第11讲动物细胞培养生物制药III.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,第11讲,动物细胞生物制药应用,2010.11.2：世界肺炎日（第2个）,新民周刊,2010,5.17-23.P76-9,全球每年约有160万人死于肺炎链球菌,疾病,，,平均,每38,秒1名5,岁下儿童死,于此,病。导致儿童死亡的头号杀手，并高致,残：智力低下、癫痫（17%）、耳聋（,27.7%）。,中国是10个肺炎发病率最高的国家之一,，,1/4,儿童携带病菌,；,死亡儿童该病占,46.8%,。占西太平洋区的,70%,。,红霉素不敏感几乎达到100%,，,青霉素达,86%。,1983年23价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗,PPV23诞生。2000年针对2岁以下儿童的,7价肺炎链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世,。,目,前已经接种3,亿剂,，,世界第一大单,个疫苗,。,甲型H1N1流感病毒：2009年4,月墨西哥猪流感造成数150多,死亡事件，并在多个国家蔓延。,H5N1禽流感：2011年仍有爆发。,SARS病毒：2003年全世界性的,事件。,HIV病毒：艾滋病。,2009年12月3日，国家食品药,品监督管理局发现，江苏延申,和河北福尔生物制药股份有限,公司的7个批次人用狂犬病疫,苗存在质量问题。,2010年3月17山西疫苗事件,本节主要内容,1.杂交瘤技术生产单克隆抗体,2.病毒疫苗生产,本节关键问题,杂交瘤生产单克隆抗体的制备原理与技术流程,一,杂交瘤技术生产单克隆抗体,问题回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？,细胞融合（Cell,fusion）是指使用人工方法使两,个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。,体细胞杂交：克服有性不亲和性，实现远源遗传,重组，在育种方面意义重大。,杂交瘤细胞：具有两亲本特性，生物制药。,多克隆抗体与单克隆抗体,动物脾脏有上百万个B淋巴细胞,，,一个细胞,就,是,一,个,克,隆,，,它,针,对,抗,原,上,的,一,个,抗,原,决,定族,产生的抗体是,单,克,隆,抗,体,。,一,种,抗,原,通,常,具,有,多,个,不,同,的,抗,原,决,定,族,，,因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克,隆,抗,体,，,因,此,血,清,中,的抗,体,是,针,对,不,同,抗,原,决定族的,单,克,隆,抗,体,混,合,物,，,称,为,多,克,隆,抗,体,。,问题的引出,血液,得,到,的,只,能,是,混,合,抗,体,，,但,是,需,要,大,量,的,仅,针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不,可能的，因,此,必,须,采,用,其,他,方,法。,如果我们能,分,离,得,到,只,分,泌,某,一,种,特,异,性,抗,体,的,B,淋巴细胞,，,不,就,可,以,大,量,生,产,相,关,单,抗,了,吗？,问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？,很难离体培养B淋巴细胞。,（一）历史发现,1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适,应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与免,疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融,合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像,骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增,殖，又能持续地分泌特异性抗体。,（二）杂交瘤技术,将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到即能够,分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过,克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，,这种技术通称为杂交瘤技术（hydridoma,technique）。,（三）单克隆抗体应用领域,单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物,活性单一、与抗原结合的特异性强，广泛应用于,生物学和医学研究领域：,1.作为亲合层析的配体,2.作为生物治疗的导向武器,3.作为免疫抑制剂,4.探针,5,.增强抗原的免疫原性,6.,作为医学检验试剂,1.动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备,一般要经过初次免疫、第二次免役（向动物腹腔,内注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗,体）三个过程。如果需要免疫脾细胞，一般取最,后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬,液。,2.骨髓瘤细胞的获得与培养,骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样,杂交融合率高。,通常采用HPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）,与TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞,系,。,一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细,胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。,3.细胞融合,（1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，,用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞,数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾,细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。,（2）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比,例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培,养液洗,1,次，离心，弃上清，用滴管吸净残留液,体。,（3）30秒内加入预热的一定浓度、一定分子,量的PEG，边加边搅拌，在室温下融合。加预,热的不完全培养液，终止PEG作用。,（4）离心，弃上清，用20小牛血清等轻轻,混悬。将融合后细胞悬液加入96孔板，,100l孔，37、5CO,2,孵箱培养。,4,融合细胞的筛选,融合后的细胞类型,融合的脾细胞和瘤细胞、,融合的脾细胞和脾细胞,、,融合的瘤细胞和瘤细胞、,未融合的脾细胞,、未融合,的瘤细胞,以,及,细,胞,的,多,聚,体,等,。,正常的脾细胞在培养基中存活仅57天，无需特别,筛选，,细,胞,的,多,聚,体,形,式,也,容,易,死,去,。,剩余：,脾细胞与瘤细胞的融合细胞+,未融合的瘤细胞,+,融,合,的,瘤,细,胞,和,瘤,细,胞,，,其,中,后,两,种,需,进,行,特,别,的,筛选去除。,HAT,培养基筛选法,培养基中有三种关键,成分：次黄嘌呤,（hypoxanthine，,H）、氨基蝶呤,（aminopterin，A）,和胸腺嘧啶核苷,（thymidine，T），,所以取三者的字头称,为HAT培养基。,筛选原理,DNA的合成：,正常途径：糖、氨基酸核苷酸DNA,，可以被氨,基蝶呤阻断,胸腺嘧啶核苷激酶（TK）,补救途径：核苷酸前体,核苷酸DNA,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）,需要2种酶的参与,（1）氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因,此HAT培养基上的细胞不能采用该途径合成DNA。,（2）融合所用的瘤细胞一般是HPRT与TK缺陷型，,因此也不能采用补救途径合成DNA。,两条途径被阻断后，有怎样的结果呢？,瘤细胞（未融合的和多聚体）命运：因不能正常,合成DNA而死亡。,融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自,于淋巴细胞内的HPRT与TK,，因此可利用培养基中,的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成DNA，因此可在,HAT培养基中存活与繁殖。,5.,克隆化培养,将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的,每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间，培养一,段时间后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的,细胞。,找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后冻,存、体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。,6.分泌抗体的融合细胞的筛选,酶联免疫吸附法（ELISA）,EILSA主要是基于抗原或抗体能,吸附至固相载体,的表面并保持其免疫活性,，,抗,原,或,抗,体,与,酶,形,成,的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基,本原理。,在测定时，把,受检标本,（测定其中的抗体或抗原）,和,酶标抗原或抗体,按不同的步骤与固相载体表面,的抗原或抗体起反应，形成的,抗原抗体复合物,，,加,入,酶,反,应,的,底,物,后,，,底,物,被,酶,催,化,变,为,有,色,产,物,，,产,物,的,量,与,标,本,中,受,检,物,质,的,量,直,接,相,关,，,根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,7.单克隆抗体的大量生产,（1）实体瘤法,对数生长期的杂交瘤细胞按1310,7,cellsml,接种于小鼠背部皮下，每处注射0,.,2,ml。待肿瘤,达到一定大小后(一般1020天)则可采血，从血,清中获得单克隆抗体含量可达到到1-10mgml。,采血量有限。,（2）腹水制备法,腹腔注射110,6,个杂交瘤细胞，接种细胞710,天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入,试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可,用注射器抽取腹水，可反复收集数次。,腹水中单克隆抗体含量可达520mg/ml，,这是,目前最常用的方法。,（3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗,杂交瘤细胞,生物反应器,培养液,离心除去细胞，收集上清液提取抗体。,二,病毒疫苗,灭活疫苗,：,通,过,化,学,、,物,理,或,简,单,加,热,的,方,法,使,病,毒失去在宿主体内生长复制的能力，但仍保留了病,毒的免疫原性，接种人体后能产生对此病毒的抵抗,力，这种将病毒杀灭后制备的疫苗被称为灭活疫苗。,常用甲醛为灭活剂，灭活病毒核酸而不影响其抗原,性。例如：流行性乙型脑炎疫苗、狂犬病疫苗、流,感灭活疫苗。,减毒活疫苗,：,采,用,自,然,法,或,人,工,法,通,过,动,物,传,代,或,细胞传代筛选对人毒性低的变异株病毒。常见的有,脊髓灰质炎疫苗,、,麻,疹,疫,苗,、,流,感,温,度,敏,感,突,变,株,疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗,以,及一,些,联,合,疫,苗,（,如,麻,疹,、,腮,腺,炎,、,风,疹,联,合,疫,苗）。,病毒灭活疫苗,病毒需要在敏感细胞中才能增殖。通过动物细胞,培养繁殖病毒,。,大致步骤：,1.找到病毒敏感细胞,2.进行病毒的分离,3.病毒生产,4.动物实验,5.I、II、III期临床实验,6.灭活疫苗制品,病毒生产方法,1.动物接种：例如狂犬病毒，采用鼠、兔脑内接,种后收取脑组织制成悬液。,2.鸡胚、鸭胚接种：如马脑炎病毒采用10D龄鸡,胚接种，收获全胚体液。,3,.细胞培养法：不同的病毒采用相应的敏感细胞，,接种一定量的病毒，培养一段时间，冻融细胞，,离心收获上清。,一般流程,：,流行性乙型脑炎病毒灭活疫苗制备工艺,地鼠肾剪碎，胰酶消化地鼠肾细胞悬浮,液培养接种病毒感染细胞培养2-3,天收获病毒液甲醛灭活（22度，8天）,灭活病毒液安全及效力实验半成品,分装成品,三,动物细胞大规模培养生产药物存在问题与发展方向,（1）细胞密度低，产物浓度低。,（2）大规模、长时间培养过程中分泌产物能力易丢失，或产物,活性易降低。,（3）,动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体很昂贵。,因此大多仅能在小规模范围内研究，难以转化为生产力。,（4）,目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺。,（5）在线监测水平技术不完善，限制了优良培养系统的开发。,今后应重点开展的工作,（1）细胞培养过程代谢和产物形成机制等方面的理,论研究。,（2）开发能高密度生长、大量分泌目标产品的细胞,系。,（3）开发细胞生长性能优良、细胞解离容易，并能,重复使用的新型廉价的微载体。,（4）,研制高效的培养模式与系统，包括新型的无菌,生物反应器培养系统与工艺、先进的在线检测、分析与,自动控制技术等。,（5）基因工程与细胞培养技术结合的技术研究。,本节回顾,单克隆抗体,病毒疫苗,动物细胞培养主要是提供一个载体增殖的支撑技,术，需要其他技术配合，才能高效制备相关产品,