health Guidelines for Research Using,Human Pluripotent Stem Cells,SUMMARY,:,The National Institutes of Health(NIH)is hereby publishing,final National Institutes of Health Guidelines for Research Using,Human Pluripotent Stem Cells.The Guidelines establish,procedures to help ensure that NIH-funded research in this,area is conducted in an ethical and legal manner.,另外，利用胚胎干细胞进行克隆性治疗在目前尚受到多方面的限制,胚胎干细胞诱导分化的条件及分化成熟的鉴定标准尚不成熟，人们对如何避免分化不完全的胚胎干细胞在体内导致,畸胎瘤,的危险性仍不清楚,人,ESC,用于临床的疾病治疗短期内将难以实现,解决胚胎来源有限的途径：,未成熟卵的体外成熟,（,1,）,Knock-out,胚胎干细胞的组织相,容性抗原,（,2,）,Knock-in,受者的组织相容性抗原,（,3,）与同一来源的造血干细胞一同移植,（,4,）受者的体细胞核移植,避免免疫排斥的方法,分离、纯化：,随着对胚胎干细胞研究的进展，分离、纯化技术得到较好的解决。,伦理学问题的解决：,诱导产生多能性干细胞（,IPS,）的研究，充分解决了胚胎干细胞所面临的伦理学问题。,诱导产生多能性干细胞的研究,细胞重编程的研究概况,核移植：,核移植试验最初是在两栖动物中实现的，通过将体细胞核注入到去核卵母细胞中，但,具有很大的局限性,。,将成熟的体细胞与多潜能的细胞（,ES,细胞、胚胎癌细胞等）融合，或者用胚胎干细胞提取物来处理体细胞，也可以在一定程度上使体细胞发生重编程。但面临许多伦理学问题。,有没有相对简单，又可摆脱材料来源和伦理学诸多限制，重编程的效率和程度都十分可观的新方法呢？,2006,年,11,月,20,日，日本京都大学的山中伸弥（,Shinya Yamanaka),和美国威斯康星大学的詹姆斯,汤姆森（,James Thomson,）分别在,细胞,和,科学,杂志上发表重量级论文，宣布他们用基因改造的手段，将人类体细胞改造成了类胚胎干细胞，在功能上几乎可以和胚胎干细胞相媲美。,诱导产生多能性干细胞：,几个转录因子导入已分化的细胞，进而获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，称之为“诱导产生的多功能性干细胞”（,induced pluripotent stem cells,iPS,细胞）。,方法：,借助“逆转录酶病毒”为载体,即向皮肤细胞中植入一组,4,个基因,(Oct4,Sox2,c-myc,和,Klf4),，通过基因重新编排，使皮肤细胞具备胚胎干细胞的功能。这种被改造过的细胞称作“,iPS,细胞”。,优越性：,1,、利用,iPS,细胞作为实验模型，只操纵几个因子的表达，加速对多能性调控机理的深入研究。,2,、获得的方法相对简单稳定，不涉及胚胎的破坏，无伦理道德限制。,3,、对于疾病机理研究和新药开发等方面将有很大贡献。,4,、可望制造特定病人来源的,iPS,细胞，用“个性化”移植来治疗诸多疾病。,iPS,细胞检测,-hES,标记,表現,Sell-specific surface antigens(,Adewumi,et al.,2007),iPS,细胞检测,-hES,标记,表現,stage-specific embryonic antigen-1(SSEA-1),Ips,细胞研究中,存在的问题,1,、肿瘤相关基因，如,c-myc,的使用，有诱发癌症的可能。,2,、逆转录病毒转染可能会导致一些癌基因的激活，也可能导致某些重要基因功能受阻。,3,、基因表达模式与,ESC,还存在一些不同。,4,、效率较低，重组率只有,0.1%,。,存在的问题,IPS,细胞与,hES,细胞的,DNA,分析结果显示两者之间仍有差异存在,.,效率不高：,1/5103 cells,挑选出的细胞群落参杂有,HDF,反转录病毒随机插入而抑制相关基因,一些没有被核型分析检测到的基因改变,反转录病毒随机插入可能会诱发癌症,iPS,细,胞形成畸胎瘤,內胚層,中胚層,中胚層,外胚層,外胚層,中胚層,iPS,细,胞形成畸胎瘤,In vivo,：,将,iPS,细胞,胞注射至,严重,免疫,缺陷综合症,(SCID),小鼠的背側皮下,。,九,周后,：,产生肿瘤,组织学检测,：,肿瘤,中含有各式各,样,的,组织,Teratoma,：畸胎瘤包含有器官或是,组织的肿瘤,，,类似,三個,胚层,的衍生物。,IPS,细胞,插入,基因,检测,PCR,显示每个中都有插入,四个逆转录病毒,IPS,细胞非污染的,产,物,免疫印迹,分析，以,c-Myc cDNA,为,探針,由,逆转录病毒,的,c-Myc,內生性的,c-Myc,IPS,细胞与,hES,细胞的,DNA,分析结果显示两者之间仍有差异存在,效率不高：,1/5103 cells,挑选出的细胞群落参杂有,HDF,反转录病毒随机插入而抑制相关基因,一些没有被核型分析检测到的基因改变,反转录病毒随机插入可能会诱发癌症,成体干细胞是存在于成体动物的许多组织和器官，具有修复和再生的能力的细胞。,成体干细胞大多数时候处于静息状态。,在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。,成体干细胞（,adult stem cell,，,ASC,）,各类成体干细胞：,干细胞名称,Stem cell niche,干细胞标志,分化细胞标志,分化促进因子,神经祖细胞,神经干细胞,侧脑室室管膜细胞,巢素蛋白,CD133,微管结合蛋白,-2,神经胶质原纤维酸性蛋白,GFAP,表皮生长因子,成纤维细胞生长因子,表皮干细胞,毛囊干细胞,基底细胞,角蛋白,15,K5,、,K14,Wnt,肠干细胞,肠腺基部及近基部,K8,、,K18,、,K19,肝干细胞,Hering,管,门管区胆管周围,卵圆细胞：,OV-6,、,c-kit,、,CD34,、,AFP,小肝细胞：,间充质干细胞,骨髓窦的内腔面,SH2,、,SH3,、,CD29,、,CD44,、,CD71,、,CD99,、,CD106,、,CD124,、,CD120a,、,多种组织标志,（如骨形态发生蛋白受体,-BMPR,）,多种诱导因素,造血干细胞,骨髓、脐带血、外周血,成体干细胞的优点,成体干细胞则可从患者自身获得，不存在组织相容性的问题。,成体干细胞不会诱发畸胎瘤的发生。,成体干细胞也不存在伦理学争执。,成体干细胞的不足,尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞,.,成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而降低,在一些遗传缺陷疾病中，遗传错误很可能也会出现于病人的干细胞中，这样的干细胞不适于移植,成人身上获得的干细胞可能没有年轻人的干细胞那样的增殖能力,由于日常生活中人是暴露在各种环境之下，日光和毒素等都有可能造成基因突变，成体干细胞可能包含更多的,DNA,异常。,没有证据表明成体干细胞是多能干细胞,成体干细胞稀少，难以识别与纯化，也难以在培养条件下在未分化状态保持长时间增殖，或能够保持长时间增殖时，又不定向分化。,骨髓间充质干细胞（,Mesenchymal stem cells,MSC,）,骨髓间充质干细胞，是骨髓中除造血细胞以外的中胚层来源的细胞，其细胞特性稳定，在连续传代培养和冻存后仍具有多向分化潜能。,是干细胞的一种，具有干细胞的共性，即自我更新及多向分化的能力。最初是由,Alexander Friedenstein,发现，且证明其在体外分化成為硬骨骼及脂肪细胞，后续有其他的研究团队发现，此类干细胞更可以分化成为肝脏、软骨、肌肉等组织细胞，,2002,年一月由美国明尼苏达大学,(,University of Minnestoa,),研究人员发表的成果，发现 更可以分化成为神经系统的细胞。,在特定的诱导条件下，骨髓间充质干细胞可以分化为间充质组织中的各类细胞，包括：骨、软骨、脂肪、肌腱、韧带等细胞。,骨髓间充质干细胞：特点,可经诱导向软骨细胞分化，并能分泌特异性,型胶原基质，因此可望成为工程化软骨的种子细胞；,分化为肌细胞，可能成为肌萎缩、肌营养不良时促进肌组织再生的靶细胞；,与基因治疗结合，可强化治疗效果,，对某些基因突变所致的遗传性疾病；,可分离其自体的间充质干细胞，体外进行改造，敲除突变基因，导入正常基因，然后重新输入体内，既纠正了遗传缺陷，又避免发生移植反应。,原代培养15天的人骨髓间充质干细胞 （4倍）,人骨髓间充质干细胞传代后经过,14,天诱导分化形成的成骨细胞碱性磷酸酶阳性呈紫红色,40,X,人骨髓间充质干细胞传代后经过14天诱导分化形成的脂肪细胞红油染色阳性 40,X,BMSCs,优点：,BMSCs,易于提取、分体、纯化及扩增，适合作基因治疗的,载体细胞,。,患者可以用自己的干细胞治疗疾病，从而克服了移植,排斥反应,。,另外，,MSCs,具有可植入性，在特定的条件下还可分化为骨、软骨、肌肉等组织细胞，是多种疾病基因治疗的理想,种子细胞,。,另外，,BMSCs,具有极强的,自我复制,能力和,多向分化,潜能，来源广泛，易于获取，且具有,低免疫原性,，应用方便。,BMSCs,缺点：,BMSCs,具有体外,易衰老,等缺点，,BMSCs,传代至,67,代后细胞生长逐渐缓慢，呈现衰老现象，故细胞存在数量不足、体外扩增困难、体外传代、保存及复苏后增殖及分化能力下降等问题，严重影响其进一步广泛研究及临床应用。,永生化骨髓间充质干细胞,现,BMSCs,具有体外易衰老等缺点，通过基因工程方法，使,BMSCs,传代次数的增加、仍可保持较好的活性，该类,BMSCs,称为,永生化骨髓间充质干细胞。,细胞永生化机制：,M1-M2,理论,:,细胞经多次分裂后,在肿瘤抑制因子,p53,和,Rb,作用下,细胞进入,M1,期,开始衰老。,细胞经过,20,30PDs,后,进入,M2,期凋亡,只有罕见的细胞在一些因素影响下,端粒酶被激活,以它自身,RNA,为模板不断合成端粒,DNA,来补充和延长端粒有限长度,以维持端粒长度,恢复染色体的稳定性使细胞得以逾越,M2,期,获得无限分裂和增殖的能力,发生永生化。,Shay JW,Wright WE,Werbin H.Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization J .Biochim Biophys Acta,1991,1072(1):127.,永生化,BMSCs,研究方法：,通过质粒pCMVSV40TPUR导入大鼠BMSCs，建立永生化BMSCs,在倒置显微镜下观察细胞形态；采用检测碱性磷酸酶的活性。,采用裸鼠皮下接种实验检测细胞的致瘤性；,永生化,BMSCs,特点：,未导入质粒的BMSCs培养至l5代后细胞不能继续传代，呈明显衰老迹象。,而永生化BMSCs培养至15代后仍可保持较好的活性，永生化BMSCs随着传代次数的增加其形态未见明显改变，细胞传代至15代时，细胞增长速度无减慢趋势,永生化BMSCs具有明显接触抑制,镜下观察发现永生化,BMSCs,细胞间仍存在接触抑制，且通过裸鼠皮下注射永生化,BMSCs,后，观察,4wk,后，未见瘤体的出现，表明细胞为良性细胞可能性大，且,无明显成瘤性,。,A:,经质粒转染后,1 5,代的,BMSCs,B:,未转染的,4,代的,BMSCs,C:,未转染的,1 5,代的,BMSCs,成骨诱导,4wk,后的永生化,BMSCs,碱性磷酸酶染色,另外，,zhang,等发现,SV40T,具有避免细胞凋亡及延长细胞寿命的特性，通过将,pcMvSv40T/PUR,质粒导入前软骨细胞后,发现细胞的生长呈,S,形，随着培养时间的延长，细胞数量随之增加，端粒酶长度也未见明显减短，且在无细胞生长因子的情况下当传代至,3 0,代时仍无向其他细胞分化的趋势,细胞密度对永生化干细胞扩增能力的影响：,有学者利用平板克隆形成实验检测,5,种细胞系,BT325,786-0,293,C6,和,NIH3T3,的克隆形成能力，分析细胞密度或细胞数量对这些细胞系的克隆形成能力以及细胞周期的影响。,结果显示，细胞密度对,NIH3T3,、,786-0,、,293,细胞系的克隆形成能力有不同程度下降。细胞密度的增加对,BT325,和,C6,细胞这两种细胞系的克隆形成能力的影响不大。,脂肪基质干细胞,脂肪基质干细胞的一代,脂肪干细胞,-,原代第三天 纯化的成纤维细胞,原代第6天,造血干细胞,（,hematopoietic stem cell,HSC,）既可分化为成熟的造血细胞，也可分化为成熟的皮肤表皮细胞、肺和胃肠道细胞。,Krause.Cell.2001,105:369-377,神经干细胞,神经干细胞是中枢神经系统中保持分裂和分化潜能的细胞。,神经干细胞可以进一步增殖、分化成中枢神经系统某些细胞类型。,当移植入中枢神经系统后不具有免疫排斥反应,神经干细胞是一种具有广泛,应用前景的干细胞,：,1,）神经干细胞在脑中能根据其周围微环境的诱导而分裂，分化成为相应的细胞类型，其形态和功能与附近的宿主细胞非常类似。,2,）中枢神经系统的血脑屏障，使淋巴细胞很难进入，因此不同个体之间，甚至是不同物种之间的神经干细胞移植，都几乎没有排斥反应。,神经干细胞研究进展,神经干细胞研究起步较晚，分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，加之胚胎细胞研究的争议尚未平息，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。,神经干细胞的研究趋势,进一步研究神经干细胞生物学特征以及分离、纯化和扩增的条件,人类神经干细胞在脑内的定位,怎样在原位诱导神经干细胞增殖分化,人类神经干细胞是否也可向其它胚层的细胞转化,精原干细胞,精原干细胞,(spermatogonia stem cell),As-Apr-Aa1-A1-A2-A3-A4-,中间型精原细胞,-B,型精原细胞,-,精子细胞,-,精子,凋亡,Thank you four attention,!,Q&A,107,谢谢！,