12-基因工程的基本操作程序.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.2 基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,请阅读P9第一和二两段,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库：,概念见P9,2.基因文库的分类:,按外源DNA片段的来源分类,种类,基因组DNA文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：cDNA文库,3.基因文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,4.获取目的基因的根据：,见课本P9,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,5.基因文库的构建方法之一,（1）直接分离法(鸟枪法),某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,反转录法：cDNA的合成流程图解,5.基因文库的构建方法之,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,概念,：PCR全称为_，是一项,在生物_复制_的核酸合成技术,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,原理：,DNA复制,2、利用PCR技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸(dNTP),一对引物：,热稳定,DNA聚合酶,(Taq酶）,模板DNA(需含有目的基因),Mg,2+,(激活剂),条件：,缓冲溶液,一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物,前提：,过程,高温变性（,解旋为单链,）,低温退火（,引物与单链互补结合,）,适温延伸,（,在Taq酶的作用下合成,与模板互补的DNA双链,）,重复循环,预变性（,增加DNA变性的概率,）,2、具体过程,PCR(多聚酶链式反应),概念：,PCR全称为_，是一项,在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、,_、_、_.等,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循,环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2,n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）,过程：,a、DNA变性,（90-95）：双链DNA模板,在热作用下，_断裂，形成_,b、退火,（,复性,55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸,（70-75）：在Taq酶的作用下，,合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR,技术扩增与DNA复制的比较,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原理,原料,条件,不同点,解旋方式,场所,酶,结果,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,目的基因的mRNA,单链DNA,(cDNA）,双链DNA,(即目的基因),反转录,合成,1）反转录法：,以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,3、人工合成的目的基因,二、基因表达载体的构建,基因工程的核心,1、目的：,所需物质：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么?,2、基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们各自的作用是什么?,启动子：,位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能,驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，,能终止mRNA的转录,标记基因,的作用是,为了,鉴别,受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,载体,与,表达载体,的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了,目的基因、启动子、终止子,三部分结构,用到的工具酶：,既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键,启动子、终止子,对于目的基因表达必不可少,目的基因不能单独进入受体细胞，,必需以表达载体的方式携带进去。,注意,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,（1）,农杆菌转化法,农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,优点,（2）,基因枪法,（3）,花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少,方法：,用Ca,2+,处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,(关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA,.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针,.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）,方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,归纳步骤,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,P,15,思考与探究,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法,:,抗原抗体杂交,过程:,用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,归纳步骤,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,鉴定：,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。,（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的,处，DNA连接酶作用于,处。（填“a”或“b”）,a,a,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。,（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和,法。,（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用,技术，该技术的核心是,和,。,（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的,作探针进行分子杂交检测，又要用,方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪法（花粉管通道法）,植物组织培养,脱分化和再分化,耐盐基因,一定浓度盐水浇灌,1）以下说法正确的是 （）,A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,B、质粒是基因工程中唯一的运载体,C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接,D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是,A、能复制 （）,B、有多个限制酶切点,C、具有标记基因,D、它是环状DNA,D,练习,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）,A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B、限制性内切酶用于目的基因的获得,C、目的基因须由运载体导入受体细胞,D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4）有关基因工程的叙述正确的是 （）,A、限制酶只在获得目的基因时才用,B、重组质粒的形成在细胞内完成,C、质粒都可作为运载体,D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （）,A、人工合成目的基因,B、目的基因与运载体结合,C、将目的基因导入受体细胞,D、目的基因的检测和表达,C,练习,知识点一：1.,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：,位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,RNA聚合酶:,能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质,.(以模板转录然后脱落),不能转录为信使RNA，不能,编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能,编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核,苷酸序列，在该序列中，,最重要的是位于编码区上,游的RNA聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,知识点一：2.,真核细胞的基因结构,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，,包括位于编码区上游的RNA,聚合酶结合位点等。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,演讲完毕，谢谢观看！,