细胞培养2.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 基本培养技术,一、组织培养的基本操作和培养技术,1.培养操作基本要领和要求,1.1 无菌操作:防止污染是决定培养成功或失败的首要,条件。,1.2 培养前准备:,a.操作野消毒,:室内及台面紫外消毒，主要用于消毒,台面上用品。紫外灯照射期间，在操作台面上勿置培,养细胞和培养用液等物，以免受射线影响必要时可用,纸张覆盖。物品相互遮挡射线，会降低消,毒效果。,b.洗手和着装:,利用净化台需着白服；在无菌室内工作需着消毒衣帽。,c.火焰消毒：,在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。,注意:,金属器械不能在火焰中烧的时间过长，以防退火。烧过的金属镊等要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。已吸取过营养液的吸管不能再用 火焰烧灼，因吸管头中残留营养液能烧焦 形成炭膜，再用时会把有害物带入培养 液中。,1.3 培养操作：动作准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。为便于拿送用品，工作台面上的用品要有合理的布局，酒精灯置于中央。要保持一定顺序性，组织或细胞未做处理之前，勿过早暴露在空气中，培养液未用前，不要过早开瓶;用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。吸取营养液、BSS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中 不能面向操作野讲话或咳嗽，以免发生污染。,c.取皮肤:,切取1-2cm,2,皮肤，即满足培养要求。,d.取体液:,血液白细胞是常用的培养材料，一般多用静脉取血法。肝素抗凝，常用20,l/ml,抽血前先用,500l/ml(,生理盐水配制,),湿润针管后推出亦可。2.2 组织的分离,a.,离心分离法,:,如培养物为血液、羊水、腹水和胸水等,b.,机械分散法,切割分离法：,一般多剪切成,lmm,3,大小的块 机械分散法,:,某些软组织如脑、胚胎以及一些 肿瘤组织等，可采用机械法进行分散：压挤 法和压取法,c.消化分离法,胰蛋白酶消化法:,胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织，对传代细胞也非常好。Ca,2+,和Mg,2+,对胰蛋白酶的活性有一定抑制作用，故需用不含这些离子的BSS配制，血清可使胰蛋白酶灭活。胰蛋白酶的消化作用，与pH、温度、组织块的大小、组织的硬度以及胰蛋白酶的浓度都有关系(5mm,3,消化20-30min)。,胶原酶消化法：,适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。此酶在钙和镁离子存在情况下仍有活 性，故可用BSS和含有血清的培养液配制。,EDTA消化法:,是一种非酶性消化物，常用不含Ca,2+,和Mg,2+,的BSS配成0.02%的工作液。关于EDTA的作用机制:一些组织，尤其是上皮组织，在生存中需要Ca,2+,和Mg,2+,才能维持组织的完整性。EDTA能从这些组织生存环境中吸收这些离子，形成螯合物，能促进细胞相互分离。,注意:,使用EDTA处理细胞后，因血清对其无中和作用，一定要用PBS液冲洗净，因残留在培养液中的EDTA对细胞能产生不良作用。,2.3 细胞计数法:一般以细胞数/毫升表示【程序】(1)计数板:,酒精冲洗；滴加细胞悬液(2)染色:细胞悬液9滴,台盼蓝染液1滴,混匀,置2-3min(3)加悬液:轻滴1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙。(4)镜检:健康细胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均为不健康者。细胞数/毫升=4大格细胞总数/410000(5)接种培养：接种量在1-1010,5,个细胞/毫升范围,注意:,向计算板中滴细胞悬液时要干净利落，勿令液面盖过盖片，加量要适当，过多易使盖片漂移，过少易出现气泡.不理想时应重做，镜下计数时，偶见有由两个以上组成的细胞团，应按单个细胞数计算，如细胞团数占10%以上，说明消化不充分;或细胞数少于200个/10平方毫米或多于500个/10平方毫米时，均说明稀释不当，需重新制备细胞悬液，再重计数;经常使用同一细胞在相同条件下工作时，对各种情况已做到心中有数情况下，可略去某些环节，如染色检查等;计算板计算细胞数法有一定误差，用作测定细胞生长曲线时，每一样品应重复计算4次，取均值，较为可靠，若有电子细胞计数仪器当然更好;体外培养细胞在悬液中呈圆形，平均直径8-10,m,当被接种到底物上生长时，经过延展后，则呈扁形，在底物上所占的面积按直径算可达20-25微米，则lcm,2,的底物上可容纳4-5万个这样的细胞，这是理论上的数值，但在实际 应用中，当细胞达到80%汇合状态时便应做传代处理，因此细 胞数量比上述理论数量少。,2.4 细胞冻存,原理：,直接冻存，细胞内外环境中的水会结成冰晶，导致细胞发生一系列变化，如机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等，最终导致细胞死亡。如向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚砜，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，冻存在-135以下低温中，能减少冰晶的形成。而融化细胞时速度则要快，使之迅速通过最易受损的-5-0以后，细胞活力不受损害，仍能生长增殖。甘 油和DMSD分子量小、溶解度大、易穿透细 胞，使用范围在5-15%之间，常用10%。,程序：,(1)细胞:选对数生长期细胞(2)计数：细胞密度达510,6,，离心去上清(3)冻存液:先用培养液9分+DMSD 1分(或甘油)(4)分装:冻存管中1.5ml细胞悬液(5)封口:拧紧瓶口,注明:细胞名称，培养液名称，冻存日期(6)冻存：4放置30min，-20放置1h，-80放置24h，液氮冻存。,2.5 细胞的复苏：程序：(1)从液氮罐中取出冻存管，立即放入40水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。(2)用70%酒精擦试消毒后，开盖将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml培养液，离心。(3)用培养液混悬沉淀细胞，调整细胞密度，放培养箱中培养。,2.6细胞的运输:,冰瓶运输、液氮罐运输、充液法充液法：,(1)选生长状态良好的细胞，待达80%或90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部(过满易污染)，保留少许空间，塞紧瓶塞。空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落;(2)妥善包装和运送;一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响;(3)到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置 37,培养，次日传代。,二、常规组织培养法,1.初代培养法：是从供体获取组织后的首次培养。,消化培养法：,准备；布局；处理组织；剪切；消化；分离；计数；培养,组织块培养法：,剪切；摆布；瓶底向上36.5,2h,使小块微干涸;培养2.传代培养法:去除旧培养液；加入胰蛋白酶和EDTA混合液；细胞胞质回缩，细胞间隙增大，终止消化；PBS冲掉残余消化液；细胞悬液；分装。,注意：,80%-90%汇合；消化时间适度；消化液浓度要 适宜；,三、特殊培养法,1.二倍体细胞培养法:所谓二倍体细胞培养，是培养的细胞始终维持二倍体生物学性状的培养方法。,要点：,严格控制pH值；换液时间不要间隔太长；传代期不能过长；高质量的培养基和血清；低温冻存,方法：,吸除旧培养液；BSS冲洗；胰酶消化；培养液吹打制成单细胞悬液；接种培养,2.加支持物培养法：2.1支持物制备：特制有机玻璃、特氟隆薄膜、玻璃等,其中以玻璃片和特氟隆薄膜最为多用。前者便于做各种固定、染色处理和观察;后者最适做电镜技术，允许做包埋和切片。加支持物培养法程序与一般培养法相同，只是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物。,处理:,自来水浸泡24小时;96%酒精30-60分钟;蒸馏水浸泡30-60分钟;用干净软布擦拭干净(擦时应戴白手套工作);装入培养器皿中,高压或干热灭菌备用。,3.单细胞分离(克隆)培养:即把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。3.1 提高克隆形成率,适应性培养基或条件培养基制备：,(1)培养同源细胞(未克隆前时的同一细胞)至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24-48h后，吸出所有培养液;(2)离心:3000-4000/分离心l0min后，吸取上清液(3)滤过:再经0.22um滤膜过滤，低温冻存贮备用。用时取1分适应培养基+2分培养基混合使用。,血清:,胎牛血清，血清需做灭活处理。,饲细胞：,细胞制备:是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。(1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按10,5,细胞/毫升重新接种培养;(2)在细胞半汇合时，准备0.25,g/m1的丝裂霉素C，按2,g/lO,6,细胞的量加入到培养瓶中过夜;或用射线单次照射,剂量30-50戈瑞(Gy);(3)细胞经上述处理后，PBS液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时，胰酶消化制成悬液，按510,4,/mL接 入新培养基中;(4)48小时后，即可用于细胞克隆之用。,激素:,1-10U(国际单位)/ml营养液的胰岛素能促进很多细胞克隆的形成。,底物特殊处理:,多聚右旋赖氨酸处理,提高克隆形成率,浓度为1mg/ml,适应性底物:,无限细胞系易贴附于塑料底物上，初代培养细胞易贴附于胶原层或血浆纤维蛋白层底物上。测试细胞能否在软琼脂中生长，已成为测试转化细胞恶性的重要指标.3.2多孔塑料培养板单细胞克隆法:消化；低密度细胞 悬液的制备；接种；标记；分离扩大培养,4.球体细胞培养:大多数培养细胞都具有贴附在底物上生长成单层细胞的性质,如细胞长成片之后,让细胞片与底物脱离,更换到使细胞不易贴附的底物上继续生长时,则细胞片能卷聚成球体形,成为球体培养。,程序,(1),琼脂铺底的培养瓶：加5m1、2%琼脂培养基(2)取生长状态良好已联接成片的细胞，把细胞层纵横割划成若干小区后，倒出培养液;(3)胰酶消化，细胞小区边缘微卷终止消化，分装 (4)换液,5.微载体细胞培养法:带有不同基团的葡萄糖交联而成的大分子,分别为I、型由于微载体所带的基团不同,就决定了它们之间的差异。I型整个载体带有正电荷;型仅表面带有正电荷;型不带有电荷,其外表面被胶原层包裹;胶原是豚鼠皮肤的提取物,同样适于细胞的附着和生长。,水化和消毒:,按每克微载体加50-100ml,加入PBS,室温下放置应不少于3小时,并不时轻微搅动,PBS洗。采用高压蒸气消毒,或70%酒精浸泡。一般在250ml培养基中，微载体浓度为3mg/ml时。搅动速度每分钟 50-70转效果最好。,传代培养：,同常规培养。,悬浮培养法：,所培养的细胞本身属悬浮生长类型，无须做任何处理，在传代时先做离心处理去除旧培养液，添加新培养液即可。但在培养贴附型细胞时，因其有贴附性，必须进行干扰使细胞不能贴附，才能形成悬浮状态生长的细胞。,方法、用大培养瓶增加含有铁芯的无毒的聚苯乙烯棒，在培养中进行电磁搅拌，使细胞不能贴壁而成悬浮培养。,、用试管培养细胞，把试管置入带有悬转鼓的特,制温箱中进行培养，悬转鼓不停徐缓转,动，干扰细胞贴壁遂成悬浮培养。,第五章 组织培养的污染、检测和排除,一、污染途径,1.空气；2.清洗消毒；3.操作；4.血清；5.组织,二、污染对细胞的影响,真菌污染：,真菌种类繁多,但污染后均不难发现,大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面,肉眼可见;散在生长,镜下呈丝状、管状或树枝状菌丝,穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态,散在于细胞周边和细胞之间生长。,细菌污染:,细菌增殖迅速，能消耗营养液和产生毒素 抑制细胞生长，毒性大的细菌很快导致细胞 崩解死亡。应用抗生素对预防细菌污染有效。,支原体污染：,是一种,介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物，它无细胞壁，形态呈高度多样性，大小介于0.2-2微米，约有1%通过滤菌器。,支原体的检测：,相差显微镜检测：暗色微小颗粒，有类似布朗运动的表现，多位于细胞表面和细胞之间。低涨处理地衣红染色观察法：枸橼酸溶液处理细胞，Carnoy液固定，醋酸地依红染色，树胶封片。荧光染色法：荧光染料用Hoechst33258，它是一种能 与DNA特异结合的荧光染料。,支原体对细胞的影响：,支原体多附着于细胞的表面，它们能产生丰富的腺苷酸环化酶，该酶能将无毒的6-甲基嘌呤脱氧核苷转变为剧烈抗代谢的6-甲基嘌呤和6-甲基嘌呤核苷，对哺乳动物细胞具有毒性。需精氨酸型支原体能急速消耗培养中的精氨酸，导致细胞变形。此外支原体尚能影响DNA合成，引起一系列严重后果，而肺型支原体不需精氨酸，反而能促进PHA转化淋巴细胞和增加有丝分裂作用。有DNA活性的支原体能降低DNA的合成。另外，有的支原体还能与细胞竟争尿嘧啶，影响RNA的合成;能 抑制细胞合成干扰素，降低细胞的抵抗力。,三、微生物污染的排除,1.抗生素除菌法:比常用量大5-10倍的冲击法。,2.加温除菌法：置41中作用5-1O小时，最长可达,18小时,3.动物体内接种除菌法：借助免疫系统,4.巨噬细胞吞噬法：混合培养,