遗传学第十一章重组DNA.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,基因工程的概念,2,工具酶,3,载体,4.重组,DNA,；,5,转基因生物,本章重点,一、遗传工程概述:,广义遗传工程包括,:,生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。,狭义遗传工程是指,:,基因工程,(,重组,DNA,技术,),。,.概念：,重组DNA(基因工程)：在分子水平上，采取工程建设方式,，,按照预先设计的蓝图,，,借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一生物中去,，,使后者定向获得新遗传性状的一门技术。,重组DNA,1996,年，威尔穆特研究小组克隆羊,“,多莉,”,诞生（利用,6,岁成年母羊乳腺细胞）。,1997,年，威尔穆特小组报道用胎儿细胞为核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子,IX,转基因克隆羊,“,波莉,”,1998,年，美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞克隆了,3,代共,50,只实验鼠。,2000,年，美国用无性繁殖技术克隆猴子,“,泰特拉,”,，意味克隆人体已无技术障碍。,2001,年，美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的人体胚胎。,2002,年，,12,月法国研究者宣布克隆出第一个女婴，但一直未获得证实。,1996,年,170,万公顷，,1997,年,1100,万公顷，,1998,年,2780,万公顷，,1999,年,3990,万公顷，,2000,年,4420,万公顷，,2001,年,5260,万公顷，,2002,年,5000,万公顷。,美 国（,3570,万,hm2,）,阿根廷（,1180,万,hm2,）,加拿大（,320,万,hm2,）,中 国（,150,万,hm2,）,全世界转基因植物面积,2001,年种植面积,100,万公顷的转基因作物：,大豆（,3330,万,hm2,，占全世界转基因作物的,63%,，均为抗除草剂大豆）,玉米（,980,万,hm2,，占,19%,）,棉花（,680,万,hm2,，占,13%,）,油菜（,270,万,hm2,，占,5%,）；,水稻、小麦、花生、向日葵、,亚麻、甘蓝、马铃薯、番茄、,烟草、南瓜和木瓜等,50,多种。,转基因棉花已经大规模商品化生产。,转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，,2004,年我国的转基因农作物和林木已达,27,种。,中国转基因植物面积,3重组DNA,重组DNA内容：,从细胞和组织中,分离,DNA,；,限制性内切酶,酶切,DNA,分子，制备,DNA,片段；,将酶切,DNA,分子,与载体,DNA,连接,构建重组,DNA,分子；,把重组,DNA,分子,引入宿主受体细胞,复制；,重组,DNA,随宿主细胞的分裂而分配到子细胞,建立无性繁殖系,(clone),；,从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系,并使外源基因在受体细胞中正常,表达,翻译成蛋白质等基因产物、回收；或筛选出获得定向性状变异个体。,第一节 工具酶,核酸酶：切割,DNA,分子中，两个相邻核苷酸之间的磷酸二脂键,使之水解成多核苷酸片段。,核糖,核酸酶,(,RNase,),：专一水解断裂,RNA,分子的两个相邻核苷酸之间的磷酸二脂键。,脱氧核糖,核酸酶,(,DNase,),：专一水解断裂,DNA,分子的两个相邻核苷酸之间的磷酸二脂键。,作用底物,切割方式,外切酶：从核苷酸的末端开始，逐个消化降解多核苷酸。,内切酶：从核苷酸分子内部切割磷酸二脂键，而生成,DNA,片段。,其它酶类,DNA,聚合酶：,RNA,聚合酶：,反转录酶,限制性内切酶,(restriction enzyme),：,从核苷酸分子内部切割磷酸二脂键，而生成,DNA,片段。,如：,Eco,R,I,、,Hind,III,首先，细菌细胞中发现限制,-,修饰系统（,R-M,）：,1,）限制：降解外源,DNA,防御异源遗传信息进入的手段,(,限制性内切酶,),。,2,）修饰：修饰外源,DNA,片段后,保留在新细胞中,(,甲基化酶,),。,一、限制性内切核酸酶,限制性内切酶酶切方式：以交错方式切断,DNA,双链，产生二个相同单链粘性末端。,重组过程：两种片段在适宜条件下，可经磷酸二脂链，连接成重组,DNA,分子。,第,类酶：,有特定识别序列，切割部位无特异性,切割远离识别位点，甚至,1000bp,随机切割。,第,类酶：,有特定识别序列，切割有特异性（在识别序列外，,20bp,）,切割可产生各种类型的单链末端。,第,类酶：,有特定识别序列，切割有特异性（在识别序列内）,识别序列有,4,、,6,、,8,个或更多核苷酸对。,2.限制性核酸内切酶的类型,5-GAATTC-3,3-CTTAAG-5,5-CTGCAG-3,3-GACGTC-5,-,5,-G AATTC-,3-CTTAA G-5,EcoR,I,Pst,I,-,5,-CTGCA G-,3-G ACGTC-5,粘性末端,平端切割,5-AGCT-3,3-TCGA-5,Alu,I,5-AG CT-3,3-TC GA-5,5-GGATCC-3,3-CCTAGG-5,5-CCGG-3,3-GGCC-5,-,5,-G GATCC-,3-CCTAG G-5,Bam,H I,Hpa,5-GATC-3,3-CTAG-5,Sau,3A I,5-GATC-3,3-CTAG -5,Msp,I,同切酶,Bam,H I、,Sau,3A I、,Mbo,I、,Nde,一组,同尾酶,限制性内切酶的命名：根据其来自的生物分类学上的属名、种名和菌株名来命名。,酶名称的第一个字母是属名的第一个字母，大写，斜体。,第二、第三个字母是种名的前两个字母，小写，斜体。,第四个字母是菌株名的前两个字母，大写或小写，正体。,最后，罗马数字，表示分离几种酶的编号，,I,、,.,Eco,R,I,来自大肠杆菌（,Escherichia coli,）；,.,Hin,d,来自嗜血杆菌（,Haemophilus,influenzae,）。,3.限制性核酸内切酶的命名,二、连接DNA片断的酶,第,1,种：连接粘端的连接酶,（图,A,）,第,2,种：连接平端,DNA,的,连接酶。,T4 DNA,连接酶（图,B,）,第,3,种：先加人工接头，形成粘端，再由,DNA,连接酶连接。,三、DNA聚合酶,大肠杆菌，,pol,、,pol,、,pol,三种。,Taq,DNA,聚合酶 从栖热水生菌（,75C,热泉）分离得到。用于,PCR,PCR,反应三个步聚,(,一个循环,),：,变性：,9495,使模板,DNA,双链变成单链；,复性：,5070,下，引物分别与互补,DNA,单链互补配对；,延伸：在引物的引导和,Taq,酶作用下，,72,下合成模板,DNA,的互补链。,PCR,聚合酶链式反应,(,polymerase chain reaction,),PCR,反应通常有,2535,个循环，一般可扩增,5kb,左右的片段。,由该技术衍生出一些新的技术，如,RAPD,和,AFLP,等技术。,第二节 载 体,载体（vector）：体外重组DNA实验，将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。也是一种DNA分子。,载体必须具备的4个条件：,该载体必须具备适合的单一酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。,该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；,载体上要有选择标记,，如抗生素基因；,载体上要有插入外源,DNA,的克隆位点或插入位点,常用的载体包括三大类，即质粒、噬菌体、噬粒,质粒（常用的有,pBR322,、,pUC,系列）,单链丝状噬菌体,噬粒（常用的大肠杆菌丝状噬菌体包括,M13,噬菌体,f,噬菌体等,）,人工染色体（噬菌体人工染色体,PAC,、细菌人工染色体,BAC,、酵母人工染色体,YAC,）,如,pUC18,质粒具有以下特点：,.,分子量小,可接受较大外源片段；,.,拷贝数多,500,个细胞；,.,克隆位点的酶切位点多,克隆方便；,.,具有用于检测重组质粒的选择,标记（,互补的显色表型）。,1、质粒,噬菌体（温和型）：,基因组全长为,49kb,。能接受,15kb,外源,DNA,片段作为,cDNA,或核,DNA,克隆载体。,优点：,不易引起生物危害，有助于,“,目的,”,基因进入细胞并增殖；,携带大片段外源,DNA,分子，占总量,25%,时仍不失活。,2、噬菌体,3、柯斯质粒(,cosmid,),：,噬菌体,DNA,+,部分细菌质粒,DNA,序列,柯斯质粒。,有噬菌体,cos,序列、细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。,这种质粒分子量较小，但可接受长达,50kb,的外源,DNA,片段,克隆真核生物基因。,BAC,载体一般可携带大于,50kb,的外源,DNA,片段。,F,因子,改造成,BAC,载体，甚至可用于克隆,100kb,以上的,DNA,片段。,特点：,带有外源,DNA,的,BAC,载体在细胞中是单拷贝的；,载体分子量很小,(7.4kb),；,选择标记：氯霉素抗性基因；,4、细菌人工染色体,(BAC),：,荧光转基因烟草,第三节 转基因生物,一、转基因植物,转基因植物是基因组中含有外源基因的植物。,它可通过原生质体融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程技术获得，有可能改变植物的某些遗传特性，培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等的作物新品种。,而且可用转基因植物或离体培养的细胞，来生产外源基因的表达产物，如人的生长素、胰岛素、干扰素、白介素,2,、表皮生长因子、乙型肝炎疫苗等基因已在转基因植物中得到表达。,农杆菌介导转化法：,农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，诱导产生冠痪瘤或发状根。分别含有,Ti,质粒和,Ri,质粒，人们将目的基因插入到经过改造的,T,DNA,区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。,2.,基因枪介导转化法：,利用基因枪，将包裹了带目的基因的,DNA,溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。,3.,花粉管通道法：,在授粉后向于房注射含目的基因的,DNA,溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源,DNA,导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。,植物转基因主要方法,植物转基因主要步骤,农杆菌转化法,5C A U G3mRNA3G U A C5Antisense RNA,反义RNA作用原理,转入成熟酶antiRNA后,西红柿保存期延长至1个月,转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。它是按照预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。,通过生长素基因、多产基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等基因转移，可能育成生长周期短，产仔、生蛋多和泌乳量高，生产的肉类、皮毛品质与加工性能好，并具有抗病性，已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取得一定成果。,还可将转基因动物作为生物工厂（,Biofactories,）,如以转基因小鼠生产凝血因子,IX,、组织型血纤维溶酶原激活因子（,t-PA,）、白细胞介素,2,、,1-,抗胰蛋白酶，以转基因绵羊生产人的,1-,抗胰蛋白酶，以转基因山羊、奶牛生产,LAt,-PA,，以转基因猪生产人血红蛋白等，这些基因产品具有高效、优质、廉价与相应的人体蛋白具有同样的生物活性，且多随乳汁分泌，便于分离纯化。,二、转基因动物,显微注射法：,在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径,1,2,m,）直接将,DNA,注射到胚胎的细胞核内，再把注射过,DNA,的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有,1/10,是整合外源基因的转基因动物。,体细胞核移植方法：,先在体外培养的体细胞中进行基因导入,筛选获得带转基因的细胞,.,然后,将带转基因的体细胞移植到去掉细胞核的卵细胞中,生产重构胚胎,.,重构胚胎经移植到母体中,产生的仔畜百分之百是转基因动物。,人类生长激素转基因鼠,动物转基因主要方法,转基因牛：受精卵注射法,可分泌人类生长因子的转基因羊,“Polly”,。,动物转基因主要步骤：,自从人类耕种作物以来，我们的祖先就从未停止过对作物的遗传改良。在过去的几千年里，农作物改良的方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然的方式来积累优良基因。遗传学创立后近百年的动植物育种，则是采用人工杂交的方法，进行优良基因的重组和外源基因的导人而实现遗传改良。转基因技术与传统技术是一脉相承的，其本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。,转基因技术与传统育种技术有两点重要区别，主要在基因转移的范围和效率上，,第一，,传统技术一般只能在生物种内个体间实现基因转移，而转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的限制。,第二，,传统的杂交和选择技术一般是在生物个体水平上进行，操作对象是整个基因组，所转移的是大量的基因，不可能准确地对某个基因进行操作和选择，对后代的表现预见性较差。而转基因技术所操作和转移的一般是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期。,因此，转基因技术是对传统技术的发展和补充。将两者紧密结合，可相得益彰，大大地提高动植物品种改良的效率。,转基因技术与传统技术的关系,第四节 体细胞克隆动物,1.成年动物的体细胞克隆动物体细胞如何恢复“全能性”？,2.端粒处于什么状态？,3.,成年动物的体细胞细胞质对克隆体的影响？,4.,要不要克隆人？,引起人们极大关注的问题：,本章结束，谢谢！,