多囊卵巢综合征患者颗粒细胞miR-3135b的表达及临床意义.pdf

.490.多囊卵巢综合征患者颗粒细胞miR-3135b的表达及临床意义许珂,毕晓英,赵艳晓,王丹丹（河南中医药大学第三附属医院生殖中心，河南郑州450 0 0 0）摘要：目的探讨微小RNA-3135b(miR-3135b)在多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome,PCOS）患者颗粒细胞(Granulosacells,GCs)中的表达，并评价其临床意义。方法选取2 0 19年1月至2 0 2 1年1月河南中医药大学第三附属医院收治的92 例因PCOS导致不孕患者纳人PCOS组，选取92 例同期于本院因输卵管或男方不育等原因导致不孕患者纳人对照组。记录两组患者一般资料和各级卵泡数及获卵数、胚胎成型率；收集两组患者卵巢GCs,采用实时荧光定量PCR(Real-Timequantitativepolymerase chain reaction，q RT-PC R）检测卵巢GCs中miR-3135b的表达，并分析其临床意义；采用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC)分析miR-3135b表达对PCOS的诊断价值。结果PCOS 组患者黄体生成素（Luteinizing hormone,LH)、LH/卵泡雌激素（Follicle stimulating hormone,FSH）、孕酮（Progesterone,P）、睾酮(Testoster-one,T)、空腹胰岛素（Fasting insulin,FINS)、胰岛素抵抗指数（Homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR)和雌二醇(Estradiol,E2)均明显高于对照组，FSH、催乳素(Prolactin，PRL)则低于对照组（P0.05);PCOS组过渡型初级卵泡、典型初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡数和获卵数明显高于对照组(P0.05);PCOS组中miR-3135b表达量(1.92+1.0 8)显著高于对照组（1.0 2+0.33)(P0.05);ROC结果显示miR-3135b表达诊断PCOS的曲线下面积（Areaundercurve,AUC)为0.750(P 18 岁；(2)符合PCOS诊断标准7(符合以下三项中两项即可确诊：稀发排卵或无排卵；出现多毛、痤疮等高雄激素临床表现；B超检查结果显示卵巢出现多囊样改变)(3)近3个月内未接受激素治疗者。排除标准：（1)合并严重心、肝、肾等脏器功能不全及其他免疫性相关性疾病者；(2)合并高血压、糖尿病者;(3)合并凝血功能障碍、甲状腺功能亢进者；（4）人组前3个月内有手术史者；(5)合并子宫内膜异位症、输卵管积水者；(6)既往有异常流产史或胎儿发育异常史者；(7)合并恶性肿瘤或心理、精神疾病者。选取9 2 例同期于本院因输卵管或男方不育等原因导致不孕患者纳入对照组，年龄2 6 45岁，平均（31.7 52.2 6)岁，平均BMI为（2 3.6 92.0 7）kg/m,两组患者年龄、BMI比实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory Medicine,Aug.2023,Vol.41,No.4较，差异无统计学意义（P0.05）。本研究经伦理委员会通过。1.2检测方法1.2.1仪器与试剂主要仪器实时定量PCR仪(CFX96型,美国Bio-Rad公司)，电泳仪(CPC-300型，上海百赛生物技术股份有限公司)，凝胶成像分析系统(BIO-RAD型，上海艾研生物科技有限公司)，分光光度计（NANODrop2000)；主要试剂：TRIzol Reagent试剂盒（上海双达生物技术有限公司),反转录试剂盒(北京伊塔生物科技有限公司)，实时PCR试剂盒(武汉纯度生物科技有限公司)，DNAMarker（上海韵泰信息科技有限公司),RNAMarker(北京泽平科技有限责任公司)。1.2.2 GCs 收集 8 于患者排卵日,在超声引导下经阴道穿刺抽吸卵泡,选取直径16 mm。操作步骤：(1)用针分离单个卵母细胞周围的GCs,取出卵丘卵母复合体,并收集剩余的卵泡液；(2)卵泡液离心后，弃上清，剩余沉淀物加透明质酸钠1mL充分混匀，水浴后移至无菌离心管，加入4mL淋巴细胞分离液后离心；(3）取离心后GCs至离心管内，接种于全营养培养基，置于37 5%C02培养箱中培养2 4h；（4）将培养的GCs细胞收集后于-80保存备用。1.2.3实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-Time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测miR-3135b的表达采用Trizol试剂抽提GCs中总RNA，使用分光光度计于2 6 0 nm和280nm波长下测定所有样品中A260/A280，并计算所有RNA的浓度和纯度。采用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，反应产物稀释后作为qRT-PCR模板。使用实时荧光定量PCR仪检测PCOS患者GCs中miR-3135b的表达,反应条件如下：95预变热10 min、95 15s、55 2 0 s、7 0 2 0 s,如此循环40 次。以U6为内参,引物序列见表1。用2-A c T 方法计算miR-3135b的相对表达量,对比两组患者颗粒细胞miR-3135b的表达。文中所用引物序列均由华大基因设计。所有步骤均严格按照各仪器及试剂说明书进行。1.3观察指标记录两组患者年龄、不孕年限、目的基因miR-3135bU6.491BMI、空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)、LH、FSH、LH/FSH、E 2、T、P、FI NS、FBG、PRL及初始卵泡、闭锁卵泡、窦卵泡、过渡型初级卵泡、典型初级卵泡、次级卵泡、获卵数和胚胎形成率。采用稳态评估模型评价计算HOMA-IR,计算公式为HOMA-IR=(FINSFBG)/405。胰岛素抵抗评定标准：HOMA-IR3.8。1.4统计学处理采用SPSS18.0统计学软件进行数据分析，满足正态分布且方差齐的计量资料采用（x土s）表示，采用两样本独立t检验比较组间差异,用ROC分析miR-3135b表达对PCOS的诊断价值,P0.05);PCOS组患者LH、LH/FSH、P、T、FINS、H O M A-IR和E2均明显高于对照组,FSH、PRL则低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);PCOS组过渡型初级卵泡、典型初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡数和获卵数明显高于对照组，差异有统计学意义(P0.05)。见表 3。2.3GCs中miR-3135b的表达采用qRT-PCR检测GCs中miR-3135b的表达水平，结果显示，PCOS组中miR-3135b表达量（1.92 1.0 8）显著高于对照组（1.0 2 0.33），差异有统计学意义（P0.05)。2.4miR-3135b表达对PCOS的诊断价值根据2.3结果,为测试miR-3135b表达对PCOS的诊断能力,建立了ROC曲线，结果显示，miR-3135b表达诊断PCOS的AUC为0.7 50，截断值为1.55,敏感度为58.7%，特异度为95.7%(P0.001)。见图1。3讨论PCOS是导致育龄期妇女无排卵性不孕的主要病因9,患者临床主要表现为持续无排卵和高雄激素血症,B超检查可见卵巢呈现多囊样改变 10 。表1引物序列上游引物5-CTGTCCTGGAGCCCTTGT-35-CTCCCTTCGCCAGCA-CA-3下游引物5-CACAGCTTTCCTTCACCTAG-35-AACGCTTCACGAATTTGCCT-3表2 两组患者一般资料和临床特征比较（xs）492.年龄(岁)不孕年限（年）BMI(kg/m)FBC(mmol/L)FINS(pmol/L)HOMA-IRLH(U/L)FSH(U/L)LH/FSHPRL(nmol/L)P(nmol/L)T(nmol/L)E2(pmol/L)指标初始卵泡过渡型初级卵泡典型初级卵泡次级卵泡窦卵泡数闭锁卵泡数获卵数胚胎形成率图1miR-3135b表达诊断PCOS的ROC曲线无排卵性不孕的主要原因为卵泡发育障碍，导致其发育停滞于窦状卵泡阶段,无法进行有效排卵叫。近年来有研究表明，在细胞各功能中起重要作用的miRNA参与了多种疾病的发生发展过程,被作为各种疾病的诊断或预后生物标志物在临床中广泛应用u2。本研究主要探讨PCOS患者 GCs中miR-3135b的表达，并分析其临床意义。实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and LaboratoryMedicine，A u g.2 0 2 3,Vo l.41,No.4指标PCOS 组(n=92)30.21 2.373.01 0.9525.07 3.245.04 0.4119.14 10.292.98 1.528.15 3.747.28 2.431.32 1.010.77 0.451.46 0.941.54 0.49166.05 68.13表3两组患者卵巢各级卵泡数及获卵数、胚胎成型率比较（xs）PCOS 组(n=92)20.51 7.2610.23 2.815.42 2.651.72 1.0334.14 11.323.28 2.6516.29 5.320.47 0.25ROC直1-对照组(n=92)30.362.523.03 0.7824.98 3.354.91 0.5715.68 10.542.45 1.174.96 2.628.05 2.560.72 0.340.92 0.371.03 1.080.95 0.33145.28 64.89对照组（n=92)19.24 5.126.78 2.602.01 0.731.06 0.6817.68 5.652.79 1.4213.34 4.980.46 0.18男方不育等原因导致不孕患者的一般资料和临床特征进行对比分析,结果显示两组在LH、L H/F S H、P、T、F I NS、H O M A-I R、E2、F S H 和PRL差异有统计学意义。其中,LH和LH/FSH显著说明PCOS患者出现促性腺激素功能失调,T水平升高提示高雄激素血症，而 FINS、H O M A-I R 升高则说明 PCOS患者出现高胰岛素血症和胰岛素抵抗，这与孙守萍等 13 研究结果基本一致,证实了PCOS具有高雄激素血症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗和促性腺激素功能失调等生化特征。本研究中,两组患者初始卵泡、闭锁卵泡数和胚胎形成率无显著差异，与对照组比,PCOS组过渡型初级卵泡、典型初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡数和获卵数明显增多,说明PCOS患者早期初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡数呈现增多趋势，与Pedrosol14实验结论基本一致,但Pedroso发现PCOS 患者卵泡刺激素显著降低,分析其原因可能与PCOS引起的卵巢功能障碍有关。本研究采用qRT-PCR检测miR-3135b在PCOS患者 GCs中的表达,结果显示其表达与在对t0.4160.1560.1851.7762.2532.6506.7012.0925.4002.4692.8809.5792.117t1.3718.64411.8995.12912.4791.5633.8830.311本研究对PCOS导致不孕患者与因输卵管或P0.6780.8760.8530.0770.0260.0090.0010.038.0.0010.0140.0040.0010.036P0.1720.0010.0010.0010.0010.1190.0010.756实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory Medicine,Aug.2023,Vol.41,No.4照组患者中的表达存在显著的统计学差异，与非PCOS的对照组患者比较,PCOS组中miR-3135b表达上调，其表达量显著高于对照组患者，提示miR-3135b可能在PCOS发病机制中具有重要作用。卵巢GCs 是由原始卵泡中扁平卵泡细胞增殖形成的柱状多层颗粒细胞，在成熟卵泡时期停止增殖，可传递营养物质和激素，在卵泡发育过程中发挥重要作用 15-1。卵泡发育异常是导致患者不孕不育,甚至自发性流产的主要原因 7。有研究显示，卵巢GCs中的miRNAs以转录后调控方式参与生殖过程的调节,并调控激素合成,其异常表达与卵泡生长、发育关系密切8 。miR-3135b可能通过降低增殖细胞核抗原表达，达到抑制卵巢GCs 增生的目的。miRNAs对卵巢CCs 中E2、P和T等激素的分泌也有抑制作用，可进一步影响卵母细胞的生长和发展 19 。本研究结果证实,PCOS患者 GCs中miR-3135b呈现高表达，WangY20的研究发现，PCOS患者存在多种miRNAs的差异表达，其中miR-3135b在PCOS患者的GCs中呈现更高的表达,可提高对PCOS的预测准确性,这与本研究结论基本一致。本研究采用ROC曲线分析了miR-3135b表达对PCOS的诊断价值，结果显示miR-3135b表达诊断PCOS的AUC为0.7 50，说明miR-3135b表达具有较好的PCOS诊断价值。综上所述,miR-3135b在PCOS 患者 GCs中呈现高表达，在卵泡发育障碍中发挥重要作用,且对PCOS诊断具有较好的预测价值。本研究的不足之处在于未对与 PCOS患者卵泡发育相关的 miR-3135b信号通路进行系统阐述，后续仍需加大样本量进行深人研究，但本研究仍为临床进一步了解PCOS的病理生理机制提供了新思路。参考文献1JZeng X,Xie YJ,Liu YT,et al.Polycystic ovarian syndrome:Corre-lation between hyperandrogenism,insulin resistance and obesityJ.Clin Chim 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