研究生分子生物学实验.ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,分子生物学实验,颜景芝,2012.12,大鼠晶体,B2蛋白基因RT-PCR及转化噬菌体表达,实验一 RT-PCR,实验二 细菌的转化、重组子的筛选及 PCR鉴定转化产物,实验三 质粒的提取与纯化,实验四 SDS-PAGE对重组蛋白质的鉴定,主要内容,目的基因分离（RT-PCR，电泳鉴定）,酶切,目的基因与载体连接,重组体转入受体细胞,扩增、诱导表达,筛选阳性重组体,质粒提取,酶切电泳,PCR电泳,SDS-PAGE,(蛋白产物电泳鉴定),实验一 RT-PCR,今日主要任务(周一),总,RNA,提取,RT-PCR,转化,铺平板,原理,RT-PCR包括三个主要步骤：,（1）总RNA的抽提,（2）反转录cDNA的合成,（3）PCR扩增,目的要求：,掌握RT-PCR的原理和方法,异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法,1 总RNA的抽提,异硫氰酸胍,可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入,氯仿,时，它可抽提酸性的苯酚，而,酸性苯酚,可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。,水相层（无色）主要为RNA,，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。,RNA样品电泳后，可见,28S、18S及5S,小分子RNA条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase。,28S和18S RNA比值约为2：1,表明RNA无降解。如比值逆转，则表明RNA降解。,RNA完整性的鉴定,蛋白质核酸OD260:OD280100 0 0.5795 5 1.0690 10 1.3285 15 1.4880 20 1.5975 25 1.6770 30 1.7365 35 1.7860 40 1.8155 45 1.8450 50 1.8745 55 1.8940 60 1.9135 65 1.9330 70 1.9425 75 1.9520 80 1.9615 85 1.9710 90 1.985 95 1.990 100 2,(2)如何保证RNA的纯度？,单链的,RNA,的碱基中的共轭双键暴露的更多，在,260nm,处吸收的更多。,DNA:,OD260/OD280=1.8,RNA:,OD260/OD280=2.0,核酸的特征紫外吸收峰在,260nm,，蛋白质的特征吸收峰在,280nm,260nm,下，,1 OD,值的光密度相当于双链,DNA,浓度为,50g/ml,；单链,DNA,或,RNA,为,40g/ml,；寡核苷酸为,20g/ml,。可以此来计算核酸样品的浓度。,质量好的,RNAD260/D280,在,1.8-2.0,之间，如果该值大于,2.2,，则认为,RNA,已经降解，最好不要再用了,OD260/OD280比值偏低,蛋白质污染：用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。,确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读 数在,0.1-0.5,之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 OD值时，对照及样品稀释液请,使用10mM Tris，pH7.5,。用水作为稀释液将导致比值偏低。,多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，需要 注意多糖、多酚杂质的去除。,（1）晶状体迅速放入匀浆器中，加,RLT,450,l，匀浆。,（2）向晶状体匀浆液中加入225,l,乙醇,，枪头吹打，充分混匀。,（3）,离心柱,（EZ-10）放入2 ml 收集管中，将上一步混合液加入离心柱上，8000 rpm离心1分钟，弃去收集管中液体。（,留柱子,）,（4）向离心柱上加500,l,RW,溶液，10000 rpm离心1分钟，弃去收集管中液体。,操作步骤：,（5）向离心柱上加500ul,RPE,溶液，10000rpm离心1分钟，弃去收集管中液体。,重复步骤5一次。,（6）10000rpm离心2分钟，弃去收集管中液体。,将离心柱转移到新的无RNA酶的1.5ml 离心管中，向离心柱上加30-50ul,去RNA酶水,，50保温2分钟，10000rpm离心1分钟，收集物即,总RNA,。,加样枪的正确使用,离心机的正确使用,匀浆器的使用,注意事项,PCR,：在体外由引物(primers)介导,利用酶促反应获得特异基因组DNA或cDNA的专门技术，又称基因扩增技术。,RTPCR,：以mRNA为模板，用合适的含有目的基因序列的下游引物反转录成cDNA，在加入上游引物，进行PCR扩增。,RT：Reverse transcription,2 RT-PCR,三个基本步骤,PCR的基本过程,变性(denaturation):,双链DNA模板解开成单链,退火(,annealing),：两个寡核苷酸引物结合到单链模板,延伸(,extension),：沿着引物，根据碱基互补配对规律,9496，速度快，1min,退火温度依赖Tm(,T,m,-5,),T,m=4(G+C)+2(A+T),延伸温度一般72,变性,95,C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,逆转录酶（reverse transcriptase）,依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；,Rnase水解活性：水解RNA/DNA杂合体中的RNA；,依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.,a、引物长度:一般为1530bp，常用的是18-27 bp，,引物太短会影响PCR的特异性,引物的设计及其原则,引物的特异性决定,PCR,反应特异性。,引物设计原则的把握：,b、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。,c、引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。,e、产物不能形成二级结构。,f、碱基尽可能随机分布，,d、引物所对应模板位置序列的Tm 值在72左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，,操作：,按照书P5-6，循环数改为30个,琼脂糖凝胶电泳鉴定(明天),琼脂糖凝胶电泳的DNA回收,试剂盒,注意：,加大上样孔,UV,照射下切胶，迅速,目的基因和载体的酶切,目的基因和载体的连接,DNA连接酶,限制性内切酶（双酶切）,3 转化,实验目的,(1)学习转化的基本原理及方法。,(2)验证DNA是遗传物质，加深对中心法则的理解。,实验原理,转化（transformation）是指一段同源或异源的DNA转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。目前常用的转化方法有,CaCl2法(化学转化法)和电转化法,。,操作:参见书P11,4 铺平板与涂平板,今日主要内容（周二）,挑取单克隆菌落加至,15,l LB,培养基中混匀，取,1,l,进行,PCR,鉴定,前一天,PCR,产物的电泳鉴定,今天,PCR,产物的电泳鉴定,结果较好的，将剩余的菌液,14,l,转至,6ml LB,培养基中，过夜培养。,琼脂糖凝胶电泳,1.The electric charge effect（电荷效应）,2.The sieving effect（分子筛效应）,a The molecular weight of DNA,b The structure of DNA,共价闭环 DNA,直线 DNA,开环的双连 DNA,3.The concentration of agarose gel,（琼脂糖凝胶的浓度）,PH（8.3）PI（4.04.5）,DNA,-,EB（溴化乙锭）,是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号易于观察。,含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，,溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！,Operation,Weigh proper 0.3g agarose,dissolve in 30ml TBE buffer by heating in a microwave oven,（称取琼脂糖,0.3,克溶于,30ml 1,TBE buffer,，微波炉加热熔化）,2.Gel bed can be made by sealing a proper sized plastic with the masking tape and inserted the comb（胶带封闭胶床，插梳子）,3.Cool agarose gel to 60,add 5l EB,mix,pour the agarose slowly,(avoid bubbles),onto the gel bed（冷却，加EB混匀，倒入 胶床）,4.Let gel polymerize for about 30min,discard the masking tape,place the gel bed onto the electrophoresis tank,remove the comb,（30min后，撕去胶带，放入电泳槽，拔出梳子),5.Fill the tank with proper amount of TBE buffer,usually the buffer is about 1 mm above the gel,（加入TBE buffer，让液面略高于胶面）,6.Add 2l loading buffer and 7l sample onto a piece of parafilm,mixed,add DNA sample slowly with the pipette tip just beneath the opening of the well(avoid bubbles in tip)（上样）,7.Electrophoresis(80mA)about 30min,（恒流80mA，电泳30min）,8.Observe DNA fragments under UV light,（紫外灯下观察结果）,目的基因686bp,蛋白分子量34kd,质粒提取,1、离心收集3ml培养液中的菌体，用250ul重悬液 重悬菌体。,2、加250ul裂解液，颠倒4次混匀；加10ul碱性蛋白酶溶液，颠倒4次混匀；室温放5分钟。,3、加350ul平衡液，颠倒4次混匀；10000rpm离心10分钟。,4、上层清液转移到离心柱上。10000rpm离心1分钟，弃去收集管中溶液。,5、加入750ul清洗液（已加乙醇），10000rpm 离心1分钟，弃去收集管中溶液。,6、加入250ul清洗液（已加乙醇），10000rpm 离心1分钟，弃去收集管中溶液。,7、10000rpm离心2分钟，弃去收集管中溶液。,8、将离心柱转移到干净1.5ml EP管中，加入 30-50ul去核酸酶水到离心柱上，10000rpm 离心1分钟，收集EP管中样品。,重组子的筛选和鉴定,（一）根据载体的性状变化进行筛选,1.根据载体的抗药性标记进行筛选,insert,载体上的抗药基因：,抗氨苄青霉素基因,抗四环素基因,抗卡那霉素基因等,凡是转入了载体的细胞都获得了这种,抗药性，可以在平板上生长菌落,2.根据载体抗药性插入失活选择,根据载体抗药性标志插入失活选择,含有,两个以上,的抗药性基因的选择，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用,两个含不同药物的平板,，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是,插入失活效应,。,外源基因,抗Amp 抗Tet,抗Amp 抗Tet,抗Amp 抗Tet,重组DNA,空载体,不含有载体或重组DNA,3,-半乳糖苷酶系统（蓝白斑）,-半乳糖苷酶系统,载体：pUC、pGEM系列载体等,带有一个来自大肠杆菌DNA的短序列，其中含有编码-半乳糖苷酶基因（LacZ基因）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能,当这种载体转入的宿主细胞是含有,-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列可以互补（成为互补），产生具有酶活性的蛋白质（-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有IPTG/X-gal的培养基上,呈蓝色。,当多克隆位点有外源DNA片段插入时，破坏此酶的N端阅读框架，产生无,互补功能的N端片段，因此在带有外源DNA片段的细菌在含有IPTG/X-gal的培养基上,呈白色,。,根据外源性,DNA,片段性状进行筛选,根据外源性基因可能表达的蛋白质对缺乏钙蛋白的细菌的影响,如果外源性DNA片段可编码产生蛋白质，并且该蛋白质为细菌生命活动所必需，可利用该蛋白质的性状进行筛选。,如亮氨酸是细菌生命活动所必需的，当外源性DNA片段含有合成亮氨酸的基因时，将该外源性DNA片段转入亮氨酸缺陷的细菌中，放入仅含有亮氨酸的培养基中，只能利用亮氨酸的细菌才能生长，因此，能生长的细菌即为含有外源性DNA片段。,（二）根据重组DNA的结构特征进行筛选,1、重组DNA的快速裂解、鉴定,初步筛选方法，根据重组DNA大小和载体DNA大小之间的差别来区分。,琼脂糖凝胶中进行电泳分离，,观察比较与载体DNA片段迁,移率，初步判断是否有外源,性DNA插入。,2、限制性内切酶图谱进行分析,限制性内切酶进行酶切，凝胶电泳分析是否含有外源性DNA的插入,（三）分子水平-分子杂交技术,检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,提取受体生物全部DNA,DNA片段,显出杂交带,（四）PCR反应进行鉴定,利用引物直接扩增外源基因进行检测,聚丙稀酰胺是由,丙稀酰胺,（,acr,ylamide）和,N,N-亚甲基双丙稀酰胺,（N,N-methylene,bis,acrylamide）经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，,TEMED,）和过硫酸胺（ammonium persulfate，,AP,）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),SDS的作用,SDS是一种阴离子去垢剂，SO,3,2-,带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用,因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于,蛋白质分子大小,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS-多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关。,加速剂TEMED,通过催化过硫酸铵形成,自由基,而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。,过硫酸铵,用作单体聚合,引发剂,，,催化剂,。过硫酸铵产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。,仪器设备,Bio-rad(伯乐),浓缩胶,分离胶,1cm,Western Blotting,(免疫印迹),封闭 一抗 二抗 显色,SDS-PAGE,转膜,血清封闭,一抗,二抗,显色,显色方法,ECL(HRP),AP,