第10章-遗传工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,遗传工程,就是人类用近代科学技术的最新成就，在离体条件下进行遗传操作，按照既定目标，有计划地改变生物遗传性，甚至建造新物种的一门学科。,广义的遗传工程,包括,细胞工程、染色体工程、基因工程,和在此基础上的,克隆技术,等几个方面的内容。,狭义的遗传工程,则指在分子水平上进行遗传操作的基因工程。,第10章 遗传工程,10.1 细胞工程,10.2 基因工程,10.3 克隆技术,10.1 细胞工程,（cell engineering）,应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上进行遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养，生产有用的生物产品或产生新的物种或品系。,细胞工程学可分为,染色体工程、细胞质工程和细胞融合工程,等几个方面。,3.细胞质工程(cytoplasm engineering),包括细胞质的代换和添加以及细胞器的代换和添加等。,将一个种(或品种)的细胞质用另一个种(或品种)取代，称为细胞质代换(cytoplasm substitution)。,（1）回交法,回交法是植物上进行细胞质代换的一个传统方法。这种方法的缺点是耗时长，而且细胞核不可能百分之百地为另一细胞核取代。,（2）核移植法,核移植法是一些动物上常用的方法，即用微量注射器取出一个细胞的核，再注入另一个已除去核的细胞质中，形成一个核和细胞质杂合的细胞。这种方法一般只适用于鱼和两栖类等卵细胞。,4.细胞融合（cell fusion）,概念：,又称体细胞杂交（,somatic hybridization,），指将不同来源的原生质体（去壁细胞）相融合并使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。,意义：,大大,扩大了杂交范围,，使一些用有性杂交方法不能获得杂种的杂交组合获得杂种；可以实现,父、母本细胞质的融合，,这对于由细胞质基因决定的性状（如雄性不育等）具有重要意义。,（1）原生质体培养,（2）植物体细胞融合,化学融合法,电融合法,原生质体（右）,原生质体电击融合,电击融合仪,（3）杂种细胞的筛选：,如何挑选出融合细胞；如何将异质融合的细胞与同质融合细胞区分开来。,营养缺陷互补筛选法,机械筛选法（如不同颜色的原生质体融合）,流式细胞仪筛选法（如不同荧光染料标记）,（4）体细胞融合的应用,创造新品种或新物种（种内、种间、属间杂种）,染色体加倍（体细胞自体融合）,培育核质杂种（先失活处理再融合）,细胞器、染色体的移植,植物细胞融合,Tomato,Potato,+,Po,mato,薯茄,第10章 遗传工程,10.1 细胞工程,10.2 基因工程,10.3 克隆技术,10.2 基因工程,1.基因工程的概念,（1）定义：,按照预先设计的生物施工,蓝图,，采用分子生物学和现代,生物技术,，对,基因进行操纵,，以达到定向,改变生物,的目的。,（2）目的：,将目的基因引入宿主细胞，并在宿主细胞中整合、表达和传代，从而创造出新型的生物，如新型微生物，转基因动物、植物等。,施工准备材料,即“目的”基因，载体和工具酶等。,把目的基因与载体结合成重组,DNA,分子。,把重组,DNA,分子引入受体细胞，即基因转移，建立分子无性繁殖系或称克隆。,鉴定筛选转基因系，即把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。,（3）基因工程施工的程序,2.载体导入技术,（1）载体,用来运载目的基因的工具称为载体（vector），常用的载体包括,质粒载体和病毒栽体,。,Ti质粒,（,Tumour inducing plasmid）,致癌农杆菌 Ach5 的 Ti 质粒结构,Shi,、,Roi,-,植物激素合成基因，它们分别对苗和根的生长起抑制作用；,Ocs,-,章鱼碱合成基因；,Agr,-,农杆碱合成基因；,Occ,-,章鱼碱分解代谢基因；,Agc,-,农杆碱分解代谢基因；,TL,、,TR-,分别表示,T-DNA,片段的左端和右端；,D-,毒性区,(,或用,Vir,表示,),；,Oir,-,复制起点；,Inc-,决定,Ti,质粒间不亲合性基因。,T-DNA(转移 DNA)，,大约有 20 kb，在土壤农杆菌感染植物细胞之后这个区域能够随机地,共价整合到植物染色体 DNA中,，成为正常的遗传成分。这个区域所含的冠瘿碱合成酶基因的启动子，能够,启动外源基因在植物细胞中表达,。但是，这个区所含的基因还能够决定肿瘤的形成和抑制植物细胞分化，此外还因为存在多种限制酶的多个切点，造成,体外重组 DNA 操作困难,。,因此，Ti 质粒在重组 DNA 的实用技术中往往需要加以改造。目前已经以 Ti 质粒为基础，构建了许多新的载体。,（2）重组DNA分子的构建,重组DNA（recombinant DNA）分子：,外源 DNA 与载体DNA 相连接而形成的DNA分子。,天然黏性末端切口的限制性核酸内切酶分别处理目的基因DNA 和载体 DNA,粘性末端,碱基互补形成双链,连接酶弥合切口,重组DNA分子。,（3）受体细胞,受体细胞是接受重组 DNA 分子，目的 DNA 在其中得以,复制扩增,、目的基因得以,表达,产生出正确的表达,产物,的细胞。,受体细胞来源的生物类型要与所使用的载体相互适应。,受体细胞要易于培养，适应于大规模生产或易于再生成完整的生物个体。,有时由于特殊的要求而需要选用特定的受体。,受体选择：,（4）重组 DNA 分子转入受体,将目的基因的 DNA 分子连结到载体 DNA 分子上后，就可以通过它进入到宿主细胞中。,转化（transformation）：,以细菌质粒 DNA 作载体，将外源 DNA 导入宿主的过程。,转染（transfection）：,噬菌体或病毒 DNA 为载体，将外源 DNA 片段导入宿主细胞的过程。,3.转基因技术,一个成熟、实用性强的植物转基因系统应该具备以下条件：,获得转基因植株的效率高；,重复性好；,设备要简单，易于操作；,由转化至获得转基因植株的时间相对较短；,无基因型的依赖性，即方法的适用范围广。,（1）用 Ti 和 Ri 质粒进行基因转移,只能侵染双子叶植物，对于作为重要粮食作物的,禾谷类单子叶植物则不能侵染,。近年来虽然有关于用农杆菌侵染部分禾本科植物获得成功的报道，但,侵染率是很低的,，无法在基因转移中实际应用。,重组质粒构建与增殖,新鲜细菌的培养,受体材料的选择,接种,愈伤组织诱导,愈伤组织分化成苗,检测分化植株，以确认是否为真正的转化苗,对转化植株进行田间性状观察分析,用 Ti 和 Ri 质粒进行基因转移的步骤：,（2）微注射法(microinjection),操作,技术要求严格,，整个操作必须在一个特制的无菌显微操作室中进行，而且,注射效率低,，,对受体细胞易造成伤害,。所以，现在除了在少数有条件的实验室仍采用外，已很少有人在植物基因转移中使用这种方法，但在动物细胞中仍广泛使用。,通过DNA显微注射获得转基因小鼠,（3）电穿孔法,短时间的,高压直流电脉冲,的冲击可以使原生质膜的分子疏松，形成,暂时性的小孔,(3nm4nm)，以后可以恢复正常，对原生质体生活力无大影响。存在于原生质体周围溶液中的,外源DNA可以通过这种小孔进入原生质体,，实现基因的直接转移。这种方法转化效率较高，操作简便。,（4）微束激光打孔法,原生质体在,短时间微束激光照射,下也可在质膜表面形成,小孔,（约 0.25m,2,左右），使 DNA 分子进入细胞。此法与电激穿孔法相比，要求的仪器比较复杂，而且对细胞的伤害较高，若光强度和照射时间掌握不好，形成的小孔无法恢复，原生质内容物流出后会引起细胞死亡。,（5）基因枪法,通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导人到受体细胞内，从而实现转化。依据所使用的动力不同分为三类：第一类是以火药爆炸力作为动力的加速微弹；第二类是以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类是以高压气体作为动力。,除用 Ti 和 Ri 质粒进行基因转移外的其他方法均属于,基因的直接转移,。,基因的直接转移大大,扩大了植物基因转移的范围,，特别是能对禾谷类等原生质体培养比较困难的重要粮食作物进行基因转移。,4.基因工程的应用,基因工程的发展历史虽短，但进展很快，已从理论研究阶段进入实际应用阶段，在农业、工业、环保和医疗等方面取得了令人鼓舞的成就。,转基因植物,转Bt基因棉花抗棉铃虫,转基因植物,转基因番木瓜抗环斑病毒,用基因重组蓝玫瑰,第10章 遗传工程,10.1 细胞工程,10.2 基因工程,10.3 克隆技术,10.3 克隆技术,1.克隆的概念,克隆（clone）一词源于希腊语“Kln”，意为“小分枝”或“后代”。在生物学里，,“克隆”表示复制一个生物个体，如用一只动物或一株植物，复制出一群个体，其中的每一个体都具有与母本相同的基因(遗传因子)。,“克隆”一词原先被用于描述由植物体通过无性繁殖所生产出来的后代。,简而言之，克隆就是无性生殖，就是“复制”、“翻版”。,基因克隆：,指在分子,(DNA),水平上开展研究工作以获得大量相同的基因及其表达产物；,细胞克隆：,是在细胞水平上开展研究工作以获得大量相同的细胞；,个体克隆,：经过一系列的操作产生一个或多个与亲代完全相同的个体，如克隆羊等；,组织克隆：,通过细胞培养定向诱导分化发育成为特定组织的技术，如克隆皮肤、心脏器官等。,克隆技术已经历了三个发展时期：,第一个时期是微生物克隆,，由一个细菌复制出成千上万和它一模一样的细菌而变成一个细菌群。,第二个时期是生物技术克隆,，如,DNA,、,细胞和组织的克隆。,第三个时期是动物的克隆,，即由一个细胞克隆成一个动物。,2.植物组织培养,任何细胞都有可能发育成一个完整的有机体，这种特性称为,细胞的全能性(totipotency)。,植物细胞的分化程度不如动物细胞高，现在已有可能,把来自根、茎、叶、花等任何部位的细胞培养出完整的植株。,香蕉试管苗大规模生产研究,水稻种间杂种胚的离体培养,2.动物的人工克隆,优良个体或群体的有性生殖的后代，优良性能不一定都同亲代一样，有的甚至不如亲代。,如果获得一种理想的表现型如产奶量高的奶牛，再通过,无性生殖保持、扩大和繁殖这种表现型,，即生产许多遗传上相同的个体，从经济角度讲显然是很有价值的。,对于动物细胞，在其受精卵分裂成,32,个细胞之前,，体细胞的“全能性”依然存在。但此时的细胞存在于母体内，无法被分离开来。,为了实现一个动物体细胞的克隆，必须首先,恢复体细胞的“全能性”,。这一过程叫做“初始化”。,正是这个复杂的“初始化”使得由动物体细胞进行克隆的过程变得困难重重。,小羊多莉(dolly),2000,年,1,月,13,日,美国俄勒冈州灵长类动物研究中心宣布，已获得一只,克隆母猴,“,泰特拉”,2000,年,6,月,16,_,22,日,世界首例体细胞克隆,山羊,“元元”,和,“阳阳”,在西北农业大学诞生,.,2000,年,3,月,14,日,英国,PPL,制药公司宣布，已培育出,5,只,克隆猪。,3.克隆技术的安全性,克隆技术和与其相关的基因重组技术意味着人类正在操纵自然的进程。,如对这种趋势没有警觉，不久的将来，人类可能被用于克隆。,克隆技术的这些应用掩盖了许多伦理问题。,追求某种理想的遗传特征的牲畜繁育计划，也隐藏着一定的风险。,小结,遗传工程,是指按照人们的需要，在离体条件下、在不同水平上对生物进行的遗传操作，它包括细胞工程、染色体工程、基因工程和在此基础上的克隆技术等几个方面的内容。,细胞工程,是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，在细胞水平上进行遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。,小结,基因工程,是,种绕过有性生殖的遗传操作，从分子水平上对基因进行各种操作处理，把基因从一种生物细胞转移到另一种生物细胞以改变受体细胞的某些遗传性状的技术。,克隆技术,则指由众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或细胞的技术操作。克隆是指生物体通过细胞进行的无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群的过程，简称为“无性繁殖”。动物体细胞的克隆是人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破。,