生物工艺学第三章--基因克隆载体.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,定义,基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”。也称DNA克隆载体。,必备条件,1、克隆位点(一个或多个),2、能携带外源DNA片段进入受体细胞:能自我复制，或整入染色体随受体细胞DNA复制而复制。,3、有选择克隆子的标记基因,4、安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞),意义：,基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域。,按克隆载体的来源分：,质粒,病毒或噬菌体,质粒与病毒或噬菌体DNA组成的,质粒与染色体DNA片段组成的,按应用范围分：,表达型,启动子探针型,cDNA,按应用对象分：,原核生物,植物,动物,分 类,.质粒克隆载体,定义：,以质粒DNA为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和c DNA基因文库。,一、质粒适于载体构建的性质,、组成与构型,是染色体外裸露的双链DNA分子（细菌、真菌、蓝藻、绿藻）,复制(Replication),质粒的复制起始和拷贝数是由质粒DNA序列控制的。质粒分子中为质粒复制所必需的最小区段称为基本复制子，它由两部分组成，一是复制原点(,ori,)，二是调节复制起始的基因（编码蛋白质或RNA)。,复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）,（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定,严紧控制型：1数个拷贝；大质粒,松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒。经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）。,、质粒的不亲合性,亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒,不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒,意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒,、质粒迁移,（）接合质粒：,含tra基因合成细胞表面物质（鞭毛）质粒DNA入受体细胞,含tra基因的质粒称为,接合质粒,。如F、Ti等,不含tra基因的质粒称为,非接合质粒,。如ColE1、pPbS等,（）迁移作用,不含tra基因而含bom（ori）位点的质粒，当宿主细胞存在,辅助质粒mob基因,产物时，即可打开ori位点，非结合质粒借助,接合质粒tra基因,的产物而迁移入受体细胞。这种现象称,质粒的迁移作用,、显性质粒和隐蔽质粒,宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质粒。,显性质粒,质粒：,含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的抗性基因，可作为选择标记。,Col质粒,质粒,降解质粒,i质粒,隐蔽质粒,蓝藻内源质粒,二、理想质粒载体的必备条件,、能进行有效复制复制起始位点（最好是多拷贝）,、克隆位点组装MCS连杆,、选择标记基因抗性基因，Lac Z基因,、分子尽可能小（转化率高），15kb，转化率,、组装各种“元件”，如启动子、终止子等,三、质粒载体构建,过程,：严密的实验设计构建（切割、修饰和连接重组）,构建原则,1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子,2、正确获得构建质粒克隆载体的元件,3、组装合适的选择标记基因,4、选用合适的启动子,5、构建过程力求简单,代表性实例。,（一）pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建,、pBR322构建,质粒载体命名法则,“pBR322”,p：质粒（plasmid),BR：两位主要构建者,322：实验编号,pSC101,（最早用于DNA克隆的载体），严紧型,ColE1,松驰型，筛选系统复杂,构建过程(出发质粒：,pMB1,),R1（沙门氏菌中分离）,变异,R1drd19（含易位子Tn3 Ap,r,）,R1drd19 Tn3,pSF2124,ColE1,pBR322的三个亲本：,pMB1、pSF2124、pSC101,识别位点：,Ap,r,基因区（3个）：Pst,、Sca 、Pvu,Tc,r,基因区（7个）：BamH,、Scal 、EcoR、Sph 、Nhe 、Nru 、Xma,Tc,r,启动子区（2个）：Cla,、Hind,pBR322分子大小：4363bp,3、优点,（1）较小的分子量,10kb以内DNA分子纯化过程中可避免断裂，pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的外源DNA,（2）较高的拷贝数,经氯霉素扩培后达10003000 copys/cell,（3）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。插入失活（图解）,、,pUC18/19质粒载体,与pBR322区别：乳糖操纵子的一个DNA片段（,lac Z基因）,替换Tc,r,基因；组装了一个多克隆位点（MCS）连杆,命名p UCUniversity of California的科学家首先构建。图3-3。,pUC包括四个组成部分：,（,1）pBR322的复制起点(ori),（2）Ap,r,基因，但DNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点,（3）lacZ基因,（4）在lacZ基因 内部靠近5端有一段MCS连杆,4、pBR322衍生的质粒,缺失bom位点 pBR325、pBR327，不具被动迁移作用,再移去Hae片段pAT153,均更安全,Lac Z筛选机制：,含乳糖操纵子的启动子、调节因子和,-半乳糖苷酶的N端146残基(-肽),合成有活性的,基因,（,lac Z）的质粒载体引入可编,-半乳糖苷酶,码C端部分残基的宿主(与Lac Z互补,的大肠杆菌),在含IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）和,X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖）,蓝色菌落,的诱导培养基上培养,在N端-肽的编码区插入MCS 不影响lac Z基因功能,插入外源DNA 灭活lac Z基因,白色菌落,pUC质粒载体的优点,（1）分子量更小、拷贝数更高,（2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时,（3）MCS区方便转移外源DNA在不同载体系列中,“穿梭”，使具有两种不同粘末端的外源DNA,能直接克隆入p UC载体,（二）蓝藻质粒克隆载体pPKE2的构建,大肠杆菌质粒不能转化蓝藻,蓝藻内的质粒属隐蔽质粒,即：,大肠杆菌源质粒复制起始点+蓝藻源质粒复制起始点。,pPbs（1511bp）,pPbs,Cla,重组,pPRS-1,多次亚克隆,pPKE-2,pBR322,组装CaMV35s启动子、MCS、rbcS终止子、Km,r,基因,（图3-5）,构建穿梭质粒,（三）农杆菌Ti质粒克隆载体的构建,Ti质粒,：根癌农杆菌中引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤）的质粒，故称Tumor inducing plasmid（Ti质粒）。双链环状DNA分子，200250kb。,1、,4个功能区：T-DNA区、Vir区、Con区、Ori区,（1）,T-DNA区,Ti质粒进入植物细胞的约25kb部分，即T-DNA（transfer DNA)。左右边界各有一个25bp正向重复序列（LTS和RTS）称为,边界序列,，为T-DNA的转移和整合所必需。只要保留T-DNA的边界序列，中间序列被外源DNA片段替换，仍可转移整合到植物基因组中。,这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据。,用野生型Ti质粒获得的转基因植物细胞只能分裂，不能分化为植株，故不能直接选育转基因植物。,（2）,Vir区,位于T-DNA区上游，其表达产物可激活T-DNA的转移，显示致瘤性。,（3）,Con区,含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)，可受宿主产生的冠瘿碱活化，使Ti质粒在细菌间转移，也即接合转移基因编码区。,（4）,Ori区,复制起始区，调控Ti质粒自我复制。,Ti质粒克隆载体真正用于植物而非农杆菌，农杆菌只起中介作用。,2、构建途径,（1）取代型载体。,用大肠杆菌质粒克隆载体取代Ti质粒的全部或部分,T-DNA序列,而构建。外源基因以同源交换而重组。,Onc,-,Ti：,T-DNA,上的onc基因被取代而构建。,Onc,+,Ti：pBR322取代,T-DNA,的部分序列但保留onc基因而构建。进入植物细胞诱发冠瘿瘤。,（2）中间质粒克隆载体,T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。,共整合克隆载体系统（T-DNA同源序列、bom 位点）,双元克隆载体系统微型Ti质粒,32病毒（噬菌体）克隆载体,病毒基本结构：,DNA（或RNA）+外壳蛋白,感染细菌的病毒，称为,噬菌体,。,分类,（根据病毒与宿主的关系）：,温和性病毒：,溶原性增殖,构建病毒载体,烈性病毒：,溶菌性增殖,改造后,噬菌体,是一类细菌病毒的总称，英文名叫做 Bacteriophage（简称 phage）。它的DNA分子除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。,如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的DNA。,噬菌斑,，即感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下的空斑。,分离重组体噬菌体的基本过程,首先是使用无菌消毒的金属接种针，粘着少量的噬菌体颗粒，转移到新鲜的细菌培养基中，使其在感染的细胞内大量地增殖。,采用密度梯度离心法，便可非常容易地纯化出噬菌体的颗粒。,一、,噬菌体,克隆载体,噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。,噬菌体的分子量为 31 10,6,dal，是一种中等大小的温和噬菌体。,噬菌体基因组的结构,在噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5单链突出序列，即通常所说的粘性末端。,注入到感染寄主细胞内的噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。,随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5-P和3-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）,噬菌体克隆载体,（一）噬菌体性质,DNA+外壳蛋白,1、DNA(48.5kb),噬菌体中：线性,宿主细胞：环状(cos位点),迄今已经定位的噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为噬菌体的,必要基因,；,另一部分基因，当它们,被外源基因取代,之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为噬菌体的,非必要的基因,（介于基因J和基因N之间）,。,2、噬菌体基因组有基因50个以上,噬菌体DNA的复制,在噬菌体感染的早期，环形的 DNA分子按形式从双向进行复制。,到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的长多连体分子。,噬菌体DNA的转录与转译,在溶菌周期，噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的。,大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期；,中期基因转录的结果导致 DNA进行复制和重组；,晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒。,3、限制性核酸内切酶位点:56种,4、噬菌体的生长途径,溶菌生长途径,溶原生长途径某种胁迫条件下合成six,基因产物 DNA脱离细菌染色体溶菌,（二）构建依据,1、噬菌体是一种温和噬菌体,2、能承载较大的外源DNA片段,DNA头部可包装约36.451kb(自身的75%105%)，且约有20kb DNA可缺失（生长非必需）,3、在DNA上有多种限制性内切酶位点,（三）构建的基本策略与技术路线（P54）,策略:,切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。,噬菌体载体的构建及其主要类型,插入型载体（insertion vectors）,，只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。,替换型载体（rePlacement vectors）,，具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代。,在基因克隆中的二者的用途不尽相同。,插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。,而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。,插入型载体,外源的DNA克隆到插入型的载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的,插入失活效应,。,插入型的载体又可以分为免疫功能失活的（inactivatiort of immunityfunction）和大肠杆菌-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlon of Ecoli-galactosidase）两种亚型。,免疫功能失活的插入型载体,在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。,当外源DNA片段插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。,因此，凡带有外源DNA插入的重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。,-半乳糖苷酶失活的插入型载体,它们的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中编码着半乳糖着酶基因lacZ。,由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。,如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列，不能合成-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。,替换型载体,替换型载体又叫做取代型载体（substitution vector），是一类在噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。,NM781便是其中的一个代表,。,在这个替换型载体中，可取代的EcoRI片段，编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基因）,由于这种NM781噬菌体的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变更被抑制了，能在乳糖麦康基氏（MacConkey）琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑，或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。,如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑。,替换型载体克隆外源DNA的步骤,应用适当的核酸内切限制酶消化载体，除去基因组中可取代的DNA区段。,将上述所得的人 DNA臂同外源DNA片段连接。,对重组体的DN A分子进行包装和增殖，以得到有感染性的重组噬菌体。,重组体DNA分子的体外包装,重组体DNA分子的转染作用,DNA的体外包装,噬菌体DNA的包装限制问题,重组体DNA分子的转染作用,用重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。,这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做,转染（transfection）,，它有别于以噬菌体颗粒为媒介的转导（transduction）。,DNA的转染作用，是一种低效的过程。即便是使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的 DNA，其典型的转染效率（即每微克DNA转染产生的噬菌斑数目），也仅为 10,5,10,6,之间。体外连接的结果，转染效率便下降到了10,4,10,3,左右。,DNA的体外包装,DNA的体外包装作用，在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体。,根据体外互补作用研究发现，噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。,将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。,这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理。,噬菌体DNA的包装限制问题,噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。上限不得超过其正常野生型DNA总量的5左右，而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75。,按野生型DNA分子长度为 48kb计算，噬菌体的包装上限是 51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb，因此,载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb,。,（四）噬菌体克隆载体的应用,建立c DNA基因文库,克隆外源目的基因,二、cosmid克隆载体（柯斯质粒载体）,（一）构建策略,由质粒和含cos位点的DNA片段组装成的载体，即cosmid,（二）cosmid的特征,1、环形双链DNA分子,36.4kb,一般10kb,2、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制,3、含有一个cos位点,A蛋白,cos末端体外包装成为噬菌体，但不含噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和DNA复制系统，不会产生子代噬菌体,4、cosmid较小，可承载更大的外源DNA,若cosmid为6.5kb，则可承载44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。,因此，cosmid克隆广泛用于构建基因组文库。,“柯斯克隆”（cosmid cloning）,应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做“柯斯克隆”（cosmid cloning）,这种技术的理论依据是，在线性噬菌体DN分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端（cos位点）。,在噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个DNA拷贝组成的多连体分子。,在此种分子中，前后两个DNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。,噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（site-specific cutting system），叫做末端酶（terminase）或Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成单位长度的片段，并将它们包装到噬菌体头部中去。,只有在被作用的DNA分子具有两个cos位点，而且它们之间的距离保持在3854kb的条件下，Ter体系才能对它们发生作用。,应用柯斯质粒作载体进行基因克隆的一般程序,将外源DNA片段与柯斯质粒线性DNA分子进行体外连接反应。,由此形成的连接产物群体中，有一定比例的分子是两端各有一个cos位点的长度为40kb左右的真核DNA片段，而且这两个cos位点在取向上是一样的，可作为噬菌体Ter功能的一种适用底物。,当加入噬菌体的包装连接物时，它能把这些分子包装进噬菌体的头部，可以用来感染大肠杆菌。,（三）使用cosmid载体的基本程序,利用cosmid的质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞,利用cosmid的噬菌体性质转导受体细胞（下图）,三、M13噬菌体克隆载体,（一）M13 DNA,丝状噬菌体，内有一环状单链DNA分子（“+”链DNA）,大小：6.4kb,结构：10个区,基因间隔区（IS区）,含复制起始位点及可插入外源DNA的位点,（二）M13DNA复制和M13噬菌体增殖,M13 DNA“+”链进入,雄性大肠杆菌,合成“-”链产生双链M13 DNA（复制型DNA或RF-DNA）按环状双链DNA方式复制，同时以“+”链DNA为模板转录包装蛋白,RF-DNA达200拷贝时，单链DNA特异结合蛋白与“+”链结合而阻断合成“-”链,结果只能以“-”链为模板合成“+”链,“+”链DNA被包装蛋白包装成新的M13噬菌体,挤出受体细胞,宿主细胞不被溶菌。,M13 DNA复制特征：以双链DNA为中间媒介,培养物高速离心上清中含噬菌体颗粒“+”链DNA,沉淀菌体破碎后，可提取RF-DNA,（三）M13噬菌体克隆载体的构建策略和途径,策略：在RF-DNA的IS区插入选择标记基因，并组装合适。,RF-DNA上有10个B su I位点部分酶切获得全长线形RF-DNA,与含LacZ标记的Hind酶切片段进行平末端连接M13mp1载体。为获得合适的克隆位点,可在Lac Z区插入连杆,构建成对M13载体，保证外源DNA两条链都能随“+”链一起复制包装。,（四）M13克隆载体的优点与应用,优点：,1、以双链环形DNA为中间媒介复制，可与质粒一样体外纯化操作,2、制备的M13 DNA单、双链都能转化大肠杆菌，直接转染受体细胞,3、单链DNA不受包装限制，可包装M13 DNA分子6倍的DNA分子,4、可产生大量纯化的含外源DNA插入的单链DNA分子,主要用途：克隆、分离单链外源DNA片段,获得的“+”链可直接用于DNA测序,四、Ca MV克隆载体,花椰菜花叶病病毒（CaMV）环状双链DNA分子,（一）CaMVDNA分子,大小：8kb,结构：在病毒颗粒中呈开环形式，负链有一缺口，,正链有两缺口。进入植物细胞后单链部分被,酶解，缺口自行闭合，成为环状DNA分子。,（二）Ca MV基因区,8个阅读框（ORF）和3个间隔区（IR13）,IR1 ORF VI与ORF VII之间,IR2 ORF VII与ORF I之间,IR3 ORF V与ORF VI之间,IR1 和IR3区各有一个启动子结构，分别启动同方向转录35S RNA和19S RNA，而两者的终止子都在IR1区。,35S启动子,组成型强启动子。组装了35S启动子的外源基因可在植物细胞高效表达，在蓝藻细胞内也有效表达。,（三）Ca MV的增殖和感染,1、增殖途径：,Ca MV颗粒蚜虫病毒DNA进入植物细胞核,转录19S RNA翻译,35S RNA 翻译,反转录,“-”链DNA 复制出“+”链,2、Ca MV-DNA可转染植物细胞,在ORF II和ORF VII区插入外源DNA后仍能转染植 物细胞,包装成新的,Ca MV颗粒,（四）构建Ca MV克隆载体的基本策略和途径,策略,Ca MV-DNA能侵入植物细胞而将目的基因导入，并且清除Ca MV对植物的致病性基因,途径,1、构建互补克隆载体:组装(目的基因+标记基因)而无感染能力+两种基因和感染能力都无彼此获得对方产物感染能力,2、构建置换型克隆载体,置换的外源基因较小,3、构建混合型克隆载体,Ca MV-DNA 合适的限制性酶切组入Ti的T-DNA区完成构建,4、构建Ca MV-融合基因克隆载体系统,将35S启动子与目的基因融合，高效表达目的基因。,五、烟草花叶病毒（TMV）克隆载体,单链正义RNA，6395bp,特点：复制量和外壳蛋白表达量高，寄主范围广，能在整株植物上快速扩散,TMV载体构建策略有四种基本形式（图3-20）,六、SV40克隆载体哺乳动物基因克隆载体,（猿猴空泡病毒40）,（一）SV40基因组,双链闭环DNA,：5243bp,酶切位点：,早期转录区：Bam H、Bst、Tap识别序列,晚期转录区：Acc、Nae、Hae,、Hpa、EcoR、Ban、EcoR、Afl,转录启动区：Bgl、Sfi都只有一个识别序列,SV40病毒载体,实验证明，一些具有DNA基因组或其生活史中出现有DNA阶段的真核生物的病毒，经过改建之后，都可以发展成为用于转移动物基因的分子载体。,动物病毒特点,动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效的启动子。,有许多种动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。,有些动物病毒具有控制自己复制的顺式元件和反式作用因子。,有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。,病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接受器(acceptor)。用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒(pseudovirions)，即构成了一种高效的转化体系。,SV40病毒的基本生物学特性,猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40,SV40),是迄今为止研究得最为详尽的乳多空病毒(Papova viruses)之一。SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA，其大小仅有5243bp，很适于基因操作。,SV40病毒的生命周期,根据SV40病毒感染作用的不同效应，可将其寄主细胞分成三种不同的类型,。,SV40病毒在感染了CV-1和AGMK猿猴细胞之后，便产生感染性的病毒颗粒，并使寄主细胞裂解。我们称这种感染效应为裂解感染(lytic infection)，而猿猴细胞则叫做,受纳细胞,(permissive cell)。,但如果感染的是啮齿动物(通常是仓鼠和小鼠)的细胞，就不会产生感染性颗粒，此时病毒基因组整合到寄生细胞的染色体上，于是细胞便被转化，也就是说发生了癌变。我们称这种啮齿动物细胞为SV40病毒的,非受纳细胞,(non-permissive cell)。,人体细胞是SV40的,半受纳细胞,(semi-permissive cell)，因为同SV40病毒接触的人体细胞中，只有1%2%会产生出感染性的病毒。,SV40病毒对猿猴细胞的裂解感染可分成三个不同的时相,在感染了寄主细胞之后，有一段长达812小时的,潜伏期,，在这个期间，病毒颗粒脱去蛋白质外壳，同时DNA逐渐地转移到寄主细胞核内；,紧接着4小时为,早期时相,，此时发生早期mRNA和早期蛋白质的合成，并出现病毒诱导寄主细胞DNA合成的激发作用；,在这以后的36小时称为,晚期时相,。进行病毒DNA、晚期mRNA和晚期蛋白质的合成，并在高潮时发生病毒颗粒组装。,大约在感染的第三天，细胞裂解，平均每个细胞可释放出105个的病毒颗粒。,SV40病毒的基础分子生物学,SV40病毒是一种小型的20面体的蛋白质颗粒，由三种病毒外壳蛋白质Vp1、Vp2和Vp3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA。,同其它病毒不同，SV40 DNA是同除了H1之外的所有寄主细胞组蛋白(H4、H2a、H2b和H3)相结合。,这些组蛋白使病毒DNA分子紧缩成真核染色质所特有的念珠状核小体，这种结构特称为微型染色体(minichromosome)。,感染之后的SV40基因组，输送到细胞核内进行转录和复制。,SV40病毒基因组表达的时间顺序是相当严格的,据此可将其区分为早期表达区和晚期表达区,围绕在SV40 DNA复制起点周围约 400bp的 DNA区段，是十分引人注意的。,现在已经弄清紧挨这个起点的DNA序列，是调节早期和晚期初级转录本合成的控制信号。,早期转录本的合成，就是由位于这个区段内的由一对72核苷酸序列串联而成的强化因子序列激活的。,SV40病毒基因组表达的一个重要特点是，它的RNA剪辑模式非常复杂。,通过不同的剪辑途径，早期初级转录本加工成2种不同的早期mRNA(多瘤病毒的早期初级转录本加工成3种不同的早期mRNA)；而晚期的初级转录本加工成3种不同的晚期mRNA。,这2种早期mRNA分别编码大T抗原的小t抗原(即肿瘤蛋白质或抗原)。,晚期转录本按照其特定的沉降系数，可区分为16S、18S和19S三种mRNA，它们分别编码Vp1、Vp3和Vp2病毒蛋白质。Vp1编码区同Vp2和Vp3的编码区是以不同的转译结构形式彼此交叠的,SV40病毒的增强子序列,在SV40病毒基因组中存在着一个增强子序列。,其长度为72bp，以串联重复的形式位于基因组DNA复制起点的附近，它的主要功能是促进病毒DNA发生有效的早期转录，而且具有一般增强子所共有的基本特性。,外源的基因可以融合在SV40 DNA的早期转录区段内，而SV40的增强子又能够有效地激活SV40早期转录单位的转录活性。,因此显而易见，SV40增强子在哺乳动物的基因操作中是相当有用的。,此外，SV40增强子还可以增强由细胞启动子启动的基因转录作用。,SV40病毒载体,野生型的SV40病毒颗粒的包装范围相当严格，超过其基因组大小(5.2kb)的重组DNA就不能够被包装为成熟的病毒颗粒。,而且，SV40还存在着寄主细胞的局限性，它只能在受纳细胞中增殖，并最终导致寄主细胞的死亡，这样就不能作长期的培养使用。,因此，野生型的SV40病毒必须经过改造之后，才能发展成为基因克隆的有用载体。,取代型的重组病毒载体(recombinant virus vector),重组的病毒-质粒载体(recombinant viral plasmid vector),取代型的重组病毒载体(recombinant virus vector),在这种类型的载体中，外源DNA是直接插入在缺陷性的病毒基因组上。,由于插入的外源DNA片段，在大小上同被取代的病毒基因组区段是等同的，因此形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。,但为了补充这段被取代的病毒基因组DNA的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。,晚期区段取代载体,实验中已经观察到，缺失了整个晚期区段功能的SV40病毒，同可互补这段功能的一种温度敏感(ts)的辅助病毒混合感染时，仍然能够增殖。,因此，可以通过取代晚期区段的途径构建SV40病毒载体。,最常用的辅助病毒是tsA突变体，它合成一种温度敏感的T抗原。,早期区段取代载体,按照同样的道理，也可以构建出早期区段取代载体(early region replacement vector)。,当SV40病毒的早期区段被取代后，就失去了T抗原的功能，因此，早期区段取代载体必须使用具有互补功能的辅助病毒。,1981年Y.Gluzman发现了一种特殊的COS细胞系，能够有效地互补T抗原，从而大大地方便了早期区段取代载体的使用，被认为是SV40载体发展历程中的一个重要的突破。,但由于晚期启动子在感染周期中能较长时间地保持活性，又具有较强的表达能力，因此相比之下，早期区段取代载体具有更为广泛的用途。,鉴于病毒基因组的复制拷贝数可高达数十万份，因此晚期启动子十分有效。这类载体可用来生产大量的蛋白质。,重组的病毒-质粒载体,在这类载体中，病毒基因组部分只保留下维持在哺乳动物细胞中进行复制所必须的有关序列，但它融合上了一个细菌质粒，因而还能够在大肠杆菌细胞中进行复制和增殖。,不过这种重组体分子没有被包装成病毒颗粒，不会出现裂解感染的情况，它实际上是一种类似于质粒的DNA分子载体。,含有完整早期区段和复制起点的病毒-质粒载体,SV40和多瘤病毒(polyoma virus)的基因组能够在寄主细胞中快速地复制，并达到相当高的拷贝数。,利用这种能力，现在已经发展出了一类特殊的病毒载体。,这类病毒载体，实质上是由病毒的早期区段和复制起点同大肠杆菌的质粒分子重组而成的，所以又叫做,病毒-质粒载体(viral-plasmid vector),。,由于它们既可在大肠杆菌细胞中复制，也能在哺乳动物细胞中复制，根据这种特性，在有的文献中有时也称之为穿梭载体。,（二）SV40-DNA复制与增殖,猿猴细胞,受纳细胞,嚙齿动物（小鼠、仓鼠）,非受纳细胞,；细胞癌变,人：12%细胞产生病毒颗粒，不会插入染色体，相对安全,（三）构建策略和途径,包装严格，不能包装大于SV40-DNA的分子，只能构建,取代型载体,或,SV40-DNA与质粒DNA的重组型载体,1、取代型,被取代的DNA序列不能超过SV40-DNA的30%,（1）晚期转录区取代型：需辅助载体共同转染受体细胞,（2）早期转录区取代型：辅助细胞系,（将SV40早期转录区DNA序列整合到敏感细胞基因组上）,2、病毒-质粒重组克隆载体：质粒载体的衍生物,（1）病毒-质粒重组克隆载体（穿梭质粒）：含SV40完整早期转录区和DNA复制起始点，及质粒DNA的复制起始点和选择性标记,（2）微型病毒复制子质粒载体：只含SV40复制起始点,七、反转录病毒克隆载体：一类RNA病毒,（一）劳斯肉瘤病毒的生物学特性,RSV：含两条相同的38S RNA（右图）;与宿主细胞提供的tRNA,Trp,结合处：PBS+ve、PBS-ve,RSV的复制与增殖：,（右图）接上长末端重复序列（LTR）,策略,：RNA病毒不能直接构建，必须从感染动物细胞中分离出原病毒DNA，按不同需求删去部分序列，组入选择标记、目的基因、调控元件，再克隆入质粒转化大肠杆菌，才可获重组载体。,（二）构建RSV载体的策略和途径,1、反转录病毒-质粒载体,关键步骤：,体外删去原病毒的gag、pol、env等序列，保留5和3LTR序列以及PBS+ve、PBS-ve和psi（包装）位点，插入合适的选择标记如neo、gpt等。(如图),需辅助反转录病毒,Gag、Env蛋白,识别包装位点psi,将重组的反转录病毒包装成新的病毒颗粒,新病毒能合成各种所需的蛋白质。,特点：更高的转化效率，基因转移成功率100%,改进：鉴于危险性，已建立了不需辅助反转录病毒的克隆载体系统。将缺失psi位点的原病毒DNA转化动物受体细胞，获得全部包装蛋白质，即辅助细胞。,2、广宿主反转录病毒克隆载体,组入能感染多种动物细胞的env基因,3、反转录病毒表达克隆载体,可插入6,kb,的外源基因。若剪短原病毒DNA，则可承载20kb,八、腺病毒克隆载体,（一）腺病毒的一般生物学特性,Ad：无囊膜的20面体，含一个线形双链DNA分子，约36kb。,Ad-DNA两端具有逆向末端重复序列（IRT），5端共价结合一种5.5kD的蛋白质（TP），进入宿主细胞后Ad-DNA自行环化。,（二）腺病毒载体构建,特点：易感染性、宿主范围广、毒性低（安全）、可容纳的外 源基因大、不整合入宿主染色体DNA。,基因转移中最有前途的克隆载体之一,人类腺病毒有51个血清型，常用的是Ad5和Ad2型。进入宿主细胞后以复制为界分早晚两个基因表达时期。早期基因(E 1E)编码调节因子，晚期基因编码病毒结构蛋白。,野生型腺病毒容纳最大外源DNA为2kb。理论上，除,基因组两端约500bp的顺式结构,和,包装必需结构,外，其他结构均可被替换成外源DNA。,策略：构建一个含MCS和筛选标志的质粒（有病毒基因组某端早期序列）将一表达盒（启动子外源基因Poly A）插入E1、E3区或E4至右IRT之间 穿梭质粒；,再构建含非必须区基因缺失的环状腺病毒质粒，在菌体复制；,穿梭质粒+环状腺病毒质粒 同源重组 重组载体。,例：重组Ad-hFV构建（如图）,改进：构建能在野生型Ad感染的各种靶细胞内选择性复制的Ad载体。,（三）Ad克隆载体的应用,1、基因治疗癌症,（1）导入肿瘤抑制基因和反义癌基因,（2）导入前体药物转换酶基因病毒引导的前体药物治疗,（3）导入核酶基因，降低癌基因的表达水平,2、表达真核基因,3、研究疫苗,九、痘苗病毒克隆载体,（一）生物学性质,线形双链DNA分子，180200kb，编码200多种蛋白,（二）构建,方法：痘苗病毒的基因组结构复杂，尚无质粒型的痘苗病毒克隆载体，因此必须采用,同源重组,方法构建,痘苗病毒克隆载体特点,：,1）,表达产物与天然产物的活性和理化性质相近,2）外源目的基因和载体的免疫原性均较好,3）外源基因的插入量大,4）宿主细胞广泛,5）表达产物可翻译后修饰，无需佐剂，纯化简单，产物稳定，易于保存运输,十、杆状病毒克隆载体,自学要点：,基因组特性，同源重组方式，阳性克隆检测，表达特点。,思考题,1、名词解释：Cos位点、受纳细胞、非受纳细胞,2、构建噬菌体载体的策略及其技术路线。,3、试从cosmid克隆载体的构建策略上说明其特征。,4、简述病毒的溶原性和溶菌性增殖途径。,5、M13噬菌体载体有何优点和用途？,6、简述腺病毒克隆载体的策略及其主要用途。,7、痘苗病毒克隆载体有何特点？为什么要用同源重组方式构建？,8、如何构建反转录病毒载体？举例说明。,33染色体定位整合克隆载体,质粒与病毒克隆载体的不足：,1、转基因生物中游离的外源DNA分子能多拷贝复制，但易丢失，导致转基因生物的不稳定性,2、随机插入染色体的外源DNA片段能稳定维持，但因插入的位点不确定，可能干扰受体细胞基因组的自稳系统，进而导致有害突变，造成选育转基因生物不可知性，增加难度,基因整合平台系统基因定位同源重组(基因打靶),整合平台：即受体细胞基因组上给定的DNA区域，是外源DNA 定位整合的位置,定位整合克隆载体：除一般质粒克隆载体必备的元件外，还含有一个或两个与整合平台DNA区域核酸序列同源的,DNA片段（长度最好1kb）,一、定位整合克隆载体的几种模式,（一）内源平台双交换置换克隆载体,（二）外源平台双交换置换克隆载体,（三）内源平台双交换插入克隆载体,（四）内源平台单交换插入克隆载体,二、定位整合效率,与受体细胞的种属和同源DNA片段的长短有关,整合效率偏低，有待改进,三、定位整合克隆载体,受体生物：原核生物蓝细菌、高等植物（拟南芥、水稻等）的原生质体、动物鼠的胚胎干细胞、人的细胞,整合平台：内源isiAB、cpcB2A2、hprt、rDNA,外源hpt、aph,（一）蓝藻染色体定位整合克隆载体,1、丝状蓝藻Calothrix sp.PCC7601