第13章基因工程与常用的分子生物学技术.ppt

,*,生物化学,生物化学,国家卫生和计划生育委员会“十二五”国家级规划教材全国高等医药教材建设研究会规划教材全国高职高专学校规划教材,*,蛋白质的结构与功能,第 一 节,第 一 章 绪论,第十三章,基因工程与常用的分子生物学技术,浙江医学高等专科学校 王黎芳,学习目标,1.掌握：基因工程的概念。,2.熟悉：基因工程的基本原理和临床应用；熟悉基因诊断、基因治疗等新医疗方法。,3.了解：常用分子生物学技术的分类和应用。,4.对临床上的一些分子生物学新技术能有所知晓。,5.培养学生的自主学习、查阅文献资料的能力。,第十三章,基因工程与常用的分子生物学技术,第一节 基因工程,第二节 常用分子生物学技术及应用,基因工程(重组DNA技术),指分离,目的基因,片段，经过剪接后连接到,载体,上构成,重组体,，导入,宿主细胞,后在宿主细胞内进行,表达,。,核心是,DNA片段的重组,和,细胞克隆,一、基本概念,（一）定义,外源核酸分子在宿主细胞中进行复制，,跨越了天然物种屏障,少量目的基因片段在寄主细胞中,实现大量扩增,（二）特点,基因工程主要技术程序,1）目的基因的分离、克隆；,2）表达载体的构建；,3）外源基因导入宿主细胞；,4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测；,5）外源基因表达产物的分离、纯化和活性检测。,二、原理与过程,载体,酶切,目的基因,酶切,连接,宿主细胞,重组子,连接,连接,转化,鉴定、表达,分离、纯化,（一）目的基因,目的基因,是基因工程中需要研究的那段基因，是准备要分离、改造、扩增或表达的基因。,1.定义,制备目的基因方法包括人工合成法、基因组文库、cDNA文库、PCR或RT-PCR、转座子标签法、差异显示法等。,2.制备方法,在已知目的基因的核苷酸序列后，按该碱基序列合成一段段含少量（1015个）核苷酸的DNA片段，再利用碱基互补配对的原则形成双链片段，通过连接酶将这些双链片段逐个按顺序连接起来得到一个完整的目的基因。,适用于已知核苷酸序列、分子量较小的目的基因的制备,；不适用于序列复杂、目前尚不知道核酸序列的基因,1.人工合成法,染色体DNA提取,连接,无数DNA片段,载体,剪切,无数重组子,细菌,转化,基因文库,分子杂交,筛选得到目的基因片段,2.从基因文库中钓取,mRNA提取,连接,cDNA,载体,逆转录,重组子,细菌,转化,cDNA文库,3.构建cDNA文库,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外合成特异的DNA片段的一种方法。,4.聚合酶链式反应,DNA模板,第一个循环,第二个循环,2,1,2,2,第n个循环,2,n,n=35个循环,2,35,个目的基因分子,用于基因工程的载体主要包括,质粒,、噬菌体、粘粒（又称柯斯质粒 Cosmid）、其他病毒载体、细菌人工染色体（BAC）载体和酵母人工染色体（YAC）载体等。,（二）载体,质粒,是细菌或细胞质中，独立于染色质的,共价闭环,小分子,双链DNA,，能,自主复制,，与细菌或细胞共生。,1,.,质粒载体,氨苄青霉素抗性基因（Amp,R）,Eco RI,Hind III,多克隆位点（MCS）,Lac Z,Lac I,启动子,（promotor）,复制起始点（Ori V）,pUC 19,质粒载体,噬菌体是感染细菌的一类病毒，其基因组分为三个部分，左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需的全部DNA序列；中段编码溶菌生长所需的蛋白质。,利用噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，与左右臂一起包装成噬菌体，感染宿主细胞。,2,.,Lambda（）噬菌体载体,噬菌体载体对外源基因的容量更大，可以插入的片段大小可以达到20几kb。,由于是体外包装成噬菌体颗粒再感染宿主细胞，较之于质粒DNA的直接转化，效率更高。,噬菌体载体宿主的选择面较窄，在操作的安全性上比质粒DNA有优势。,兼具质粒和噬菌体载体双重特点的大容量载体。,含有质粒的复制起始区和筛选标记,（Amp,r,和Tet,r,）。,3,.,柯斯质粒,限制性核酸内切酶,是一类能识别并,切割,双链DNA分子内部,特异序列,的酶。,（三）工具酶,1,.,限制性核酸内切酶,G,A,T,T,C,A,C,T,G,C,A,G,G,T,T,A,A,C,C,T,T,A,A,G,G,A,A,A,T,T,G,C,C,G,T,C,Eco R I,Pst I,Hpa I,5,5,5,5,5,3,5,3,3,3,3,3,TTAA,TTAA,AATT,TTAA,TTAA,AATT,AATT,TTAA,DNA连接酶,包括,T4噬菌体DNA连接酶,、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶,2,.,连接酶,DNA连接酶,通过催化DNA链的,5-PO,4,与相邻的另一DNA链的,3-OH,生成,3,5-磷酸二酯键,而封闭DNA链上的缺口。,+,重组体的构建,是通过DNA连接酶催化将限制性核酸内切酶酶切过的目的基因与合适的载体连接，形成,重组的DNA分子,（重组体）的过程。,（四）重组体的构建,（五）重组DNA导入宿主细胞,不同的载体对应有不同的宿主细胞，导入的方法也不尽相同，包括：,转化,、,转导,和,转染,等。,（六）转化子的筛选,常用的筛选方法,1)抗生素筛选法,+,或,连接,蓝色菌落,白色菌落,载体,抗药基因,外源基因,非重组子,重组子,转化,宿主菌,菌落生长,菌落不生长,2)互补法,（七）目的基因的表达,基因重组的目的之一使目的基因在宿主细胞中高效表达,表达产物为生命科学研究、医药或商业所用,三、重组DNA技术在医学中的应用,（一）基因工程制药,临床治疗用的,重组蛋白,包括：,免疫性蛋白,，如一些抗原和单克隆抗体；,细胞因子,，如各种干扰素、集落刺激生长因子等；,激素,，如胰岛素、心钠素；,各种酶类,，如尿激酶、链激酶；,（二）疾病的发现和诊疗,应用于遗传病、肿瘤、心脑血管疾病、病毒细菌寄生虫病和职业病等的诊断,重组人胰岛素,胰岛素是治疗糖尿病的特效药。长期以来，只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，,100Kg,胰腺只能提取,4-5g,的胰岛素，产量低、价格高，堪比黄金。将合成的胰岛素基因导入大肠埃希菌，实现基因工程制药后，每,2000L,培养液就能分离纯化得到,100g,胰岛素蛋白。大规模工业化生产解决了药品的产量问题，将药品价格降低了,30%-50%,。,知识拓展,第二节,常用分子生物学技术及应用,一、核酸原位杂交,二、聚合酶链式反应,第二节 常用分子生物学技术及应用,三、印迹技术,四、分子生物学技术的临床应用,一、核酸原位杂交,核酸原位杂交,是用序列已知的、特定标志标记过的核酸作为,探针,，与细胞或组织切片中的核酸碱基互补配对进行,复性杂交,，形成专一的杂交分子，,通过探针上的标记将待测核酸在细胞、组织中的位置显示出来,。,二、聚合酶链式反应,聚合酶链式反应是在,体外,将微量的,目的基因,片段,大量扩增,，以得到足量的DNA供研究分析和检测鉴定用的技术。,PCR技术的基本原理与,体内DNA的复制,过程相似,1,.,定义,（一）工作原理,由,变性,-,退火,-,延伸,三个步骤构成：,1,）,变性,：,93,孵育一定时间，模板,DNA,双链变性为单链,；,2,）,退火,（,复性,）：温度下降至适宜温度，模板,DNA,单链与引物碱基互补配对，形成,DNA,单链模板,-,引物复合物,；退火温度一般是目的基因片段,Tm,值再减,5,。,3,）延伸：温度上升至,72,，复合物在,Taq DNA,聚合酶的作用下，以,dNTP,为原料，单链序列为模板，在引物,3-OH,端延伸出一条新的与模板,DNA,链互补的链。,2.过程,94 变性,54 退火,72 延伸,模板DNA,引物,dNTP,n个循环,PCR基本流程,Taq,酶的发现,Taq,聚合酶是由台湾科学家钱嘉韵女士分离得到的。,1973,年，钱嘉韵就读于美国俄亥俄州辛辛那提大学生物系，她的导师对黄石公园里温泉中发现的嗜热菌（水生栖热菌）十分好奇，就让钱嘉韵以该细菌作为研究主题。研究过程中，钱嘉韵成功分离出耐高温的,Taq DNA,聚合酶。,早先的,PCR,反应用的是大肠埃希菌,DNA,聚合酶，由于不耐变性阶段的高温，每个循环结束都需额外加酶。而,Taq,聚合酶可以耐受,90,以上的高温而不失活，大大简化了,PCR,技术，使之得以大量应用。,知识拓展,（二）衍生技术及应用,1,.,原位PCR,在组织细胞里进行PCR反应，将扩增的目的片段在组织细胞中定位。,2,.,多重PCR,是在同一PCR体系中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域，或不同的目的基因。,3.,逆转录PCR,将RNA链逆转录成为cDNA，再以此为模板通过PCR进行目的基因的扩增。,4.,荧光定量PCR,是在PCR在扩增时除了加入引物还加入,特异性的荧光探针,。,三、印迹技术,印迹技术,是以凝胶,分离生物大分子,后，将之直接放在或,转移至固定化介质,上加以检测分析的技术。,包括DNA印迹技术、RNA印迹技术和蛋白质印迹技术,（一）Southern印迹杂交,Southern,印迹杂交（,Southern blot,）即,DNA,印迹技术,用限制性核酸内切酶消化,DNA,，得到诸多片段，经琼脂糖凝胶电泳分离后，将胶上的,DNA,片段变性并原位转印到尼龙膜等固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定。用带有标记的,DNA,探针与这些片段进行杂交后显影或显色。通过条带的有无或深浅来进行,DNA,的定性与定量。,限制性核酸内切酶酶切,全长DNA,DNA片段,琼脂糖,凝胶电泳,分离了DNA片段的凝胶,硝酸纤维素膜,吸附有DNA片段的膜,转膜,杂交,显影,带标记的DNA探针,Southern印迹杂交基本流程,（二）Northern印迹杂交,Northern印迹杂交（Northern blot）即,RNA印迹技术,。,技术原理与Southern印迹杂交一致。,Northern印迹杂交通过,检测RNA的量,来研究基因的表达情况。,（三）Western印迹法,Western印迹法（Western Blot）即,蛋白质印迹技术,与Southern或Northern杂交方法类似，但电泳的介质是聚丙烯酰胺凝胶，被检测的是蛋白质，,“,探针,”,则是抗体，用带标记的抗一抗的抗体（二抗）显色。,通过分析条带位置和着色深度检测目的蛋白质在组织细胞中的表达情况。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离了蛋白质的凝胶,硝酸纤维素膜,吸附有DNA片段的膜,转膜,杂交,显色,Western印迹杂交基本流程,变性,一抗,二抗,四、分子生物学技术的临床应用,（一）基因诊断,基因诊断,是借助分子生物学和分子遗传学的技术，检测,遗传物质结构变化或表达水平是否异常,的临床辅助诊断方法。,核酸分子杂交,是最常用的基因诊断方法之一,（二）基因治疗,基因治疗是利用分子生物学方法将,外源正常基因,导入患者的细胞内，以纠正、补偿由于,基因缺陷或异常,而引起的疾病，达到,治疗和预防疾病,的目的。,根据靶细胞的不同，基因治疗分为两种：,1,）,种系基因疗法,：将修改后的功能基因整合入生殖细胞（精子或卵子）的基因组中。这种治疗方法可以遗传，但限于技术与伦理学问题，目前仅限于动物实验。,2,）,体细胞基因治疗,：将功能基因转染到患者的体细胞内。这种改变并不会遗传，对任何基因的修改和产生的效果都将只体现在接受治疗的患者身上。,根据Morgan RA,Dudley ME,Wunderlich JR,et al.,Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes.Science.2006;314(5796):126-9.画图,抽取患者外周血,携带有肿瘤抗原受体基因的病毒载体转染T细胞,T细胞表达肿瘤抗原受体并分裂增殖,基因修饰过的T细胞注射入患者体内,提取T细胞,基因修饰过的T细胞分裂增殖,T细胞利用受体与肿瘤表面抗原结合攻击肿瘤细胞,肿瘤细胞死亡,体细胞基因治疗方案举例,基因治疗的先河,1991年美国实施了人类第一个针对遗传病的体细胞基因治疗方案。将正常人腺苷脱氨酶（ADA）基因重组入逆转录病毒载体，转染患儿的白细胞。10天后将带有正常基因的白细胞静脉输注入患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID）的患儿体内。8个月的治疗后，患儿ADA水平达到正常值的25%，且未见明显副作用。,同年，我国科学家进行了世界上首例血友病B的基因治疗临床试验。4名血友病患者接受了基因治疗，治疗后体内凝血因子IX浓度上升，出血症状减轻。,知识拓展,1.质粒是,A环状双链RNA分子B环状单链DNA分子,C环状双链DNA分子 D线状双链DNA分子,E线状单链DNA分子,2.用于重组DNA技术的目的基因是,A准备要分离、改造、扩增或表达的基因,BPCR的产物 C结构基因 D载体,E转录调控区,3重组DNA技术不需要以下哪种酶的参与,A限制性核酸内切酶BDNA聚合酶,CDNA连接酶D逆转录酶EDNA解链酶,4PCR反应体系不包括,A DNA模板BRNA引物C4种dNTP,DTaq DNA聚合酶EDNA引物,强化练习,