微生物基本知识.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物基本知识,实操：,微生物培养基的制作、细菌总数检测、大肠菌群检测,内 容 提 要,食品微生物学检验技术基础知识,实操,基础理论,食品微生物学检验技术基础知识,微生物的定义,微生物,:,微生物是存在于自然界中的,个体微小，结构简单、肉眼看不见，必须借助于显微镜才能看清它们外形的一群低等的、原始的微小生物的总称,。,葡萄球菌,大肠杆菌,酵母菌（芽痕）,棒状杆菌,弧状菌,链球菌,微 生 物 的 分 类,按其结构、化学组成分为,:,原核微生物,:,仅有原始核质，无核仁或核膜，细胞器很不完善。如细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体、螺旋体,真核微生物,:,细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体，细胞器完整。如真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物、藻类,非细胞类,:,体积微小，能通过除菌过滤器。如病毒和朊病毒等,微 生 物 的 特 点,个体小,面积大：,小于,0.1mm,。肉眼不可见。,分布广,种类多（,10,万多种）,：自然界中到处都有，如水、空气、土壤等,土壤中的数量最多。,代谢强，转化快：,发酵乳糖的细菌在,1,小时内可分解其自重,1000,10000,倍的乳糖；,生长旺，繁殖快：,微生物有惊人的繁殖速度，大多数微生物几十分钟内就可以繁殖一代,适应性强，易变异,（耐药性产生的原因）,菌落单位,菌落单位,-CFU,由单个菌细胞或几个同种菌细胞在培养基上长成肉眼可见的菌落，每个菌落就是,1CFU,光滑型菌落,粗糙型菌落,微 生 物 的 分 布,土壤：,是微生物生活的最适环境,水：,仅次于土壤的微生物分布、定居的第二场所,空气,：,空气中的微生物主要来源于带有微生物菌体及孢子的,灰尘,，这类微生物大多数是腐生性的，还来源于人和动物，它们大多数是通过呼吸道排出的，其中也包含有病原微生物，悬浮在大气中。,微 生 物 的 分 布,人体中的微生物,人自出生后，外界的微生物就逐渐进入人体。在正常人体皮肤、粘膜及外界相通的各种腔道（如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道）等部位，存在着对人体无害的微生物群，包括细菌、真菌、螺旋体、支原体等，称为,正常菌群。,微生物的作用及危害,1.,微生物的作用,绝大多数微生物对人和动物是有益的，已广泛应用于农业、食品、医药、酿造、化工、制革、石油等行业，发挥了越来越重要的作用。例如与我们日常生活密切相关的如酸奶、酒类、抗生素、疫苗等。,(,思考：什么食物是利用微生物制造的？,),2.,微生物的危害,微生物中也有一部分能引起人及动、植物发生病害，这些具有,致病性的微生物,，称为病原微生物。,如人类的许多传染病（感冒、伤寒、痢疾、肝炎等），均是由病原微生物引起的。从药品生产的卫生学而言，微生物对药品的原料、生产环境和成品的污染是造成生产失败、成品不合格的重要因素,。,沙门氏菌（禽、畜肉）,副溶血性弧菌（水产品）,我国微生物性食物中毒常见的致病菌和食物：,单核细胞增生李斯特菌（乳制品、冷藏食品）,大肠杆菌,O157:H7,（肉制品）等。,蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌（剩饭）,有害微生物对人类和生产的影响：,引起食品变质,引起食物中毒,导致人体患病,食品微生物检验的意义,1,、是衡量,食品卫生质量,的重要指标,也是判定被检食品,能否食用,的科学依据,2,、可以判断食品,加工环境,及食品卫生的情况,为卫生管理工作提供科学依据,3,、可以有效地防止或,减少食物中毒,和人畜共患病的发生,4,、保证产品的质量,避免,不必要的,损失,微生物检验常用仪器设备,光学显微镜,培养箱,水浴箱,4.常用仪器设备,超净工作台,：侧流式、,直流式和外流式,干燥箱,高压蒸汽灭菌器,4.常用仪器设备,离心机,滤菌器,均质器（匀浆器）,冰箱,4.常用仪器设备,玻璃器材及其他,试管,三角烧瓶,烧杯,玻璃棒,培养皿,接种环,涂布棒,酒精灯,移液管,移液器,剪刀、镊子,试管架,任务,1,微生物培养基的制作,任务分析,一 检测意义,培养基是供,微生物、植物,和动物组织生长和维持用的人工配制的养料。要制作培养基，就需要了解微生物的营养、营养物质吸收方式以及常用的培养基配制技术。,二 检测方法,GB/T 4789.28-2003,食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂,学习目标,知识目标：,1.,微生物生长所需的基本营养及运输方式。,2.,培养基的概念、分类及配制原则。,技能目标：,1.,正确进行培养基的分装和无菌检验。,2.,正确配制实验室常用培养基。,素质目标：,1.,严谨工作意识,2.,环保意识,相关知识,一、微生物的营养,1.,微生物的细胞化学构成,2.,微生物的营养构成,微生物的营养物质按照在机体的生理作用不同可分为,碳源，氮源，无机盐、水和生长因子。,二、微生物吸收营养物质方式,二、微生物吸收营养物质方式,二,、培养基的定义,培养基提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物，提供微生物所需能量，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等,。,相关知识,三、培养基的分类,（,1,）按成分分类,天然培养基,合成培养基,复合（半合成）培养基,（,2,）按物理状态分类,固体培养基,半固体培养基,液体培养基,相关知识,相关知识,2.,培养基配制原则,（,1,）选择适宜的营养物质。,（,2,）营养物质浓度及配比合适。,（,3,）控制,pH,条件。,（,4,）灭菌处理。,设备材料,（,1,）牛肉膏,（,2,）蛋白胨,（,3,）,NaCl,（,4,）琼脂,检测流程,检测流程,试剂名称,取量,计算结果,牛肉膏,3g,蛋白胨,10g,氯化钠,5g,琼脂,15,20g,水,1000mL,(1),计算,.,。按照配方中的比例计算配置,500mL,培养基所需试剂的量。,检测流程,（,2,）称量。,用普通天平（精确度为,0.01,）按照计算结果依次称取所需试剂，并将所需试剂一次取齐，置于天平左侧，每种称取完毕后，移放于右侧,（,3,）溶化。,将称量的试剂放入大烧杯或大烧瓶中，置于电炉上熔化，熔化后关闭电炉开关,检测流程,（,4,）初调,pH,。,在调,pH,前，先用精密,pH,试纸测量培养基的原始,pH,值，如果,pH,偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入,0.1mol/L NaOH,，边加边搅拌，并随时用,pH,试纸测其,pH,值，直至,pH,达,7,6,。反之，则用,0.1mol/L HCl,进行调节,（,5,）分装。,调好,pH,的培养基分装到锥形瓶中，分装时用玻璃棒将培养基导入到锥形瓶中,检测流程,（,6,）包扎,1,）在三角瓶管口塞入棉花塞,2,）用双层牛皮纸包裹棉塞及瓶口,3,）用棉绳对其进行捆绑，捆绑位置在瓶颈处,检测流程,（,7,）灭菌。,将包扎好的培养基放入高压灭菌锅进行灭菌,（,8,）无菌检查。,将配好的培养基放置在,37,恒温箱中培养,1,2,天，确认无菌后方可使用,（,9,）保藏。,将配制好的培养基放入冰箱进行保藏，保藏温度为,4,任务实施,1.,操作准备,2.,独立完成检测任务,3.,无菌操作技术,4.,场地清理,总 结,1.,相关知识,2.,实验准备情况,3.,无菌操作技术,任务,2,消毒灭菌技术,任务描述,岗位：微生物检验员,职责：根据实验要求对所需的仪器、培养基进行消毒灭菌。,任务：,将实验需要的培养基、玻璃棒、烧杯、试管进行消毒灭菌。,任务分析,一 检测意义,在进行微生物检前，可以通过消毒和灭菌技术，不同程度的将实验物品和实验环境中的微生物减少甚至完全杀灭，从而减少或消除外来微生物对试验结果的影响，确保微生物检测结果的真实性和准确性。,二 检测方法,1,、高压蒸汽灭菌,2,、干热灭菌法,学习目标,知识目标：,1.,常用的消毒灭菌的方法及灭菌原理。,2.,高压灭菌蒸汽锅和干热灭菌箱的基本构造。,技能目标：,1.,正确使用高压灭菌锅进行湿热灭菌。,2.,正确对玻璃器皿进行包扎并使用灭菌箱进行干热灭菌。,素质目标：,1.,严谨工作意识,2.,环保意识,二、常用消毒灭菌的方法,三、湿热灭菌法,相关知识,1.,湿热灭菌法：,湿热灭菌是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固。,2.,高压蒸汽灭菌,原理：,基于水在煮沸时所形成的蒸汽不能扩散到外面去，而聚集在密封的容器中，在密闭的情况下，随着水的煮沸，蒸汽压力升高，温度也相应增高。,四、干热灭菌法,细菌的繁殖体在干燥状态下，,80,100,1,小时可被杀死；芽胞需要加热至,160,170,2h,才杀灭。,1,干热灭菌法机理：,在干燥环境下进行的高温灭菌方法，在高温干燥的环境下使微生物氧化而并非使微生物的蛋白质变性。,2.,干热灭菌法特点,（,1,）干热灭菌的介质一般是热空气,（,2,）温度高，一般大于,200,，有时甚至达,320,（,3,）用于玻璃仪器，金属工具等的灭菌方法,相关知识,设备材料,（,1,）细菌培养基,（,2,）,玻璃仪器,（,3,）,干热灭菌箱,（,4,）高压蒸汽灭菌锅,检测流程,培养基的高压蒸汽灭菌,检测流程,培养基的高压蒸汽灭菌,（,1,）开盖。,向左转动手轮数圈，直至转动到顶，使锅盖充分提起，拉起左立柱上的保险销，向右推开横梁移开锅盖。,（,2,）加水,1,）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。,2,）观察控制面板上的水位灯,，,当加水至低水位灯灭，高水位灯亮时停止加水。当加水过多发现内胆有存水，开启下排汽阀放去内胆中的多余水量。,检测流程,培养基的高压蒸汽灭菌,（,3,）通电。,接通电源，此时欠压蜂鸣器响，显示本机锅内无压力，控制面板上的低水位灯亮，锅内属断水状态,（,4,）装锅、放入物品。,将装好灭菌物品的灭菌篮放回灭菌桶，并装入待灭菌物品,检测流程,培养基的高压蒸汽灭菌,（,5,）加盖、密封,1,）加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内,2,）把横梁推向左立柱内，横梁必须全部推入立柱槽内，手动保险销自动下落锁住横梁，旋紧锅盖,（,6,）设定温度、时间,1,）按一下确认键，进入温度设定状态，按上下键可以调节温度值,2,）再次按下确认键，进入时间设定状态，按左键或上下键设置需要的时间,3,）再次按动确认键，设定完成，仪器进入工作状态，开始加热升温,检测流程,培养基的高压蒸汽灭菌,（,7,）加压、排气、灭菌,1,）待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀,2,）继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于,100,的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的,（,8,）断电、开盖、出锅,1,）灭菌结束后，关闭电源,2,）待压力表指针回落零位后，开启安全阀或排汽排水总阀，放净灭菌室内余气,玻璃器皿的干热灭菌,检测流程,玻璃器皿的干热灭菌,检测流程,（,1,）装入待灭菌物品,1,）将玻璃仪器洗净,2,）将待灭菌物品用牛皮纸包裹好,3,）关闭箱门,（,2,）升温,1,）接通电源，按下开关，打开电烘箱排气孔，让箱内温度迅速上升,2,）升至,100,时关闭排气孔，直至达到设定温度,（,3,）恒温,1,）当温度升到,160170,时，恒温调节器会自动控制调节温度,2,）保持此温度,2h,玻璃器皿的干热灭菌,检测流程,（,4,）降温。,切断电源，自然降温,（,5,）开箱取物,1,）待电烘箱温度降至,70,以下时，打开箱门取出灭菌物体,2,）取物过程佩戴手套，避免烫伤,任务实施,1.,操作准备,2.,独立完成检测任务,3.,无菌操作技术,4.,场地清理,任务,3,食品中菌落总数的检验,任务描述,岗位：微生物检验员,职责：,通过菌落总数的测定可以及时判定食品在加工过程中是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供可靠的依据,。,任务：对样品进行菌落总数的检验,。,任务分析,一 检测意义,食品被污染程度的判定指标,判定细菌在食品中繁殖的动态,二 检测方法,GB 4789.2-2010,食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定。,学习目标,知识目标：,1.,菌落总数的定义及基本原理。,2.,菌落总数测定的卫生学意义及快速检验方法。,技能目标：,1.,能正确对平板进行菌落计数并报告。,2.,能正确对食品进行菌落总数的测定。,素质目标：,1.,严谨工作意识,2.,环保意识,相关知识,一、菌落总数,1.,菌落总数,指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培基成分、培养温度和时间、,pH,、需氧性质等），所得,1mL(,或,1g),被检样品中所含细菌菌落的总数。所得结果中包括一群在方法规定条件下生长的嗜中温的需氧菌和兼性厌氧菌。,相关知识,一、菌落总数,2,菌落单位（,CFU,）,食品菌落总数检测过程中的细菌细胞是以单个、链状或成堆的形式存在于食物及平板琼脂中，因而所形成的菌落可以来源于单个细菌细胞，也可以来源于链状或成堆存在的细菌细胞,1.,食品被污染程度的判定指标,2.,判定细菌在食品中繁殖的动态,三、菌落总数测定的基本原理,1.,菌落总数测定的原理,：,菌落总数的测定时根据微生物在固体培养基上所生产的菌落的生理及培养特征进行的测定。测定时，首先将待测定样品制成均匀的、一系列不同稀释度的稀释液，并尽量是样品中的微生物细胞分散，是单个细胞状态存在，再取一定稀释倍数的稀释液接种到培养基上，使其均匀分布。菌落由细菌细胞声场繁殖而成，因此统计菌落的数目，可计算出被检样品中的含菌数。,二、菌落总数的卫生学意义,2.,菌落总数测定的流程,相关知识,设备材料,（,1,）均质器,（,2,）平板计数琼脂培养基,（,3,）,10mL,无菌生理盐水管,（,4,）,225mL,无菌生理盐水,(0.9%),1.,样品预处理,检测流程,操作步骤,说明,(1),以无菌操作方法称取预处理样品置,225 mL,生理盐水罐内,（,1,）称量样品时，尽量将样品剪碎，利于样品均质液的制备,（,2,）天平读数接近时，应慢慢加入预处理样品，避免过量,(2),以无菌操作，将均质杯中的预处理样品混合液倒入均质袋中,在打开均质袋的时候，不要触碰到均质袋内壁，避免内壁沾染外来细菌,(3),用拍击式均质器拍打,1,2 min,，制成,1:10,的样品匀液,（,1,）拍打前一定要将均质袋中空气排净，避免影响拍打效果,（,2,）拍打前要将均质袋放置在拍打器中央的部位，保证拍打均匀,（,3,）均质袋口应折叠两次，避免拍打时均质液从袋口溢出,检测流程,2.10,倍稀释液的制备,（,1,）在无菌生理盐水管上标记稀释倍数，并从每个稀释度分别吸取,1 mL,空白稀释液加入一个无菌平皿内作空白对照,（,2,）在培养皿外圈标记操作时间，操作人及稀释倍数，并标记空白,（,3,）以无菌操作方法，用,1mL,无菌吸管吸取,1:10,样品匀液,1mL,，沿管壁缓慢注于盛有,9mL,稀释液的无菌试管中,（,4,）振摇试管，无菌操作，换用,1,支无菌吸管反复吹打样品匀液使其混合均匀，制成,1:100,的样品匀液,(5),按上述操作程序，以此类推，连续稀释，制备,10,倍系列稀释样品匀液（例如,10,-3,、,10,-4,倍稀释液）。,蛋糕的菌落总数的检测,检测流程,操作步骤,说明,（,1,）选择,2,个,3,个适宜稀释度的样品匀液，进行样品匀液的加入,将样品匀液加入到灭菌培养基的操作在无菌环境中进行,（,2,）以无菌操作，在进行,10,倍递增稀释后，按稀释倍数吸取,1mL,样品匀液加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行平皿,操作要迅速，以保证在,20min,内完成多个稀释度样品匀液的加如，在捡样加入平皿后，应在,20min,内倾注培养基，这样可防止细菌增值和片状菌落的产生,3.,将样品匀液加入灭菌培养皿,蛋糕的菌落总数的检测,检测流程,将,15mL,20mL,冷却至的平板计数琼脂培养基（可放置于,46,恒温水浴箱中保温）倾注平皿，转动平皿使其混合均匀,（,1,）在,20min,内加完所有样品匀液，开始倾倒培养基，避免产生片状菌落,（,2,）加入混合培养基时，可将皿底在平面上先前后左右摇动，再按顺时针和逆时针方向旋转，以使其混匀,（,3,）混合过程中要小心，避免培养基溅到皿边及上方，造成外溢,待琼脂凝固后，将平板翻转，,36,培养,24 h2 h,平皿内琼脂凝固后，在数分钟内即应将平皿翻转，进行培养，这样可避免菌落蔓延生长,4.,倒入培养基,5.,培养,任务实施,1.,操作准备,2.,独立完成检测任务,3.,无菌操作技术,4.,场地清理,任务,4,食品中大肠菌群的检测,任务描述,岗位：质监局微生物检验员,职责：食品的,大肠菌群,检验,任务：米果,大肠菌群,检验,任务分析,一 检测意义,大肠菌群是作为粪便污染指标菌,大肠菌群是评价,食品卫生,质量的重要指标之一,二 检测方法,GB4789.1-2010,食品微生物学检验 大肠菌群计数,方法,1:MPN,计数法,方法,2,：大肠菌群平板计数法,学习目标,知识目标：,1.,大肠菌群检测意义,2.,大肠菌群检测方法,技能目标：,1.,熟练无菌操作技术,2.,熟悉大肠菌群检测流程,素质目标：,1.,严谨工作意识,2.,环保意识,相关知识,一,.,大肠菌群,与粪便污染有关的细菌,需氧及兼性厌氧、在,37,能分解乳糖、产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。,可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。,二,.,检测方法,MPN,值法：,每,1g,或,1mL,样品内大肠菌群近似数。,MPN,为最大可能数,的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。,相关知识,设备材料,设备：,恒温培养箱、冰箱、恒温水浴箱、超净工作台、天平、振荡器、均质器,培养基与试剂,：,LST,（月桂基硫酸盐胰蛋白胨）、,BGLB,（煌绿乳糖胆盐,),初发酵试验：,样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管,LST,（月桂基硫酸盐胰蛋白胨）发酵管。,361,培养,482h,，观察是否产气。,复发酵试验：,将产气发酵管培养物转种于煌绿乳糖胆盐（,BGLB),管中，,361,培养,18-24h,，产气者，记为大肠群群阳性。,菌数报告：按照,LST,阳性管数根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查,MPN,表，报告每,100ml,（,g,）大肠菌群的,MPN,值。,检测流程,检验程序,检 样,25g(mL)样品+225mL稀释液，均质,10,倍系列稀释,选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种至,月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤管,不产气,产气,煌绿乳糖胆盐（BGLB)肉汤,不产气,产气,大肠菌群阴性,大肠菌群阳性,查MPN表,报告结果,361,48h2h,361,48h2h,检,样,初,发,酵,复发酵,报告,检测流程,检测流程,2.,大肠菌群 平板计数法,【,技能拓展,】,大肠菌群 快速检测法,任务实施,1.,操作准备,2.,独立完成检测任务,3.,无菌操作技术,4.,场地清理,Thank You!,