白腐真菌生物技术与应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,白腐真菌生物技术与应用,环境工程专业选修课,主讲教师 胡长庆,课程安排与考核方式,学时数,32学时（包括讨论课时）,白腐真菌,生物学基础,（理论基础）,白腐真菌,生物技术,（应用基础）,白腐真菌在,环境保护中,的作用,（应用实践）,考核方式,闭卷考核,成绩分配,平时占40%；考核占60%,课程内容简介,1,白腐真菌生物学基础,白腐真菌研究的历史、现状与未来,白腐真菌生物学（概念、分类、特点、生物降解等）,2,白腐真菌生物技术,包括白腐真菌的培养、分离、酶技术、固定化技术等,3,白腐真菌在环境保护中的作用,白腐真菌与水污染控制,白腐真菌与土壤污染控制,白腐真菌与重金属污染,白腐真菌与大气污染控制,白腐真菌与有机固体废物资源化,1,白腐真菌生物学基础,白腐真菌研究的历史、现状与未来,白腐真菌研究探索的历史,20世纪70年代至20世纪90年代,白腐真菌研究繁荣的现状,以分子生物学为特征的理论研究,白腐真菌研究发展的未来,以工业化应用为终极目标,白腐真菌生物学,1、白腐真菌（White Rot Fungi）的概念,白腐真菌的概念,不是生物学术语,，而是一种,功能描述的概念,纤维素,木腐真菌,Wood Rotting Fungi,木质,纤维素,Ligno-,cellulose,软腐真菌,Soft rot Fungi,褐腐真菌,Brown rot Fungi,白腐真菌,White rot Fungi,木质素,半纤,维素,多糖类,软腐真菌：主要降解纤维素，对木质素降解,缓慢且不彻底。,褐腐真菌：主要降解纤维素、半纤维素和部,分多糖类，几乎不降解木质素。,白腐真菌：主要降解木质素和多糖类，对纤,维素和半纤维素降解能力弱。,小结,到底什么是白腐真菌？,白腐真菌的概念是从功能角度对其进行描述和界定的,白腐真菌是一类能够引起木质白色腐烂的丝状真菌,主要降解木质素和多糖类，对纤维素和半纤维素降解能力弱,白腐真菌嗜热性好氧微生物,白腐真菌主要分布于 8个菌属,革盖菌属,Coriolus,原毛平革菌属,Phanerochaete,卧孔菌属,Poria,层孔菌属,Fomes,多孔菌属,Polyporus,烟管菌属,Bjerkandera,侧耳属,Pleurotus,栓菌属,Trametes,研究较多，且表现出较强降解能力的菌种有20种,污色原毛平革菌,丝核菌,糙皮侧耳、平菇,红孔菌,变色栓菌、云芝,韧革菌,漏斗状侧耳、凤尾菇,多孔菌,毛栓菌,短射脉菌,裂褶菌、树花,金孢霉菌,烟管菌,短孢射脉菌,维氏针层孔菌,拟蜡菌,香菇、椎茸,毛革盖菌,木蹄层孔菌,射脉菌,3、白腐真菌的生理特点,白腐真菌是一个庞大的生物家族，各成员的生理特点会表现出很大,的差异。,笼统的谈白腐真菌的生理生化特征和性质，既不现实，也不准确。,黄孢原毛平革菌,黄孢原毛平革菌具有发达的菌丝体，菌丝常为多核，少有隔膜，无,锁状联合,。,多核分生孢子常为异核，担孢子却是同核体,。交配系统有,同,宗交配和异宗交配,。,黄孢原毛平革菌的生长具有营养生长期和子实体生长期。,锁状联合,：,担子菌的次生菌丝每一个细胞都有二个核，其中一个核来自母,本，一个来自父本，当双核细胞进行细胞分裂时，在二个核之间外生一个短小,弯曲的分枝，核移动，在二核之间生出一个突起如钩状，一个核进入钩，一个,留在菌丝。钩中保留一个核，一个往后移，菌丝中二个核一往前一个往后移钩,状突起向下弯曲与细胞壁接触溶化，分枝基部生分隔膜（分隔中间有孔道），,在原分支外形成一隔膜，产生一个新细胞双核体，在分隔处保留一个桥形结构。,分生孢子,无性繁殖，通过,菌丝体的裂殖产生。,担孢子,有性繁殖，必须通过菌丝体细胞的,锁状联合过程。,同宗交配和异宗交配,两条可互相交配的单核菌丝融合,担孢子,一次菌丝,担孢子,一次菌丝,单核,萌发,二次菌丝,双核,二次菌丝,担孢子,只要同一孢子萌发的单核菌丝间的互相结合生出,双核菌丝后，就可形成子实体，这种现象称为,同宗交,配,。反之，只有异性的单核菌丝（不同孢子），才能,结合成双核菌丝，这种结合方式称为,异宗交配,。,3-1 白腐真菌的生长与代谢特点（黄孢原毛平革菌）,营养期,初生生长,白腐真菌,繁殖期,次生生长,停滞期,对数期,细菌,静止期,生长是线性的，生物量,显著增加。,生长基本停滞，甚至发生,生物量的下降。,诱因：,氮限制,（nitrogen limitation,N-L）,碳限制,（carbon limitation,C-L）,N-L在木质素降解中的作用:,实质上是白腐真菌在进化过程中对环境中氮缺乏的一种生理适应。,C-L在木质素降解中的作用:,主要是它和菌丝体质量的减少像偶联，从而启动了次生代谢。,与木质素降解有关的几个基本概念,营养限制,N-L和C-L,木质素的降解,木质素降解酶的合成,要求,木质素降解条件,Ligninolytic condition,培养体系,生理特征,参与的酶,木质素降解培养,Ligninolytic culture,木质素降解活性（,木质素降解活动,）,Ligninolytic activity,木质素降解酶,Ligninolytic,enzyme,白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢(cometabolized)过程,木质素,完成降解过程,白腐真菌,？,+,生长底物,Growth substrate,白腐真菌,共代谢的两种方式,1、某种生物将一种底物转化，却无法在这种底物上生长，即生物体,不能利用这种底物氧化所产生的能量去维持生长。,2、一些生物为了共同的效应，共用其生物化学资源，协同作用，对,化合物进行降解。,白腐真菌降解木质素属于何种方式？,小结 3-1,白腐真菌的生长与代谢特点,白腐真菌的生长具有营养生长期和子实体生长期。,锁状联合 分生孢子 担孢子 同宗交配 异宗交配,营养期白腐真菌生长是线性的，生物量显著增加；,繁殖期（子实体体生长期）生长基本停滞，甚至,发生生物量的下降。,氮限制（N-L）碳限制（C-L）,白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢过程,共代谢的两种方式,3-2 白腐真菌在培养中的特点（黄孢原毛平革菌）,这里的培养特指实验室中小规模的,以研究基本规律为目的的培养,接种物,接种,方式,菌丝体,孢子,按干重或是湿重计量,优点：,能准确量化,能保证碳、氮营养限制,应用范围：,基础研究和应用研,究初期,接种方式：,制备孢子悬浮液,（spore suspension,SS）按,培养基量成一定比例接入,关键是,接种物,的定量,培养方式,(实验室规模的一般性培养),按培养基的物理状态划分,半固体培养体系,固体培养体系,液体培养体系,静置培养,Standing culture,振荡培养,Shaking culture,静置培养,Standing culture,固定台面,孢子,1-2天,菌丝垫或菌垫,Mycelial mat,条件适宜,10天左右,白色粉状物孢子,1、,尽量采取浅层培养方式；,2、,尽量避免菌墊起褶，尤其在培养初期菌墊很薄的时候；,3、,氧气的扩散速度是静置培养时决定白腐真菌降解木质素能力的限制性因子；,振荡培养,Shaking culture,振荡培养仪器,孢子,1-3天,菌丝团或菌团,Mycelial pellets,1、,菌团的大小及数量随接种量和,转速而变化：接种量大，菌团大；,转速越大，菌团越小，数目越多；,（100 mL三角烧瓶40 mL培养液）,2、,一般而言，在100200r/min条件下，菌团,直径在35mm；,3、,主要为细菌系统建立的振荡培养技术，实际上并不适合直接应用于白腐,真菌系统，主要是由于白腐真菌对振荡所产生的机械剪切力高度敏感；,固体培养体系,白腐真菌的固体培养主要是平板培养，少量进行斜面培养。,平板培养的目的：,扩大菌的生物量或是大量获得孢子；鉴定菌的酶活性,或扫描菌对化学物质的降解能力；用于菌种的分离筛选、,诱变、驯化或是短期的保藏；,斜面培养的目的：,菌种的中、长期保藏；,孢子或菌丝体,平板培养,斜面培养,数日,数日,气相,生长,气相,生长,菌丝层,菌丝层,气生孢子,气生孢子,3-3 环境因子对白腐真菌代谢活动的影响（黄孢原毛平革菌）,白腐真菌,环境因子,培养参数的操作、,调控和优化,菌的代谢或降解潜能,开发利用的关键,建立一个合理的,反应体系,涉及的环境因子或培养条件包括：,培养基成分；活性添加成分；氧；pH；温度,培养基成分,实验培养最佳碳源为葡萄糖,碳源物质,香草酸钠:,支持菌的生长,也可支持木质素降解;,葡萄糖酸钠:,支持菌的生长,但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠;,葡萄糖酸内酯:,支持菌的生长,但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠;,甘油:,可当碳源也可能源,支持木质素降解,是筛选菌突变体的碳源;,琥珀酸钠:,可当碳源也可能源,支持木质素降解;,葡萄糖:,支持菌的生长,支持木质素矿化程度高;,纤维素:,支持菌的生长,支持木质素矿化程度极高;,优,劣,氮源物质,营养氮源的种类对木质素降解的影响不大，重要的是氮源的浓度；,氮丰富状态对木质素代谢会产生负面影响；,铵类氮源会抑制一些酶的合成，产生“氨代谢物抑制”现象；,维生素,缓冲成分,金属成分,硫胺素是白腐真菌生长和木质素代谢的必须成分；,乙酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钠是三种最为常用的缓冲成分；,主要功能，或作为一般的营养元素，或作为酶的结构组成和活性因子；,活性添加成分,活性添加成分（activated additive）有利于提高或保护木质素降解系统，,可以提高培养体系的反应性。,VA（藜芦醇，3,4-二甲氧基苯甲醇）,白腐真菌本身在生长过程中可以产生VA（次生代谢物），外源加入一,定量的VA可以显著提高木质素过氧化物酶的合成及活性。,芳族化合物,起到氧化还原调节剂的作用，常见的有3,4-二甲氧基苯甲醇和3-羟基邻氨,基苯甲酸盐。,有机酸,表面活性剂,有机酸，如甘醇酸（glycolate）、乙醛酸（glyoxylate）、草酸（oxalate）,等，可以促进木质素降解活动。其中，草酸的作用尤其引起重视，草酸具有刺,激锰过氧化物酶及调节细胞外酸碱度的功能。,白腐真菌液体培养体系中加入表面活性剂可以有效地保护木质素降解酶免,受因机械剪切力所造成的结构破坏或活性丧失。,最为常用的表面活性剂Tween 80（吐温80）,氧,环境中氧的浓度对白腐真菌的生理代谢及木质素降解活动有很大影响。,但是，绝对不能简单的认为是氧的绝对浓度问题，,起关键作用的是白腐真,菌真正所能获得的有效氧的多寡。,pH,白腐真菌生长所需的适宜pH为5.5左右，稍高于木质素降解所要求的最,佳pH 4.5。当培养体系pH低于3.5或是高于4.5的情况下，会显著抑制木质素,的降解和降解酶系统的工作。,温度,白腐真菌生长扩增所需的温度范围在2539，要求并不十分严格。,4、白腐真菌酶学简介,4-1 白腐真菌主要酶种概述,H,2,O,2,产生酶系,葡萄糖氧化酶,乙二醛氧化酶,甲醇氧化酶,VA氧化酶,其他酶,其他酶系,过氧化物歧化酶,葡糖苷酶,苯丙氨酸解氨酶,还原脱卤酶系统,醌还原酶,芳烃硝基还原酶,蛋白酶,木质素氧化酶系,需H,2,O,2,的过氧化酶,漆酶,Lac,木质素过氧化物酶,LiP,锰过氧化物酶,MnP,白腐真菌木质素降解酶系统（ligninolytic enzyme system）,H,2,O,2,产生酶系,共同作用：以小分子有机物为底物，将分子氧化还原为H,2,O,2,。,葡萄糖氧化酶,细胞内合成分泌到细胞外环境，将糖类物质氧化还原为H,2,O,2,。,乙二醛氧化酶,为细胞外的含铜氧化酶，主要以醛类物质为底物。而醛类物质,恰好是葡萄糖氧化的中间产物。,其他酶,参与H,2,O,2,的产生。主要有甲醇氧化酶，VA氧化酶等。,漆酶（Lac）,木质素过氧化物酶（LiP）,能氧化高氧化还原电位的化合物，催化酚类、非酚类物质氧化，参与木质素解聚。,锰过氧化物酶（MnP）,表现出对锰二价离子的绝对需要，氧化氧化还原电位相对低的化合物，如胺类、染料，在脱色反应中起主要作用，参与木质素解聚。,木,质,素,氧,化,酶,系,需H,2,O,2,的过氧化酶,含铁的血红蛋白,胞外酶,含铜多酚氧化酶（对二酚氧化酶）,以单酚、二酚、二胺、多酚类化合物为底物。对非酚类物质，特别是蒽、苯并芘，多环芳烃类作用显著。参与木质素的解聚和降解。,其他酶系,过氧化物歧化酶,保护白腐真菌活细胞中过氧化物自由基免遭氧化压力；,葡糖苷酶,具有糖基化的活性，在废水脱色中起着重要作用；,苯丙氨酸解氨酶,与VA的生物合成密切相关；,还原脱卤酶系统,能还原卤素基团；,醌还原酶,能产生氢醌，对木质素及环境污染物的降解极其重要；,芳烃硝基还原酶,是硝基芳香族化合物降解的关键；,蛋白酶,具体情况尚不明确；,木质素过氧化物酶（LiP）的分离和检测,LiP的分离,4-2 主要木质素降解酶的分离、提纯和检测方法,LiP的粗制品,液体培养,细胞外液,6天,上清液,1200018000g 离心,1030分钟,去除菌丝和孢子,粗酶液,4保存24h,DEAE树脂,4，离子交换,LiP的粗制品的纯化,DEAE离子交换柱,LiP的纯化制品,NaCl,梯度溶液,洗脱,LiP的标准检测方法,基本原理,藜芦醇（VA）,藜芦醛（VAd）,LiP催化,H,2,O,2,320nm,无吸收,强烈吸收,反应体系,操作要点,2mmol/L VA,50mmol/L 酒石酸（pH 3.0,3.5）,0.4mmol/L H,2,O,2,一定量的酶液,H,2,O,2,使用前新鲜配制；30反应时间10分钟；pH保持在3.0,3.5；,使用1cm石英比色皿，各比色皿总体积差额用蒸馏水补足；VA使用真,空蒸馏或是在醚中萃取的方法进行纯化；,锰过氧化物酶（MnP）的纯化和检测,MnP的纯化,菌的培养液用玻璃棉过滤，获得粗过滤液,超过滤法浓缩过滤物，使其浓度增加20倍,用去离子水按1:1比例进行稀释,使用DEAE阴离子交换柱吸附,洗涤,50mL蒸馏水,20mmol/L酒石酸钠（含0.4mol/L NaCl）,洗脱蛋白质,超过滤法除盐,或浓缩,冰冻干燥，-20保存,所有纯化步骤在4进行，通过上述方法制备的酶制品可以保存1年不失活,MnP的基本测定方法,利用各种芳香族底物，在补充锰（）离子的条件下，均可进行MnP的测定。,表 用于MnP测定的底物及相关波长数据,底物,波长/nm,亚香草基丙酮,336,2,6-二甲氧基苯酚（DMP）,568,丁香酸,260,愈创木酚,465,姜黄素,430,丁香醛连氮,525,松柏醇,263,邻联（二）茴香胺,460,MnP的基本测定方法具体步骤,1mL反应混合液,0.1mmol/L酒石酸钠,（pH 5.0）,0.1mmol/L底物,0.1mmol/L MnSO,4,适量的酶液,光程1cm、体积1.5mL,石英比色皿，室温,加入0.1mmol/L H,2,O,2,以不加H2O2的反应体系为对照；,1U为每分钟氧化1微摩尔每升底,物的MnP；,启动反应,MnP其他具有代表性的测定方法还包括ABTS氧化法，Mn(,)氧化法和酚红法。,漆酶（Lac）的定性和定量检测方法,Lac的定性检测方法,Lac的定量检测方法,愈创木酚法：,在含0.02%（质量浓度）愈创木酚的平板上可以鉴定细胞,外液中Lac的活性，Lac催化愈创木酚聚合形成红棕色的区带。,1mmol/L愈创木酚,50mmol/L乙酸钠,pH4.5,适量的酶液,37，5分钟,465nm处测定吸光度,一个酶活单位定义为每分钟引起波长465nm处吸光度一个0.01单位变化所需的酶液量。,5、白腐真菌分子生物学简介,黄孢原毛平革菌的分子生物学,其他白腐真菌的分子生物学,木质素降解过氧化物酶的分子生物学,未来发展趋势：破解各类白腐真菌基因图谱,6、白腐真菌的生物降解,6-1 白腐真菌生物降解的特点,非专一性,nonspecific,非水解性,nonhydrolytic,细胞外性,extracellular,白腐真菌能降解各种不同的化合物，具有广谱的底物范围。,其对作用底物的结构和类型要求是高度非特异性的。,白腐真菌在生物降解过程中,并不出现通常的酶的水解反应。,白腐真菌通过细胞外酶的作用,对木质素类物质进行氧化分解。,木质素的结构特征,6-2 白腐真菌生物降解系统,白腐真菌生物降解系统的概念,营养限制,N-L和C-L,木质素的降解,木质素降解酶的合成,要求,木质素降解条件,Ligninolytic condition,参与的组分,木质素降解系统,Lignin degradation system,LDS,白腐真菌生物降解系统,泛指所有白腐真菌在适宜的条件下所,形成的参与生物降解活动的组分的集合。,白腐真菌生物降解系统的组成,酶组分,小分子有机物,白腐真菌生物降解系统,产过氧化氢的酶,过氧化物酶,其他酶种,VA,草酸,HAA,3-羟基-邻氨基苯甲酸（氨茴酸）,注意：,1、葡萄糖氧化酶和乙二醛氧化酶的区别；,葡萄糖氧化酶是细胞内酶，乙二醛氧化酶为细胞外酶,2、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的异同点；,相同点：,均在细胞内合成，分泌到细胞外，以H,2,O,2,为最初氧化底物，触发,酶的催化循环；,不同点：,Lip主要催化非酚类的芳香族化合物，只与木质素解聚有关，MnP,主要催化酚类化合物，与H,2,O,2,产生和木质素解聚均相关；,白腐真菌生物降解系统的基本要求,1、一种共底物，不能以木质素或是其他降解底物为唯一碳源；,2、底物的不可诱导性；,3、只在次生代谢期间得以表达；,4、因碳、氮、硫等的限制而触发；,5、能被一些化学物质所强烈抑制；,6、对微量金属元素平衡的敏感；,7、相对狭窄的酸碱度范围；,8、明显地受氧气浓度的影响；,6-3 白腐真菌生物降解的机制,木质素的降解机制,木质素的部分结构示意图,木质素是由类苯丙烷亚单位非线性,随机连接形成的天然生物聚合物。,木质素主要前体物,对豆香醇 松柏醇 芥子醇,愈创木基木质素,愈创木基丁香基木质素,愈创木基丁香基对羟苯基,木质素,主要存在于,草本植物,中,主要存在于,裸子植物,中,主要存在于,木本植物,中,木质素的主要种类,木质素的降解过程,木质素,脱甲基化,羟基化,芳环开裂,白腐真菌细胞外酶,愈创木基和丁香基亚单位,甲氧基含量减少,邻苯二酚,脂肪羧酸,水解,1、侧链中：发生氧化形成羰基和羧基；,2、芳环中：脱甲基化形成邻苯二酚后发生氧化开裂；,3、环裂片段进一步被降解，释放出脂肪类产物和新的酚羟基单位，然后降解；,4、侧链断裂与芳环开裂几乎同时发生；,化学物质的降解机制,氧化机制,包括LiP和MnP的过氧化物酶，利用H2O2促进化学物质发生单电子氧化形成自由基。,氧化机制,依赖MnP催化的氧化,氧化机制类似于LiP的直接氧化，但表现出对Mn的绝对需要。,依赖LiP的氧化,直接氧化,间接氧化,被氧化化学物质不必与酶发生结合，氧化通过简单的,电子传递而发生。主要氧化的化学物质为PAH类、氰化物,和染料。,依靠某种中介物（调节剂）相助进行氧化。主要氧化的,化学物质为木质素、有机酸等。,还原机制,白腐真菌对化学物质的降解过程中还原机制存在两种类型，一是,依赖LiP的,还原,，一是,依赖MnP的还原,。,脱毒机制,有机化合物之所以能抵御生物降解是由于其毒性，能对生物造成毒效应。,白腐真菌对化学物质的降解过程就涉及到其解毒机制。白腐真菌的解毒机制,主要有两种，即,酚类化合物的甲基化,和,化学物质依赖于细胞质膜的还原反应,。,6-4 白腐真菌生物降解的广谱性,白腐真菌种类的多样性,白腐真菌特殊的降解机制,白腐真菌对广谱的化学物质具有,敏感性和进攻性,目前白腐真菌可以有效降解的具有代表性的化学物质大类共有,16类,单苯化合物,苯、甲苯、乙苯和二甲苯（分别简称为B、T、E和X，合称BTEX），是一类重要的,有机污染物。,白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，从底物的敏感性来排序：,ETXB,（乙苯甲苯二甲苯苯）,氯苯,氯苯是优先污染物，作为溶剂、脱脂剂、甜味剂和各类农药，染料合成的中间体,被广泛使用。,白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，按照降解速率来排序：,单氯苯间二氯苯邻二氯苯对二氯苯,苯胺,主要是降解3,4-二氯苯胺（DCA）。,氯酚,氯酚是污染物的大类，也是造纸废水的主要成分。白腐真菌主要降解五氯苯酚,（PCP）、单氯苯酚（CP）、二氯苯酚（DCP）和三氯苯酚（TCP）。,联苯,联苯类物质由于疏水性和稳定性，在环境中可以长期存在，对人及各种生物构成,毒性。白腐真菌主要降解多氯联苯（PCB）和联苯。,硝基芳烃化合物,硝基芳烃化合物是合成许多工业化学物质的重要原料。白腐真菌主要降解2,4,6-三,硝基甲苯（TNT）和2,4-二硝基甲苯。,杂环化合物,杂环化合物大多数属于雌性荷尔蒙类物质，对人体危害极大。白腐真菌主要降解噻嗯,类和二恶英类。,氰化物,氰化物是优先污染物，作为LiP的一种底物，在H,2,O,2,存在时，能被白腐真菌迅速,矿化为CO,2,。,杀虫剂,白腐真菌主要降解DDT和有机磷杀虫剂。,除草剂,白腐真菌主要降解2,4,5-三氯苯氧乙酸。,卤化物,白腐真菌对于有机类卤化物具有脱卤作用。,塑料及聚合物,白腐真菌主要降解木素-聚苯乙烯接枝共聚物，聚乙烯塑料和聚酰胺。,挥发性有机物,白腐真菌对9种在排放的工业废气中普遍存在的挥发性有机物（VOC）具有降解,能力。包括芳烃类（苯、甲苯、乙苯、苯乙烯）、酮类（甲乙基酮、甲基异丁基酮、,甲基丙酮）、有机酸类（乙酸丁酯、乙基-3-乙氧基-丙酸酯）。,煤,主要是针对低级煤（LRC），对其进行液化、解聚、聚合和脱色。,PAH,多环芳烃（PAH）是重要的环境污染物，危害极大。白腐真菌主要降解蒽油、芘、,苯并芘、蒽、菲等PAH类物质。,染料,白腐真菌主要降解偶氮染料、三苯甲烷染料、聚合染料、杂环染料和靛类染料，几,乎包括了染料的所有大类。,6-5 白腐真菌生物降解的优点,白腐真菌的生物降解具有其他生物体系，尤其是细菌体系，所不具备的优点，,共有,六大优势,。,1、不需要进过特点底物的预条件化；,2、动力学优势；,3、对其他微生物的拮抗；,4、细胞外的降解特征；,5、降解底物的非特异性；,6、适用于固液两种体系；,6-6 白腐真菌生物降解的意义,白腐真菌在碳素循环中的地位和作用,白腐真菌是生物修复的有力工具,白腐真菌在物质转化和资源利用中的应用,分解作用,光合作用,有机碳,微生物,动物,植物,死亡,死亡,生物圈,岩石圈,埋葬有机碳,大气圈/土壤圈/水圈,CO,2,呼吸作用,CO、CH,2,CH,4,沉积作用 CaCO,3,和MgCO,3,矿物染料燃烧 CO,2,和CO；岩石风化 CO,2,碳素循环（生物和地质循环）示意图,白腐真菌生物技术,白腐真菌生物技术体系,基础性技术体系,应用性技术体系,以白腐真菌的生长繁殖、,培养保存等为主；以白,腐真菌的生活史为线索,以白腐真菌的分离诱变、,反应体系的建立等为主,以菌的生理生化为线索,白腐真菌生物技术的特点：,1、复杂性：,条件的复杂性以及调控和操作的复杂性；,2、综合性：,生物学问题、化学问题和环境问题的结合；,1、白腐真菌培养技术,白腐真菌生长及保存培养基,液体培养基,平板培养基,试管培养基,保存培养基,生长培养基,几点说明：,培养基的pH值，一般保持在5.5左右；,将固体培养基分装在试管里，做成斜,面，主要供菌种保存用；,将固体培养基倾入培养皿，制作平板，,主要供菌种扩增和获得分生孢子、菌琼脂,块等接种物；,不加琼脂，即配制成液体生长培养基，,主要为菌种的扩增和获得收集菌丝体用；,主要培养基种类,PDA培养基,这是培养真菌生长的经典固体培养基，全称土豆葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）。,配方（L,-1,）：200g 土豆浸出液，3g KH,2,PO,4,，20g 葡萄糖，20g琼脂，1.5g MgSO,4,7H,2,O。,MEA培养基,这是以麦芽汁为主要成分的固体培养基，全称麦芽琼脂培养基,（malt extract agar,MEA）。,配方（L,-1,）：30g 麦芽浸膏，3g 大豆蛋白胨，15g 琼脂。,MEG培养基,配方（L,-1,）：5g 麦芽浸膏，10g 葡萄糖，10g 琼脂。,YMPG培养基,主要由酵母抽提物，麦芽汁，蛋白胨和葡萄糖组成。配方（L,-1,）：10g 麦芽汁，2g 蛋白胨，2g 酵母抽提物，10g 葡萄糖，20g琼脂，1g MgSO,4,7H,2,O，2g KH,2,PO,4,。,促进白腐真菌生长的天然成分,木材、玉米芯、土豆浸出液是目前比较常用的促进白腐真菌生长的天然成分。,菌种的保存,菌丝块或孢子,室温或28或35 至,39 下培养5 7天，,-20或4 保存,孢子,混合,硅胶,密封,4 保存,斜面保存,孢子悬浮液保存,孢子的硅胶保存,孢子,-20或4 保存,无菌蒸馏水,接种物的制备,孢子悬浮液的制备,孢子,无菌蒸馏水或0.5%（质量浓度）的Tween80溶液,培养,过滤,玻璃棉,稀释,孢子悬浮液,孢子悬浮液,浓度测定,血球计数板计数,（浓度测定的直接方法）,分光光度法,（浓度测定的间接方法）,孢子悬浮液制备过程示意图,琼脂块,主要是那些不形成分生孢子的菌种的接种物。,方法：,从生长旺盛的平板边缘，切割0.51.0cm见方的琼脂块。,菌丝体,菌丝体,洗涤,研磨混合1min,取出,液体培养体系,液体培养基,菌丝体悬浮液,确定生物量,湿重计算法,干重计算法,菌丝体悬浮液制备方法示意图,孢子活力的测定,使用美蓝染色法测定白腐真菌分生孢子的存活率。,2、白腐真菌的分离技术,2-1 木腐担子菌的分离与筛选,技术步骤：担子菌筛选,鉴定菌的木质素降解能力,技术核心：,从自然环境的固体介质的混合微生物群体中，将木腐或白腐,担子菌分离筛选出来。,基本思路：,建立选择培养基，在固体的分离培养基中加入一些对其他类,别微生物的抑制剂。,基本步骤：,担子菌的筛选,担子菌的纯化,具体菌种的纯化,担子菌的分离,以黄孢原毛平革菌的分离为例,担子菌的筛选,利用选择培养基初步分离担子菌类,（粗筛）,常用选择培养基配方,干燥的麦芽汁提取物 3.0g,真菌蛋白胨 0.5g,琼脂 2.5g,蒸馏水 100mL,邻苯基苯酚 0.006g,注意点：,1、邻苯基苯酚的浓度可以根据具体情况进行调节，最大,浓度0.01%（质量浓度）；,2、使用乳酸调节培养基pH值，不影响对担子菌的筛选；,优点：,能从受霉菌严重污染的土壤及其他介质中分离担子菌；,真菌耐药性试验,细筛,利用担子菌对各类天然和合成杀真菌物质的忍耐性，进一步从筛选,体系中,去除可能残留的细菌和放线菌,。,常用的杀真菌物质为玫瑰红（四碘四氯荧光素），一般使用浓度30mg/L。,担子菌的纯化,使用苯菌灵-麦芽琼脂培养基对培养物进行进一步培养,（纯化）,纯化的目的：,是要去除培养物中可能存在的其他丝孢菌类（hyphomycetes）；,苯菌灵母液的配制：,1g的50%苯菌灵粉末，加到500mL的蒸馏水中；,一般使用浓度与方法：,将母液按照1mg/L的浓度加入2%（质量浓度）的麦芽琼脂培养基中；,担子菌的分离,以Poly R-478为指示剂分离能降解木质素的菌种,（分离）,常用分离培养基配方,大麻茎木 0.2%（质量浓度）,琼脂 1.5%（质量浓度）,苯菌灵 15mg/L,愈创木酚 0.01%（质量浓度）,分离,使用0.02%（质量浓度）含Poly R-478,（聚合染料）的平板麦芽琼脂培养基,培养分离菌种,检定,使愈创木酚变成褐色的菌为目标菌种,使,含Poly R-478的平板麦芽琼脂,培养基脱色即可确认分离成功,具体菌种的纯化,根据需要筛选的特定菌种类型，使用与之匹配的选择性分离培养基，对培养物,反复多次培养，直至获得目标纯菌种，然后采用16sRNA检测鉴定。,问题,假设已经获得某种白腐真菌的子实体，可以采取何种方法分离出纯菌种？,培养,各类真菌子实体,切割,获取子实体块,PDA培养基,植入,获得菌丝体,菌丝体纯培养,2-2 具有降解异生物质能力的白腐真菌的筛选,筛选的必要性,白腐真菌对异生物质的降解长期以来集中在黄孢原毛平革菌，但是在实际应用过程,中其木质素降解条件很难得到满足。因此，筛选能在较宽泛环境条件下降解异生物质的,白腐真菌对于应用技术的开发具有重要意义。,筛选的基本策略,理想的筛选方法，既要便宜，建立在相对无毒的底物基础上，不依赖于烦琐的分析,之上，同时它应该与木质素降解酶所调节的异生物质的降解有高度的相对应性。,利用聚合染料的筛选程序（常用）,指示染料的选择,选择培养基,异生物质的降解与染料脱色相关性判断,2-3 白腐真菌木质素降解性能的鉴定,白腐真菌木质素降解酶的平板定性,方法一,Poly R-478指示细胞外氧化酶,在平板上补充0.02%（质量浓度）Poly R-478，用于检测细胞外氧化酶。现象：平板脱色,方法二,平板系统定性测试木质素降解酶,加入250mg/L的ABTS，菌丝周围形成黑绿色环，,指示Lac和过氧化物酶存在,加入0.1g/L的MnCl,2,4H,2,O，平板上形成黑棕色斑,点，指示MnP的合成,平板测试系统,agar-plate test system,25g/L琼脂,35mL,接种直径10mm,的琼脂菌丝块,ABTS-平板,Mn-平板,腐殖酸-平板,加入1g/L的煤腐殖酸，平板上发生漂白反应，指,示木质素降解酶的系统的存在,白腐真菌木质素降解能力的平板鉴定,这是一种快速评价白腐真菌木质素降解能力的平板方法。,经典培养基,PDA培养基,去除土豆滤液,基本琼脂培养基,BAM培养基,ABTS-琼脂培养基,SYR-琼脂培养基,Mn-琼脂培养基,加入100mg/L的ABTS,加入100mg/L的MnCl,2,4H,2,O,加入100mg/L的,丁香连氮（吖嗪）,加入10mL的各培养基，并植入5mm的琼脂菌丝块，每23日检测色变区和菌的放射性生长,菌丝周围形成深绿色,1周后在菌丝周围积累,紫色醌类物,2周后形成黑棕色的,MnO,2,条纹,3、白腐真菌反应体系的建立,白腐真菌反应体系的种类,平板反应体系,液体反应体系,静置反应体系,摇床反应体系,主要用于酶和降解的定性研究,主要用于酶学研究和降解,反应的定性定量研究,建立白腐真菌反应体系需要考虑的基本因素（6大因素）,培养基,经典培养基的组成（L,-1,）,0.2g KH,2,PO,4,0.05g MgSO,4,7H,2,O,0.01g CaCl,2,1mL 无机溶液,0.5mL 维生素溶液,1.2mmoL 酒石酸铵（氮源）,56mmoL 葡萄糖（碳源）,20mmoL DMS（缓冲成分）,pH 4.5,维生素溶液（L,-1,）,2mg 生物素,2mg 叶酸,5mg 维生素B,1,5mg 烟酸,5mg 维生素B,2,10mg 维生素B,6,盐酸盐,0.1mg 维生素B,12,5mg DL-泛酸钙,5mg 对氨基苯甲酸,5mg 硫辛酸,无机溶液（L,-1,）,1.5g 氨基三乙酸酯,3g MgSO,4,7H,2,O,0.5g MnSO,4,1g NaCl,2,100mg FeSO,4,7H,2,O,100mg CoSO,4,82mg CaCl,2,100mg ZnSO,4,100mg CuSO,4,5H,2,O,10mg AlK(SO,4,),2,10mg H,3,BO,3,10mg NaMoO,4,为防止培养基的微生物污染可以考虑在培养基分装前或是培养5天后加入20U/mL,青霉素或是2mg/mL链霉素，不会影响木质素过氧化物酶的产生。,活性成分,反应温度,底物加入时间,接种方式及接种量,VA,主要提高LiP的产量和活性；,Mn(),主要提高MnP的产量和活性；,Cu()和小分子芳烃化合物,主主要提高Lac的产量和活性；,表面活性剂,保护酶的活性，提高对降解底物的利用性；,主要有两种反应温度，,28 以上39 以下,和,25 以上28 以下,；,一般选择在接种以后的第6天，防止底物毒性抑制孢子的萌发，菌丝体的生长以及酶的合成及活性等；,选择孢子悬浮液或是菌丝块，严格按照一定比例定量添加；,供氧,供氧方式,（主要针对液体反应体系）,人工通气,自然地复氧作用,用通气装置或通气管，直接将空气或纯氧导入反应体系。,一般间隔3天进行氧的补充,。,培养体系自身,与环境进行气,体的交换和氧,气的补充。,静置培养,摇床培养,采用浅层培养的方式。三角烧瓶装液量一般规律：,10mL/125mL,20mL/250mL,50mL/500mL,。,摇床转速一般为,100200r/min,。,优点,：加大了氧气的传输和传质效率；,缺点,：机械剪切力破坏酶结构与活性；,解决途径,：一是加入表面活性剂，二是将孢子、菌丝体,或酶固定化；,4、白腐真菌的固定化（immobilizayion）技术,白腐真菌固定化技术的类型,共固定,吸附法,包埋法,琼脂糖和琼脂小珠,海藻酸钙小珠,K-卡拉胶颗粒,明胶包埋小块,PVA包埋法,多孔的聚合物,聚氨酯泡沫小块,多孔的聚氨酯颗粒,植物纤维编织绳,多孔陶瓷载体,烧结玻璃载体,琼脂糖和琼脂小珠,包埋法,细胞或酶的包埋是生物固定化中,最常用的方法,。,基本原理,是将生物材料包裹和埋藏在水不溶性的凝胶聚合物的网络骨架中。,用于包埋的凝胶聚合物，分为,天然的高分子多糖类物质,和,合成的高分子化合物,两大类。,将白腐真菌的孢子包埋于琼脂糖胶和琼脂胶小珠内，制备方法如下：,孢子悬浮液的制备,要求孢子浓度达到10,7,数量级每毫升,配制2.5%（质量浓度）的,琼脂糖或琼脂水溶液,灭菌20分钟,冷却至45,1000mL,琼脂糖或琼脂水溶液,加入1mL混合,已灭菌并冷却至45,的葵花油45g,加入,混合,浸入冰水冷却，继续混合30分钟,无菌水洗涤至无油,海藻酸钙小珠,方法一,2g 海藻酸钠,溶解,60mL蒸馏水,海藻酸钠水溶液,108，10分钟,150mg干重的鲜菌团,过滤、研磨,40mL蒸馏水,（无菌）,菌的细胞悬浮液,2%（质量浓度）,海藻酸盐溶液,2%（质量浓度）,CaCl,2,溶液50mL,滴入,2h硬化,海藻酸钙小珠,多次洗涤,方法二,2g 琼脂和0.75g海藻酸钠,溶解,60mL蒸馏水,海藻酸钠水溶液,108，10分钟,150mg干重的鲜菌团,过滤、研磨,40mL蒸馏水,（无菌）,菌的细胞悬浮液,2%（质量浓度）,海藻酸盐溶液,2.5%（质量浓度）,CaCl,2,溶液50mL,10mL针筒，滴入,海藻酸钙小珠,多次洗涤,形成小珠,转入,磷酸缓冲溶液,1.460%K,2,HPO,4,0.226%KH,2,PO,4,K-卡拉胶颗粒,2g K-卡拉胶,溶解,60mL蒸馏水,海藻酸钠水溶液,108，10分钟,150mg干重的鲜菌团,过滤、研磨,40mL蒸馏水,（无菌）,菌的细胞悬浮液,2%（质量浓度）,海藻酸盐溶液,2%（质量浓度）,KCl,溶液50mL,滴入,2h硬化,K-卡拉胶小珠,多次洗涤,K-卡拉胶颗粒常规制备方法,条件优化与改进：,以生理盐水为溶剂，卡拉胶浓度为3%（质量浓度），常规菌量的1/2，,在2%（质量浓度）的KCl溶液中交联2h，切成小块。,明胶包埋小块,含6.25g干重细胞的,细胞悬浮液25mL,10mL的20%（质量,浓度）明胶,10mL的1.875%（质,量浓度）海藻酸钠,40混合,冷却至,5,软胶,硬胶,浸入,40g/L CaCl,2,切割,2mm明胶小块,0.05mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.6）,洗涤，使海藻酸钙-明胶复合物,中海藻酸盐漏出，直至洗涤干净,海藻酸钙-明胶复合物,使用0.01mol/L的戊二醛,（0.05mol/L磷酸钾缓冲液）,对多孔团块进行交联1h,（pH7.6）,无菌蒸馏水洗涤,PVA包埋法,PVA，聚乙烯醇，相对分子质量7700079000，为人工合成的高分子化合物。,PVA包埋最常用的是PVA-硼酸法,浓缩的孢子（菌体）悬浮液,含13%PVA和0.02%海藻酸钠（质量浓度）,水溶液，60,冷却至35,混合，滴入含有2%CaCl2的饱和硼酸中,在溶