生物化学大实验-4.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,4.3 离子交换层析,离子交换层析（,Ion Exchange Chromatography,简称为,IEC,）,是利用与固定相偶联的离子交换基团和流动相中的各组分的离子进行可逆交换而进行分离的一种层析方法。,1848,年，,Thompson,等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。,1935,年，,Adams,和,Holmes,通过酚、甲醛和磺酸缩聚成不容性的树脂，这就是第一个人工合成的离子交换树脂。离子交换层析介质就是在离子交换树脂（载体）上引入具有活性的离子交换基团，这些基团能与溶液中有相同电荷的基团进行交换反应。此法主要应用于分离小分子物质，如氨基酸、多肽、糖类、核苷酸、有机酸等的分离纯化。,4.3.1 基本原理,离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。偶联有可交换离子的树脂称为离子交换剂，它由三个部分组成：基质、电荷基团和可交换离子。电荷基团与基质共价结合后，形成一个带电体，再与可交换离子结合，成为完整的离子交换剂。可交换离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。可交换离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；可交换离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。,离子交换反应可以表示为：,阳离子：,RO,X,+Y,RO,Y,+X,阴离子：,RO,X,+Y,RO,Y,+X,其中,R,代表离子交换剂的基质，,O,和,O,分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与基质共价结合的电荷基团，,X,和,X,分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的可交换离子，,Y,和,Y,分别代表溶液中的离子基团。,离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。,那么，有哪些因素可以影响到离子交换剂与各种离子之间的结合能力呢？第一，随着离子浓度的增加，离子交换剂对其的结合力也显著提高，这常常用于离子层析柱的处理及再生；第二，离子交换剂与离子的结合力与其所带的电荷量成正比，而生物分子带电荷与否，或带什么样的电荷，主要决定于缓冲液的,pH,值和生物分子的,pI,值，当,pH,pI,时，带负电荷，当,pH,pI,时，带正电荷，而且，,pH,与,pI,之间的差距越大，它们所带的净电荷的量越大；第三，离子的原子序数越高，其半径越小，结合力也越大。当然，离子交换层析作为柱层析的一种，不可避免的也要受到缓冲液离子强度、柱温、流速等条件的影响。,下面以含有氨基的层析为例，说明之。当带有氨基的阴离子交换树脂在高,pH,值时，树脂不带电，而在低,pH,值时，可与水溶液中的可交换离子,OH,弱结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团与可交换离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如选用离子强度或,pH,的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度或,pH,的增大，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度或,pH,才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。,4.3.2 离子交换剂的种类和性质,根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。它们的区别在于它们电荷基团完全解离的,pH,范围，强酸型离子交换剂在较大的,pH,范围内电荷基团完全解离，而弱酸型完全解离的,pH,范围则较小，如羧甲基在,pH,小于,6,时就失去了交换能力。一般结合磺酸基团,R-SO,3,H,，,如磺酸甲基（简写为,SM,）、,磺酸乙基（,SE,）,等为强酸型离子交换剂，结合磷酸基团,R-PO,3,H,2,和亚磷酸基团,R-POH,2,为中等酸型离子交换剂，结合酚羟基,R-,苯环,-,OH,或羧基,R-COOH,，,如羧甲基（,CM,）,为弱酸型离子交换剂。一般来讲强酸型离子交换剂对,H,+,离子的结合力比,Na,+,离子小，弱酸型离子交换剂对,H,+,离子的结合力比,Na,+,离子大。,阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离子物质。同样根据电荷基团的解离度不同，可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。一般结合季胺基团,R-N(CH,3,),3,，,如季胺乙基（,QAE,）,为强碱型离子交换剂，结合叔胺,R-N(CH,3,),2,、,仲胺,R-NHCH,3,、,伯胺,R-NH,2,等为中等或弱碱型离子交换剂，如结合二乙基氨基乙基（,DEAE,）,为弱碱型离子交换剂。一般来讲强碱型离子交换剂对,OH,-,离子的结合力比,Cl,-,离子小，弱酸型离子交换剂对,OH,-,离子的结合力比,Cl,-,离子大。,1.,聚苯乙烯树脂离子交换剂,聚苯乙烯是以苯乙烯为单体，二乙烯苯为交联剂聚合而成的高分子聚合物，具有多孔网状结构，再引入不同的电荷基团，构成聚苯乙烯树脂。聚苯乙烯离子交换剂有交换容量大、刚性强、流速快等特点，但它与水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。常见的聚苯乙烯树脂离子交换剂,。,2.,纤维素离子交换剂,纤维素离子交换剂是以纤维素粉为基质，再引入电荷基团构成的。纤维素离子交换剂与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子物质。缺点是形状无定形，流速慢。常见的纤维素离子交换剂型号,。,3.,葡聚糖凝胶离子交换剂,葡聚糖凝胶离子交换剂是以,Sephadex,G25,和,G50,为基质，再引入电荷基团构成的。特点是具有较好的亲水性和凝胶网状结构，适合于分离蛋白质等大分子物质。常见的葡聚糖凝胶离子交换剂,。,4.,琼脂糖凝胶离子交换剂,琼脂糖凝胶离子交换剂一般以,Sepharose,CL6B,为基质，再引入电荷基团构成的。特点是具有较好的亲水性、凝胶网状结构的孔径大、刚性好、流速快、分辨率高、非特异性吸附少等。特别适合分离大分子的蛋白质和核酸等物质。常见的琼脂糖凝胶离子交换剂,。,4.3.3 离子交换层析操作的具体问题,离子交换层析的基本装置及操作步骤与前面介绍的柱层析类似，这里就不再重复了。下面主要介绍离子交换层析操作中应注意的一些具体问题。,1.离子交换剂的选择,离子交换剂的种类很多，究竟选择什么类型的离子交换剂呢？这对于离子交换层析要获得较高的目的组分的得率和分辨率是一个关键。,首先，要确定是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂。这取决于目的组分的,pI,及其稳定条件下的,pH,值，即所带何种电荷。如果,pH,pI,，,目的组分带负电，则选择阴离子交换剂。例如一个蛋白质样品的等电点为,4.7,，如果在,pH,范围为,5,6,的缓冲液中，蛋白质样品带负电，故选择阴离子交换剂进行分离；如果在,pH,范围为,3,4,的缓冲液中，蛋白质样品带正电，故选择阳离子交换剂进行分离。,其次，在强酸或强碱型、弱酸或弱碱型离子交换剂的选择中，一般分离蛋白质等大分子物质常选用弱酸或弱碱型离子交换剂，这样的离子交换剂洗脱条件温和不易使蛋白质等大分子物质失活。强酸或强碱型离子交换剂适用的,pH,范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端,pH,下的分离。,然后，要选择适当的离子交换剂基质。一般来说，聚苯乙烯离子交换剂等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。,最后，在确定离子交换剂后还需对可交换离子进行选择。让离子交换剂带上合适的可交换离子，才能与样品中的组分离子进行有效的交换。在对离子交换剂进行预处理时，可以使离子交换剂带上不同的可交换离子，例如阳离子交换剂可以带上,H,+,、,Na,+,等；阴离子交换剂可以带上,OH,-,、,Cl,-,等。如何选择不同的可交换离子呢？一般来说，不应选择与基质结合力过强的可交换离子，否则会造成组分离子难以与交换剂结合而减少交换的进行。据此，强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择,H,型和,OH,型；弱酸型和弱碱型离子交换剂应分别选择,Na,型和,Cl,型。另外，层析过程中被置换到流动相中的可交换离子，不能对样品组分有污染或破坏。例如在制备过程中用到的离子交换剂的可交换离子是,H,+,或,OH,-,，,因为其它离子都会对纯水有污染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用,H,或,OH,型离子交换剂，因为分离过程中,H,+,或,OH,-,被置换出来会改变层析柱内,pH,值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。,2.离子交换剂的预处理,市售的离子交换剂一般是干粉状的，使用前一般要进行预处理。首先取适量的干粉离子交换剂放入水中进行充分溶胀，使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来，再用水悬浮,/,倾倒以去除杂质和细小颗粒。然后用酸（或碱）浸泡，用水洗至中性，再用碱（或酸）浸泡，最后用水洗至中性。对于不同的离子交换剂，用于浸泡的酸碱浓度是不一样的。聚苯乙烯树脂用,1,mol/L,HCl,和,1,mol/L,NaOH,进行；纤维素离子交换剂用,0.5,mol/L,HCl,和,0.5,mol/L,NaOH,进行；,Sephadex,可用,0.1,mol/L,HCl,和,0.1,mol/L,NaOH,进行；,Sepharose,可用,0.51.0,mol/L,NaCl,和,0.10.5,mol/L,NaOH,快速处理。一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理，使离子交换剂带上需要的可交换离子。浸泡时间一般,30,min,。,处理时酸碱浓度过高、处理时间过长、温度过高等因素，都会导致离子交换剂被破坏。,3.离子交换剂的再生、转型和保存,离子交换剂的再生是指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。预处理用的酸、碱交替浸泡的处理方法就可以使离子交换剂再生，但有时也可以借助转型处理完成。离子交换剂的转型是指离子交换剂由一种可交换离子转为另一种可交换离子的过程。例如用,HCl,处理阴离子交换剂可将其转为,Cl,型，处理阳离子交换剂可将其转为,H,型；用,NaOH,处理阴离子交换剂可将其转为,OH,型，处理阳离子交换剂可将其转为,Na,型等等。对离子交换剂的预处理、再生和转型的目的是一致的，都是为了使离子交换剂带上所需的可交换离子。,离子交换剂的保存，首先必须将离子交换剂清洁干净，包括处理吸附在离子交换剂上的蛋白质等杂质，然后加入适当的防腐剂，一般加入,0.02%,的叠氮钠，,4,C,下保存,。,4.缓冲液的选择,离子交换层析中有两种缓冲液，一种是平衡缓冲液，另一种是洗脱缓冲液。不管哪一种缓冲液的选择，都包括离子类型、离子强度和,pH,等的选择。,平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。在选择离子类型时，平衡缓冲液中的离子应不能与离子交换剂有强烈的结合，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。在选择离子强度和,pH,时，首先平衡缓冲液要使样品中各组分（例如：蛋白质）保持稳定。其次样品的各组分应与离子交换剂有适当的结合。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，而杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定，直接就可以去除大量的杂质。如果杂质与离子交换剂有牢固的结合，而样品与离子交换剂结合不稳定，也是得到高纯度有效成分的一种方法。如果平衡缓冲液选择不合适，可能会对后面的洗脱带来困难，无法得到好的分离效果。,洗脱缓冲液是指将样品中各组分逐个从离子交换剂上解离下来的缓冲液。离子类型的选择同平衡缓冲液。而对离子强度和,pH,的选择，洗脱缓冲液首先也是要保证在整个洗脱过程中样品组分的稳定，其次是洗脱缓冲液要能够改变样品中的各组分与离子交换剂的结合力，并能形成足够的差异，使样品各组分依次被洗脱下来。洗脱缓冲液在离子交换层析中通常用梯度洗脱，有改变离子强度和改变,pH,两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变,pH,的洗脱，对于阳离子交换剂一般是,pH,从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是,pH,从高到低。由于,pH,可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。,5.上样量,离子交换层析的上样量除了与交换容量有着密切的关系，还受缓冲液、杂质离子等的影响。因此获得最佳的上样量是变化的、复杂的。通常大家会采取这样一个小实验找寻最佳值。设计一个系列的试管，装入选择的离子交换剂和缓冲液，然后分别加入不等量的样品，充分交换后，测定上清液中样品的含量，从而确定使离子交换剂饱和的上样量。,一般来讲，上样量不宜过大，约,1,5,的柱床体积为宜，使样品在层析柱上得到较好的分离效果。,6.洗脱速度,洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说对浓度低的样品流速可快一些，缩短上样的时间；对浓度高的样品流速可慢一些，有利于离子交换的进行。洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽等，过快会影响到样品组分的传质速度等，都会影响到分辨率。,7.样品的脱盐、浓缩,用离子交换层析获得的产物往往存在盐浓度较高和体积较大的特点，因此要进行脱盐、浓缩处理。脱盐可以通过凝胶层析、透析、超滤等方法进行；浓缩可以通过沉淀、透析、超滤、冷冻干燥等方法进行。,4.3.4 离子交换层析的应用,1.水处理,离子交换层析是一种简单而有效的去除水中的杂质及各种离子的方法，聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。纯水的制备可以用蒸馏的方法，但要消耗大量的能源，而且制备量小、速度慢，也得不到高纯度。用离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。一般是将水依次通过,H,型强阳离子交换剂，去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；再通过,OH,型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，就可以得到纯度较高的纯水。离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重复使用。,2.分离纯化小分子物质,离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在,pH 23,上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的的离子强度和,pH,，,这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。目前已有全部自动的氨基酸分析仪。,3.分离纯化生物大分子物质,离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。由于生物样品中蛋白的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法配合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。,4.4 亲和层析,亲和层析（,Affinity Chromatography,）,是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。早在,1910,年，就有人发现淀粉能吸附淀粉水解酶，于是就利用这一现象来分离淀粉水解酶；在,1951,年，有人以免疫吸附剂的形式来分离抗体；,1967,年，,Werle,等人开始用胰蛋白酶的不溶酶提纯胰蛋白酶抑制剂，等等。但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。直到,1967,年，,Axen,等人用溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使得此技术得到了快速的发展，逐渐发展成为一种新型的分离技术亲和层析。亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，在蛋白质分离技术中占有特殊的地位。它分离过程简单、快速，具有很高的分辨率，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。同时它也可以用于某些生物大分子结构和功能的研究。,4.4.1 亲和层析的基本原理,人们很早就认识到蛋白质、酶等生物大分子物质能和某些相对应的分子专一而可逆的结合，可以用于对生物分子的分离纯化。自然界生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的酶与其底物、抑制剂或辅因子；抗原与其抗体；激素与其受体或载体蛋白；核酸与其互补的碱基序列、核酸聚合酶或结合蛋白；细胞与其表面特异蛋白等等，它们之间都依靠氢键、范德华力、蔬水力等进行专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。,亲和层析就是通过将一对具有亲和力的两个分子（如,X,和,Y,）,中的一个（,X,）,共价结合在不溶性基质上（如常用的,Sepharose,4B,等），作为固定相，当含有另一分子（,Y,）,的混合样品流经该层析柱时，利用这一对分子间亲和力的特异性，让其挂在固定相上，而其它杂质不能与其结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子（,Y,）。,更换适当的洗脱液，再利用这一对分子间亲和力的可逆性，将其洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。被固定在基质上的分子（,X,）,称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。,前面讨论的各种层析方法，如吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是根据混合物中蛋白质之间的物理性质和化学性质（如蛋白质的溶解度、电荷、分子大小、吸附性质或疏水作用等）的差异来进行分离。这些方法的主要缺点是具有相似性质的蛋白质，由于这种性质的差异较小而难于分离。而对于含量低、杂质多、有生物学活性的样品来说，要分离纯化目的物质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需要较多的操作步骤、较长的时间，而且目的物质的回收率也随之降低，也会影响目的物质的活性。亲和层析是根据生物分子所具有的特异的生物学性质亲和力来进行分离纯化的。,具有类似理化性质的生物分子可能具有完全不同的生物专一性，这是亲和层析的分离基础。生物体内任何一种分子都有专一作用的对象，因此，理论上讲，所有的生物分子都能通过亲和层析来分离和纯化。亲和层析所显示出的独特的优越性使得该技术成为分离纯化生物分子，特别是分离纯化生物活性物质最重要、最理想的方法之一。,4.4.2亲和吸附剂的种类和性质,选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。它包括基质和配体的选择、基质的活化、配体与基质的偶联等等。,1.基质,基质的选择,亲和层析的基质构成固定相的骨架，目前常用作亲和层析基质的一般都是凝胶类层析介质。由于它们各自结构、理化性质和机械性能等因素的差别，在作为基质的使用中有一定的局限性。,理想的基质应该具有以下一些特性：,1)具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层析、再生等过程中不会因极端,pH、,离子强度、温度等条件，亲和层析基质的性质发生明显的改变。,2)必须有足够数量的能被有效活化的化学基团。亲和层析的基质应具有较多的化学活性基团，并且容易被化学物质活化，能够与配体稳定的共价结合。,3)具有良好的多孔网状结构。这种结构可以使待分离物能够充分与配体结合，提高了配体的有效浓度，并提供较高的亲和容量。基质的孔径过小，待分离物不能自由通过，使待分离物与配体结合的机率下降，降低亲和层析的吸附容量。,4),必须是化学惰性的和高度亲水的。基质对样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附，不影响配体与待分离物的结合；高度的亲水性，可以使溶液中的待分离物易于靠近配体并结合。,亲和层析的基质通常采用纤维素、交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃珠等，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。纤维素价格低，可利用的活性基团较多，但它的纤维性、非均一性以及非特异性吸附作用，限制了其广泛的应用。交联葡聚糖和聚丙烯酰胺的化学稳定性、机械性较好，但它们的多孔性较差，孔径小，活化过程中进一步交联，网孔缩小，不利待分离物与配体充分结合，只有大孔径型号凝胶可以用于亲和层析。多孔玻璃珠有机械强度高，化学稳定性好，不怕微生物的侵蚀，可高压灭菌等特点，但它表面带有羟基，在水溶液中表面带有负电荷，对于蛋白质具有非特异性吸附作用。,琼脂糖凝胶则基本符合上述理想基质的四个条件，同时,Sepharose,极易用溴化氰活化，在温和的条件下易于引入大量不同的基团。它具有的非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、易于活化等优点，使其成为目前使用最广泛的亲和层析的基质材料。如：,Pharmacia,公司的,Sepharose,4B,。,基质的活化,基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。配体和基质的偶联，通常首先要进行基质的活化。,溴化氰（,CNBr,）,活化,琼脂糖通常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引入各种适宜的活性基团。琼脂糖的活化方法很多，溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是基质中的邻位羟基和溴化氰反应生成亚胺碳酸活性基团，此基团可以和含有伯氨基（,NH,2,）,或羟基（,OH）,的配体反应，主要生成异脲衍生物，使配体结合在固相基质上。,反应如下：,含有伯氨基的配体，如氨基酸、蛋白质都可以结合在基质上，对于蛋白质而言，最可能发生反应的基团是,N,末端的,氨基和赖氨酸残基上的,氨基。,溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，结合的配体量大。利用溴化氰活化的基质通过进一步处理还可以得到很多其它的衍生物。这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的,pK,a,10.4,，,所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便，但现在有溴化氰活化好的,Sepharose,4B,出售，不需要特殊化学试剂及装置，避免了溴化氰的毒性。,环氧氯丙烷活化,在碱性条件下，可以用环氧氯丙烷进行活化，将环氧乙烷基结合在基质上。其活化效率高，活化臂较长，有利于生物大分子的结合。,由于活化后的基质都含有环氧乙烷基，可以结合含有伯氨基（,NH,2,）、,羟基（,OH,）,和硫醇基（,SH,）,等基团的配体，反应如下：,这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的,N,C,、,O,C,和,S,C,键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧乙烷基活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，,pH,为,913,，温度为,2040,C,。,这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。,1,4-丁二醚,活化,在含有,NaBH,4,的碱性条件下，,1,4-丁二醚,的一个环氧乙烷基可以与羟基反应，而将另一个环氧乙烷基结合在基质上。用该法活化的基质，与配体结合与上述用环氧氯丙烷活化的情况一样，其优缺点也相类似，不再赘述。,上面三种方法是比较常用的方法，另外还有很多种活化方法如：,N,羟基琥珀酰亚胺（,NHS,）,活化、三嗪活化、高碘酸盐活化、羰酰二咪唑活化、,2,4,6,三氟,5,氯吡啶（,FCP,）,活化、乙二酸酰肼活化、二乙烯砜活化等，总之，目前对基质的活化方法很多，各有其特点，应根据实际需要选择适当的活化方法。,“手臂”分子的引入,在亲和层析中，常用一些小分子化合物作为配体制备亲和层析剂，而待分离物又是大分子，二者在结合过程中很大程度上要受到基质和待分离的生物大分子间的空间位阻效应的影响。由于直接结合在基质上的小分子配体非常靠近基质，而待分离的生物大分子由于受到基质的空间障碍，使得其与配体结合的部位无法接近配体，影响了待分离的生物大分子与配体的结合，造成结合量的降低。解决问题的办法通常是在配体和基质之间引入适当长度的“手臂”，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长，增加配体的活动度和与待分离物的接触面，减少了空间位阻效应，提高了配体对待分离物的结合效率。加入“手臂”的长度要恰当，并非越长越好，过长则容易造成“手臂”折叠弯曲，反而降低结合效率；过短则效果不明显。,引入“手臂”常用的方法是将长度适当的氨基化合物,NH,2,(CH,2,),n,R,共价结合到用溴化氰活化的基质上，,R,通常是氨基或羧基，,n,一般为,2,12,。例如,Pharmacia,公司生产的,AH,Sepharose,4B,和,CH,Sepharose,4B,就是分别将,1,6,己二胺，,6,氨基己酸与,CNBr,活化的琼脂糖反应引入“手臂”分子。二者的末端分别为氨基或羧基，通过水溶性的碳化二亚胺的缩合作用可以分别与含羧基或氨基的配体偶联，,反应如下：,另外也可以通过进一步的活化处理，如：环氧活化的,Sepharose,6B,，,臂上带有一个活化的酯基；,CDI-,agarose,含有,N,氨基甲酸烷基酯等活性基团直接与各种配体偶联。引入“手臂”的基质与配体结合时，配体就可以离开基质一定的空间，从而可以减少空间位阻效应，易于与待分离物质结合。,2.配体,配体的选择,合适配体的选择对于亲和层析是非常重要的，此层析本质就是配体和待分离物质通过亲和力作用进行分离纯化的。分离生物大分子的配体应具备下列一些要求：,1),配体与待分离物质应当要有强弱适当的亲和力。原则是选择的配体与待分离的物质能否进行可逆的结合。亲和力太弱，待分离物质不易与配体结合；亲和力太强，待分离物质很难与配体分离。,2)配体与待分离物质之间的亲和力必须具有较强的专一性。也就是说配体与待分离物质之间的亲和力，有较强的特异性，同时对其它组分没有非特异性吸附作用。,3)配体必须有适当的化学基团能与活化剂的活化基团发生偶联作用，以便使基质得到较高的偶联率，并且配体与基质偶联后，对其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明显影响。,4),配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用。,选择合适的配体是亲和层析中的重要环节。完全满足上述条件的配体实际上很难找到，可以通过一些简单的小实验来确定尽量满足上述条件的最适宜的配体。,根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体和通用性配体。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如选择维生素类配体可以纯化与其专一结合的蛋白质；选择抗体或抗原类配体可以纯化抗原或抗体；选择酶的竞争性抑制剂、底物和辅助因子类配体可以纯化酶；选择相应的激素可以纯化激素受体蛋白；选择互补的碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白类配体可以纯化核酸；选择细胞表面特异性受体为配体来纯化细胞等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。,配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。解决这一问题的方法是使用通用性的配体。通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。,配体与基质的偶联,前面已经介绍了如何对基质进行活化，对活化后的基质要进行洗涤，才可以与配体偶联。对于用,CNBr,活化的,Sepharose,，,可以用大量冷却的水及不含有带氨基的缓冲液洗涤。洗涤液的性质最好与偶联配体时所用的溶液一致。,经过活化和洗涤过的基质与配体混合，缓慢搅拌，以便配体和基质充分偶联形成固相载体。在偶联结束后，基质上仍有少部分活化基团未被配体偶联，所以要将其封闭，以免影响后面的亲和层析分离。这些活化基团可以在弱碱性,pH,条件下过夜或在,Tris,-,HCl,缓冲液（,pH8.0,）,中,2,小时被水解。或者加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团，封闭的试剂有乙醇胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露糖等。然后，在室温下必须要反复洗涤该固相载体，以除去过剩的配体和封闭缓冲液等。,配体结合量的测定,配体与基质偶联后，通常要测定配体的结合量以了解其与基质的偶联情况，用以决定亲和吸附剂的吸附容量。配体结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体的量来表示。测定配体结合量的方法有直接测定法和间接测定法两种：,直接测定法：,2,4,6,三硝基苯磺酸钠（,TNBS,）,的颜色试验，利用,TNBS,与未结合配体和结合某些配体的基质作用呈现不同的颜色，再根据各种颜色的消光值，可以计算出配体结合量。用酸或酶作用，使得基质释放出配体或配体的裂解物；或通过适当的方法将凝胶溶解，而后直接用光谱法测量。对于能够吸收,250,nm,以上波长的配体，也可以直接用光谱法测定。,间接测定法：根据加入配体的总量减去配体与基质偶联后洗涤出来的量即可大致推算出配体的结合量。当配体可以用光谱法准确定量时，这种方法还是相当准确的。将亲和吸附剂装柱，加入特异吸附的物质，使其达到最大的结合量，然后再用特异的洗脱剂洗出该物质。根据分离此物质的量或上样量，即可推算出配体的结合量。,3.亲和吸附剂,判断一个亲和吸附剂的优劣，主要指标是亲和吸附剂的操作容量。影响其操作容量的，除了受配体性质的制约外，还受配体结合量、配体与待分离物质结合时的位阻效应大小、基质的多孔性，以及操作条件等因素的影响。提高配体结合量的方法很多。例如：通常溴化氰活化的基质的活性基团比环氧基活化的多，配体结合量可能较大；在用溴化氰活化时，增加溴化氰的量及反应的,pH,，,可以增加基质上活化基团的量，从而增大配体结合量；偶联过程中增加配体的量及增大反应的,pH,，,也可以增大配体结合量。,改善或避免配体与待分离物质结合时的位阻效应，前面已经介绍了通过在配体和基质之间引入“手臂”的方法。至于基质多孔性的影响，当基质与配体发生偶联时，基质的结构也会发生改变，如果基质的孔径变得很小，导致待分离物质不能渗透到基质筛孔中与配体结合，就会降低亲和吸附剂的操作容量。解决的方法只有选择一些与配体偶联后孔径变化小的基质，例如：琼脂糖。样品的浓度、,pH,值、离子强度以及上样的速度等因素对亲和吸附剂的容量的影响也不可轻视。若选择得当，则可提高亲和吸附剂对于分离物质的亲和力。一般情况下，样品的浓度低些、流速慢点或者让样品在柱中反应的时间长些，都会相对提高亲和吸附剂的容量。,实验中应注意很多事情不能绝对化，应考虑多种因素的综合影响。例如增大配体的结合量通常可以增加吸附容量，但有些增大配体结合量的条件可能会影响配体的结构，降低配体和待分离物质的亲和力，这样反而会降低亲和吸附剂的吸附容量。实际影响亲和吸附剂吸附容量的因素是非常复杂的，各种因素的影响都不是绝对的，要获得较高的吸附容量往往要考虑很多因素，并通过实验摸索来选择合适的条件。,4.4.3 亲和层析操作的具体问题,1.吸附条件的选择,亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。首先根据亲和吸附剂的吸附容量和待分离物质的总量选择大小合适的层析柱，一般来说，亲和层析柱相对其他的层析柱要短一些，通常10,cm,左右。上样时应注意选择适当的条件，包括平衡缓冲液的组成、流速、,pH、,离子强度、温度等，使亲和吸附剂和待分离的物质具有较强的亲合在一起。,在进行上样操作时，样品液的流速应比较慢，让样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。假如纯化样品杂质较多，待分离的生物大分子和配体的亲和力比较弱或样品浓度较高时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者待样品流出后重复过柱，进行多次吸附，以增加吸附量。,2.洗脱条件的选择,亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗和力，能够紧密地结脱出来。一般来讲，从亲和层析柱复合物中洗脱出待分离大分子物质的过程，所需要的条件比上样时形成复合物的条件剧烈。上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附，也可用不同的缓冲液进行洗涤，但应注意所用的缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显影响，以免将待分离物质同时洗下。最后留在柱上的只有专一吸附的待分离大分子物质。而根据待分离物质与配体间的亲和力的差异，亲和层析的洗脱可以分为三种情况：,亲和力较弱时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗脱，同时，可以加快平衡缓冲液的流速、适当提高洗脱的温度等条件，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来，得到待分离的大分子物质。这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。但洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低。,亲和力一般时，可以通过改变缓冲液的,pH,、,离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。可以选择梯度洗脱方式，这样可能将亲和力不同的物质分开。如果希望得到较高浓度的待分离物质，可以选择酸性或碱性洗脱液，或较高的离子强度进行快速洗脱，这样在较小的洗脱体积内就能将待分离物质洗脱出来，但选择洗脱液的,pH,、,离子强度在短时间内应不会影响待分离物质的活性，洗脱后要立即中和、稀释或透析，以免待分离物质丧失活性。,亲和力较强时，可用与配体竞争的缓冲液或者用蛋白质变性剂洗脱。竞争性洗脱是指特异的配体竞争性洗脱或底物竞争性洗脱，即利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上取代下来。第一种情况：选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，如这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。,第二种情况：选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。竞争性洗脱方法的优点是特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。,另外对于待分离物质与配体结合非常牢固时，可以使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂使蛋白质等待分离物质变性，而从配体上解离出来。然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。,3.温度的选择,生物分子间的亲和力是受温度影响的，通常亲和力随温度的升高而下降。所以在上样时可以选择适当较低的温度，使待分离的物质与配体有较大的亲和力，能够充分的结合；而在后面的洗脱过程可以选择适当较高的温度，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。,4.洗脱方式的选择,亲和层析的洗脱方式，原则上与离子交换层析的洗脱方式相似，主要有,3,种方式：简单洗脱，分步洗脱和梯度洗脱。,5.亲和吸附剂的再生和保存,亲和吸附剂的再生就是指使用过的亲和吸附剂，通过适当的方法去除吸附在基质和配体（主要是配体）上的杂质，使亲和吸附剂恢复亲和吸附能力。一般情况下，使用过的亲和层析柱，用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用。但随着使用次数增加，亲和吸附剂的吸附效率明显下降。尤其是当上柱样品是一个很粗的提取液或组织匀浆液时，亲和吸附剂可能会产生较严重的不可逆吸附，有变性蛋白的积累，这时需要使用一些比较强烈的处理手段，可采用高