儿童感染性疾病诊断技术的应用与进展.pdf

专 家 笔 谈儿 科儿 童 感 染 性 疾 病 诊 断 技 术 的 应 用 与 进 展张泓马展韩 丁 丁杜 青 青 作 者 单 位：上 海，上 海 市 儿 童 医 院（上 海 交 通 大 学 医学 院 附 属 儿 童 医 院）检 验 科通 信 作 者：张 泓，电 子 邮 箱 为 作 者 简 介：张 泓，主 任 技 师，硕 士 研 究 生 导 师。现 任 上 海 市 儿 童 医 院（上 海 交 通 大 学 医 学 院 附 属 儿 童医 院）检 验 科 主 任。任 全 国 细 菌 耐 药 监 测 网 学 术 委 员 会 委 员、中 国 妇 幼 保 健 协 会 临 床 实 验 与 诊 断 医 学 委员 会 常 务 委 员、中 华 医 学 会 儿 科 学 分 会 临 床 检 验 学 组 委 员、中 国 医 师 协 会 青 春 期 医 学 专 业 委 员 会 临 床 验证 学 组 副 组 长、上 海 市 微 生 物 学 会 临 床 微 生 物 学 专 业 委 员 会 副 主 任 委 员、上 海 市 妇 幼 保 健 协 会 检 验 医 学专 业 委 员 会 副 主 任 委 员、上 海 市 卫 生 健 康 委 员 会 抗 菌 药 物 临 床 应 用 与 管 理 专 家 委 员 会 委 员。研 究 方 向：感 染 性 疾 病 病 原 学 诊 断、细 菌 耐 药 机 制 和 抗 菌 药 物 合 理 应 用 等。主 持 国 家 重 大 专 项 子 课 题、省 部 级、局 级课 题 余 项，以 第 一 或 通 信 作 者 发 表 收 录 论 文 余 篇。【摘 要】儿 童 免 疫 力 低 下，相 较 成 人 存 在 更 高 的 感 染 性 疾 病 发 生 风 险 和 更 严 重 的 生 命 健 康 威 胁，对 其 家 庭 和 社 会 造 成 极大 的 疾 病 负 担。感 染 性 疾 病 病 原 体 检 测 方 法 主 要 包 括 病 原 体 培 养 技 术、抗 原 或 抗 体 检 测 技 术、核 酸 扩 增 技 术 和 宏 基 因 组二 代 测 序 技 术 等。每 种 方 法 的 优 缺 点 和 合 适 的 应 用 场 景 不 同。合 理、有 效 运 用 检 测 技 术 有 助 于 尽 早 明 确 病 原 体，对 感 染性 疾 病 的 诊 治 和 改 善 预 后 至 关 重 要。【关 键 词】儿 童 感 染；病 原 体；检 测 技 术【基 金 项 目】上 海 市 重 点 临 床 专 科 建 设 项 目（）【引 用 本 文】张 泓，马 展，韩 丁 丁，等儿 童 感 染 性 疾 病 诊 断 技 术 的 应 用 与 进 展上 海 医 学，（）：中 图 分 类 号：感 染 性 疾 病 是 儿 童 最 常 见 的 一 类 疾 病，也 是造 成 儿 童 死 亡 的 重 要 原 因，严 重 威 胁 着 儿 童 的 生命 健 康。感 染 性 疾 病 的 病 原 体 复 杂 多 样，包 括 病毒、细 菌、真 菌、非 典 型 病 原 体、寄 生 虫 等。近 年来，新 型 冠 状 病 毒、甲 型 流 行 性 感 冒 病 毒、禽 流 感病 毒 等 新 发，以 及 再 发 的 呼 吸 道 感 染 病 原 体 不 断出 现，对 患 儿 家 庭 和 社 会 造 成 了 严 重 的 疾 病 负担。呼 吸 道 感 染、血 流 感 染、中 枢 神 经 系 统 感 染等 是 儿 童 常 见 的 感 染 性 疾 病，尽 早 明 确 感 染 病 原体，有 助 于 合 理 使 用 抗 微 生 物 药 物，从 而 改 善 疾 病的 转 归 并 降 低 死 亡 率，做 到 对 传 染 病 的 早 发 现、早隔 离、早 报 告 和 早 治 疗。病 原 体 培 养以 传 统 培 养 法 为 基 础 的 病 原 菌 鉴 定 方 法 一 直是 感 染 性 疾 病 诊 断 的“金 标 准”，被 广 泛 应 用 于 大多 数 细 菌 和 真 菌 的 病 原 体 检 测。培 养 法 是 病 原 体在 体 外 特 定 的 环 境 下 繁 殖、生 长 后 经 鉴 定 最 终 确定 种 类 的 方 法，获 得 的 病 原 体 可 以 进 行 药 物 敏 感试 验，为 抗 感 染 治 疗 提 供 精 准 依 据。培 养 法 的 主要 优 点 是 特 异 度 高、成 本 低，但 要 求 操 作 人 员 具 备较 高 的 专 业 技 术 水 平，且 耗 时 较 长，一 般 需 要 ，往 往 会 导 致 病 原 学 诊 断 延 迟，感 染 性 疾 病患 儿 的 起 病 急、进 展 快，对 病 原 学 诊 断 的 时 效 性 要求 高。近 年 来，临 床 微 生 物 鉴 定 中 采 用 的 飞 行 时间 质 谱（质 谱）法 扩 大 了 细 菌 和 真 菌的 鉴 定 种 类 范 围，缩 短 了 鉴 定 时 间，使 报 告 周 期 缩短 至 ，时 间 延 迟 情 况 得 到 了 一 定 程 度 的改 善。需 要 指 出 的 是，培 养 结 果 受 抗 菌 药 物 的 使用、病 原 体 载 量、培 养 基 的 选 择 等 因 素 影 响，阳性 率 较 低，尤 其 是 儿 童 常 见 的 苛 氧 菌 因 标 本 采 样不 易，其 培 养 阳 性 率 会 更 低。临 床 微 生 物 技 术人 员 应 特 别 关 注 并 持 续 改 善 这 些 影 响 因 素，以 提高 病 原 体 培 养 的 阳 性 率。而 病 毒、支 原 体 和 衣 原 体等 非 典 型 病 原 体 的 培 养 难 度 高，限 制 了 该 方 法 在 医 ，疗 机 构 的 常 规 开 展。病 原 体 抗 原 或 抗 体 检 测 技 术病 原 体 的 抗 原 或 抗 体 检 测 是 难 培 养 病 原 体（病 毒、支 原 体 等）检 测 的 重 要 方 法，该 方 法 利 用 抗原抗 体 反 应，使 用 荧 光 素、酶、发 光 底 物、胶 体 金 颗粒 等 对 已 知 抗 原、抗 体 或 配 体（如 金 黄 色 葡 萄 球 菌蛋 白、生 物 素）进 行 标 记，对 样 本 中 相 应 的 病 原体 抗 原 或 抗 体 进 行 检 测 的 技 术。临 床 广 泛 应 用 的抗 原 或 抗 体 检 测 技 术 包 括 直 接 或 间 接 免 疫 荧 光法、化 学 发 光 和 免 疫 胶 体 金 层 析 法。免 疫荧 光 法 通 常 配 合 荧 光 显 微 镜 用 于 病 原 体 抗 原 的 原位 检 测，后 三 种 则 主 要 用 于 检 测 体 液 或 裂 解 后 的组 织 中 所 存 在 的 病 原 体 抗 原 或 抗 体。抗 原 检 测 的 优 点 是 用 时 短、成 本 低、操 作 简便、特 异 度 较 高，常 用 于 门、急 诊 快 速 筛 查，但 其 缺点 是 灵 敏 度 不 高，易 受 标 本 采 集 质 量 和 标 本 中 病原 体 载 量 等 因 素 影 响。若 抗 原 检 测 结 果 为 阴性，但 临 床 不 能 排 除 感 染 的 情 况 下，建 议 采 用 病 原体 核 酸 检 测 方 法 予 以 确 认。抗 体 检 测 也 是 诊 断 感 染 性 疾 病 的 有 效 补 充 手段。感 染 发 生 即 可 检 出 病 原 体 特 异 性 免 疫球 蛋 白（，）抗 体，可检 出 低 亲 和 力 的 抗 体，并 随 着 抗 体 亲 和 力 成熟，逐 渐 产 生 高 滴 度、高 亲 和 力 的 抗 体。抗 体检 测 受 样 本 采 集 的 影 响 小，且 抗 体 水 平 和 抗 体 亚型、亲 和 力 的 不 同 可 反 映 机 体 感 染 的 状 态，常 用 于监 测 疾 病 进 展 和 疗 效。和 低 亲 和 力 的 抗体 通 常 作 为 现 症 感 染 的 指 标，而 高 亲 和 力 通常 作 为 既 往 感 染 的 指 标。型 抗 体 的 出 现 常 常与 膜 免 疫 应 答 有 关。急 性 期 和 恢 复 期 血 清 抗 体 滴度 增 高倍 及 以 上 是 病 原 体 感 染 回 顾 性 诊 断 的 重要 依 据。然 而，抗 体 产 生“窗 口 期”的 存 在 可 导致 该 方 法 在 感 染 早 期 的 假 阴 性，尤 其 是 患 儿 的 免疫 系 统 尚 不 成 熟，可 能 导 致 产 生 抗 体 能 力 相 对 较低，带 来 假 阴 性 或 者 抗 体 滴 度 偏 低 等 问 题，抗 体 检测 结 果 需 要 结 合 疾 病 进 程 和 患 儿 自 身 情 况 综 合 分 析。核 酸 扩 增 技 术核 酸 扩 增 技 术 通 过 扩 增 核 酸 序 列 并 检 测 病 原体 特 异 性 目 的 基 因，从 而 判 断 是 否 存 在 特 定 病 原体 或 病 原 体 特 定 耐 药 基 因。实 时 荧 光 技 术克 服 了 早 期 技 术 的 实 验 室 污 染 问 题，使 得 核酸 检 测 在 病 原 诊 断 中 得 到 推 广 应 用。相 较 于 传 统的 病 原 体 培 养 法 和 免 疫 学 技 术（抗 原、抗 体 检 测），该 技 术 灵 敏 度 高、特 异 度 高、用 时 短，可 大 大 缩 短诊 断 的“窗 口 期”，并 且 可 以 对 病 原 体 进 行 定 量 检测、耐 药 基 因 检 测，以 及 基 因 分 型。多 重 通 过 多 对 特 异 性 引 物 和 多 色 荧 光标 记，可 在 一 次 反 应 中 扩 增 多 个 靶 标，从 而实 现 同 时 检 测 多 种 病 原 体。该 技 术 有 利 于 儿 童 混合 感 染 的 病 原 学 诊 断，同 时 也 为 病 原 体 的 鉴 别 诊断 及 医 院 内 感 染 的 防 控 提 供 了 支 持。多 重 操 作 简 单 快 速，特 异 度 和 灵 敏 度 均 较 高，尤 其 适 合一 类 疾 病 疑 似 病 原 体 的 成 组 检 测。但 是 一 个 多 重 体 系 检 测 的 病 原 体 很 难 超 过 种，因 此 多 重 难 以 满 足 菌 群 分 析 等 高 通 量 测 序 的 需 要。目 前，核 酸 即 时 检 测（，）的 临 床 应 用 是 分 子 诊 断 领 域 的 研 发 热点，这 些 检 测 系 统 通 常 使 用 微 流 控、多 重 、恒 温 扩 增 等 技 术，集 样 品 制 备、扩 增、检 测 和 分 析于 一 体，整 个 检 测 过 程 在 封 闭 的 容 器 或 管 路 中 自动 进 行，避 免 了 产 物 污 染，无 需 特 殊 场 地，操 作 简便，可 在 门 急 诊 一 线 快 速、便 捷 地 检 测 多 种 病 原 体靶 标 和 抗 菌 药 物 耐 药 基 因。年 的 新 型 冠 状 病毒 感 染 疫 情 带 来 的 核 酸 快 速 检 测 需 求 推 动 了 病 原体 核 酸 的 迅 速 发 展。值 得 注 意 的 是，病 原 体 核 酸 扩 增 结 果 为 阳 性只 能 说 明 在 标 本 中 存 在 该 病 原 体 的 核 酸 片 段，并不 代 表 其 中 必 定 含 有 活 的 病 原 体，也 不 代 表 感 染必 然 是 由 该 病 原 体 所 致，需 要 考 虑 该 病 原 体 的 载量，以 及 临 床 症 状 和 体 征 作 出 综 合 判 断。宏 基 因 组 二 代 测 序 技 术（犿 犲狋 犪 犵 犲 狀 狅 犿 犻犮 狊 狀 犲 狓 狋犵 犲 狀 犲 狉 犪 狋犻狅 狀 狊 犲 狇 狌 犲 狀 犮犻 狀 犵，犿 犖 犌 犛）是 新 发、突 发 传 染 病 和 临 床 未 知 病 原体 鉴 定 的 重 要 二 代 测 序 技 术 方 法。的 原 理是，对 感 染 部 位 样 本 中 提 取 的 所 有 非 人 核 酸 进 行高 通 量 测 序，通 过 测 序 数 据 与 数 据 库 序 列 的 比 对分 析，推 测 样 本 中 包 含 的 病 毒、细 菌、真 菌 和 寄 生虫 等 的 病 原 微 生 物 种 类。不 依 赖 培 养 法 或 特 异 性 的 核 酸 扩 增，无 偏 倚 性，适 用 于 各 种 临 床 样 本，理 论 上 可 在 同 一次 测 序 中 鉴 定 所 有 的 病 原 体（病 毒、细 菌、真 菌 和寄 生 虫），且 可 同 时 提 供 病 原 的 耐 药 基 因 和 菌 群 构成 信 息。在 复 杂 生 物 样 品 如 呼 吸 道 感 染 或 侵 袭 性感 染 的 病 原 体 研 究 中 具 有 重 要 优 势。上 海 医 学 年 第 卷 第期有 急 危 重 症 表 现，不 除 外 感 染；或 高 度 怀 疑 存在 血 流 感 染、呼 吸 道 感 染、中 枢 神 经 系 统 感 染；或病 原 体 未 明 的 局 部 感 染 可 能 存 在 不 可 逆 损 伤 的 重症 患 儿，若 经 验 治 疗 效 果 不 佳 且 常 规 微 生 物 学检 查 结 果 为 阴 性；或 疑 似 存 在 混 合 感 染，常 规 微 生物 检 查 结 果 无 法 解 释 临 床 表 现 全 貌 的 患 儿 可 考 虑 检 测。另 外，疑 似 新 发 病 原 体，临 床 上 提 示可 能 有 一 定 的 传 染 性，感 染 性 疾 病 的 聚 集 性 发 病或 疑 似 院 内 感 染 暴 发，在 常 规 检 测 无 法 及 时 明 确病 原 体 时 也 可 以 采 用 检 测。研 究 结果 表 明，在 传 统 培 养 法 和 检 测 结 果 为 阴 性 的患 儿 中，采 用 对 病 原 菌 的 检 出 率 可 达 。结 果 的 本 质 与 相 似，可 提 示 样 本中 检 出 或 未 检 出 某 微 生 物 的 核 酸 片 段，但 无 法 明确 该 物 种 与 感 染 的 关 系。除 了 载 量 小 或 核 酸 抽 提困 难 的 病 原 体（如 结 核 分 枝 杆 菌）外，检 测的 阴 性 预 测 值 较 高，阴 性 结 果 对 于 排 除 感 染 的 价值 较 大。的 实 验 操 作 较 复 杂，对 环 境 微 生 物 的污 染、样 本 起 始 量、测 序 深 度 和 分 析 能 力 的要 求 高，结 果 易 受 人 源 宿 主 和 环 境 物 种 遗 传 物 质的 噪 声 信 号 干 扰 导 致 假 阳 性，无 法 完 全 区 分 检 测到 的 核 酸 来 源 微 生 物 是 否 为 感 染 源，尤 其 是 在 出现 所 检 出 病 原 微 生 物 的 读 长（数）较 低、与 临床 表 现 不 符、检 测 到 少 见 或 罕 见 病 原 微 生 物 的 情况 下。数 据 分 析 和 结 果 报 告 需 综 合 患 儿 临 床 表现、抗 菌 药 物 使 用 情 况，以 及 实 验 室 检 查 结 果 等 才能 判 断 其 临 床 意 义。三 代 测 序在 二 代 测 序 技 术 发 展 的 同 时，三 代 测 序 技 术一 经 提 出 便 引 起 人 们 关 注，但 因 其 单 碱 基 准 确 度较 低 且 成 本 高 昂，在 人 类 等 基 因 组 较 大 的 生 物 中尚 未 得 到 广 泛 应 用。三 代 测 序 主 要 有 和 两 种。受 技 术 原 理 限 制，二 代 测 序 读 段的 常 见 读 长 在 左 右。而 三 代 测 序 单个 读 段 的 读 长 则 大 大 延 长，可 达 数 十 至 数 百，甚至 数，非 常 适 合 对 基 因 组 重 复 区 或 结 构 变 异 进行 测 序，因 而 常 被 用 于 基 因 组 从 头 组 装。对 于 原核 生 物 而 言，因 其 基 因 组 较 小，用 三 代 测 序 进 行 高深 度 测 序，可 更 准 确 地 获 得 全 基 因 组 序 列 而 无 需复 杂 的 拼 接 过 程。近 年 来，测 序 仪的 单 碱 基 准 确 度 有 了 较 大 提 高，因 而 更 受 临 床 关注。的 建 库 和 测 序 方 法 简 单 且 耗 时 较短，可 在 内 完 成 病 原 体 和 耐 药 基 因 检测。未 来，随 着 测 序 成 本 的 降 低，三 代 测 序 有 望在 临 床 检 测 上 发 挥 更 重 要 的 作 用。结 语儿 童 是 感 染 性 疾 病 的 高 危 人 群，早 期、快 速 的精 准 诊 断 是 进 行 及 时 的 对 症 治 疗、降 低 重 症 发 生率 的 重 要 前 提。随 着 技 术 的 发 展，实 验 室 用 于 感染 性 疾 病 诊 断 的 技 术 不 断 增 多，从 传 统 的 病 原 体培 养、抗 原 或 抗 体 检 测 到 核 酸 扩 增 技 术，以 及 ，临 床 医 师 和 微 生 物 技 术 人 员 应 充 分 了 解每 一 种 技 术 的 优 势 和 不 足、合 适 的 应 用 场 景 和 结果 的 解 释，以 合 理 有 效 地 运 用 传 统 技 术 和 分 子 诊断 技 术，为 感 染 性 疾 病 的 精 准 诊 治 和 控 制 其 传 播发 挥 积 极 作 用。参考文献 ，（），（）：?，?，：，：，：，（）：，（）：，犈 狊犮 犺 犲 狉犻犮 犺 犻 犪 犮 狅 犾犻 ，（）：，：，（）：，（）：中 华 医 学 会 儿 科 学 分 会 新 生 儿 学 组，中 华 儿 科 杂 志 编 辑 委员 会宏 基 因 组 二 代 测 序 技 术 在 新 生 儿 感 染 性 疾 病 中 的 临床 应 用 专 家 共 识中 华 儿 科 杂 志，（）：，（）：中 华 医 学 会 检 验 医 学 分 会 临 床 微 生 物 学 组，中 华 医 学 会 微生 物 学 与 免 疫 学 分 会 临 床 微 生 物 学 组，中 国 医 疗 保 健 国 际交 流 促 进 会 临 床 微 生 物 与 感 染 分 会宏 基 因 组 高 通 量 测 序技 术 应 用 于 感 染 性 疾 病 病 原 检 测 中 国 专 家 共 识中 华 检验 医 学 杂 志，（）：中 华 医 学 会 呼 吸 病 学 分 会下 呼 吸 道 感 染 宏 基 因 组 二 代 测序 报 告 临 床 解 读 路 径 专 家 共 识中 华 结 核 和 呼 吸 杂 志，（）：，（）：，（）：（收 稿 日 期：）（本 文 编 辑：贺 立 羽）上 海 医 学杂 志 年 度 学 科 专 辑 报 道 计 划 为 吸 引 优 秀 稿 源，充 分 发 挥上 海 医 学的 学 术 引 领 作 用，体 现 医 学 类 综 合 期 刊 的 多 学 科 特 色，编 辑 部 于 年 月面 向 全 体 编 委 征 集上 海 医 学杂 志 年 度 学 科 专 辑。经 过 汇 总 分 析，与 相 关 专 辑 负 责 人 充 分 沟 通，编 辑 部 认 真 讨 论，报 总 编 辑 审 核，拟 将 以 下 学 科 专 辑 纳 入上 海 医 学杂 志 年 度 报 道 计 划。刊 期专 辑 名 称 与 主 题专 辑 负 责 人 出 版 日 期第期 麻 醉 学：人 工 智 能 麻 醉 系 统 的 开 发 与 应 用于 布 为月 日第期 儿 科：儿 童 感 染 免 疫 与 重 症 医 学黄敏月 日第期 普 外 科：腹 部 肿 瘤楼 文 晖月 日第期 肾 脏 科：血 液 净 化 技 术 在 危 重 病 救 治 中 的 作 用丁 小 强月 日第 期 泌 尿 外 科：前 列 腺 恶 性 肿 瘤 诊 疗 新 进 展薛蔚 月 日第 期妇 科：基 于 模 式 的 卵 巢 癌 精 准 诊 疗 策 略子 宫 内 膜 异 位 症 与 女 性 盆 腔 痛王育许泓 月 日 说 明：（一）学 科 专 辑 文 章 将 按“高 标 准、严 要 求”，经 快 速 通 道 流 程，通 过 外 审 及 专 辑 负 责 人 审 定 并 编 辑 合 格 后，按 计 划 刊 出。（二）欢 迎 广 大 医 务 工 作 者 积 极 投 稿，将 自 己 的 高 水 平 文 章 纳 入 到 相 关 主 题 的 学 科 专 辑 计 划 中。投 稿 方 式：本 刊 实 行 网 上 投 稿，请 登 录 ：进 行 在 线 投 稿。不 接 受 邮 箱 投 稿。投 稿 要 求：文 章 内 容 从 未 以 任 何 形 式 公 开 发 表 过；文 章 格 式 请 参 照 本 刊 已 发 表 文 章 以 及 稿 约 要 求（：）；在 填 写 稿 件 基 本 信 息 时，请 在 标 题 前 加“专 辑”字 样；投 稿 截 止 日 期，如 拟 与 学 科 专 辑 文 章 同期 刊 出，请 至 少 在 出 版 日 期 前个 月 投 稿。衷 心 感 谢 给 予 学 科 专 辑 大 力 支 持 的 各 位 专 辑 负 责 人、专 家 和 作 者！上 海 医 学 年 第 卷 第期