第一章--微生物检验鉴定技术.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本章提纲,第一节 微生物检验基本知识与操作,第二节 微生物常规鉴定技术,第三节 食品微生物检验新技术,第一节 微生物检验基本知识与操作,包括显微镜检、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。,第一节 微生物检验基本知识,一、接种（,inoculation,）,将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。,.,接种工具,1,接种针,2.,接种环,3.,接种钩,4.5.,玻璃涂棒,6.,接种圈,7.,接种锄,8.,小解剖刀,第一节 微生物检验基本知识,一、接种,2.,常用的接种方法,）,涂布接种,先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，使菌液均匀分布，即可长出单个菌落。,）,液体接种,从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中；或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，都属于液体接种。,）,注射接种,用注射的方法将微生物转接至活的生物体内，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种。,）,活体接种,是专用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式有注射、灌喂、拌料喂养等。,第一节 微生物检验基本知识,一、接种,3.,无菌操作,(Aseptic technique),培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。,在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。,Aseptic technique,Aseptic technique,is a set of specific practices and procedures performed under carefully controlled conditions with the goal of minimizing contamination by pathogens.,Purpose:,Aseptic technique is employed to maximize and maintain asepsis,the absence of pathogenic organisms in the clinical setting and to prevent the spread of pathogens.,Often,practices that clean(remove dirt and other impurities),sanitize(reduce the number of microorganisms to safe levels),or disinfect(remove most microorganisms but not highly resistant ones)are not sufficient to prevent infection.,针尖上的细菌,第一节 微生物检验基本知识,二、分离纯化（,Isolation,）,含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（,Mixed culture,）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（,Pure culture,）。,在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。,第一节 微生物检验基本知识,二、分离纯化,、倾注平板法,(Pour plate,),第一节 微生物检验基本知识,二、分离纯化,、涂布平板法,Spread plate,第一节 微生物检验基本知识,二、分离纯化,、平板划线法,Streak plate,常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。,Streak plate,第一节 微生物检验基本知识,二、分离纯化,、富集培养法,富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其它微生物。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。,第一节 微生物检验基本知识,二、分离纯化,、厌氧法,在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把它放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌石蜡于培养基表面，使与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用,N,2,或,CO,2,取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。,有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。,第一节 微生物检验基本知识,三、培养,1,、根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养。,好氧培养,(Aerobic Incubation),：,也称“好气培养”。,厌氧培养,(Anaerobic Incubation),：,也称“厌气培养”。,第一节 微生物检验基本知识,三、培养,、根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类。,固体培养,：,solid incubation,液体培养,：,liquid incubation,第二节 微生物常规鉴定技术,一、形态结构和培养特性观察,二、生理生化试验,三、血清学试验,第二节 微生物常规鉴定技术,一、形态结构和培养特性观察,1,、微生物的形态结构观察,微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。,2,、微生物培养特性观察,E.Coli(G,-,),绿脓杆菌单鞭毛,S.aureus(G,+,),梭状芽孢杆菌,曲霉,青霉,酵母,炭疽芽孢,革兰染色法，丹麦病理学家,C.Gram,创立（,1884,）,（,1,）涂片：（,2,）晾干：（,3,）固定,（,4,）结晶紫色染色：,1min,。水洗,（,5,）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染,1min,。水洗,（,6,）脱色：将玻片倾斜，连续滴加,95%,乙醇脱色,2025s,至流出液无色，立即水洗。,（,7,）复染：滴加蕃红复染,5min,。水洗,（,8,）晾干：晾干或者用吸水纸吸干。,（,9,）镜检：先用低倍，再用高倍，最后用油镜。,（,10,）实验完毕后的处理：,浸过油的镜头：,a.,先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。,b.,用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦,23,次。,c.,再用干净的擦镜纸将镜头擦,23,次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。,细菌染色玻片用废擦镜纸将香柏油擦干,Grams staining,第二节 微生物常规鉴定技术,一、形态结构和培养特性观察,1,、微生物的形态结构观察,2,、微生物培养特性观察,微生物培养特性的观察是微生物检验鉴别中的一项重要内容。,）细菌的培养特征,包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。,细菌在液体培养基中生长性状观察,A.,深浊度：观察是否透明、轻度浑浊、中度浑浊或极度浑浊，还有均匀浑浊、颗粒状浑浊、絮状浑浊。,B.,沉淀：试管底有无沉淀，沉淀物呈颗粒状、粘稠状或絮状。轻摇时云雾状、絮状或发辫状升起。,C.,表面：有无菌膜及附着于管壁的菌环,D.,色素及气味,细胞在固体培养基上菌落生长性状观察,A.,大小：菌落直径在,1mm,以下为露滴状菌落；,1-2mm,为小菌落；,2-4,为中等大菌落；,4-6mm,或更大为大菌落。,B.,形状：有圆形，有规则形、根足形、菌丝状等,C.,边缘：有整齐、锯齿状、纤毛状、卷发状等,D.,表面：有光滑、湿滑、粗糙、颗粒状、皱丝状、同心状、放射状等,E.,降起度：有角平、隆起、脐状、扭扣状,F.,颜色：有无色、白色、灰白色、金黄色、柠檬色、绿色、红色等,G.,透明度：有透明、半透明、不透明等,一、形态结构和培养特性观察,1,、微生物的形态结构观察,2,、微生物培养特性观察,）细菌的培养特征,）霉菌酵母菌的培养特征：,大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。,霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。,第二节 微生物常规鉴定技术,二、生理生化试验,微生物生化反应：指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。,微生物检验中常用的生化反应有：,糖或醇类发酵试验 淀粉水解试验,V-P,试验,甲基红（,MR,）试验 靛基质（,Indole,）试验 过氧化氢酶试验,硝酸盐还原试验 明胶液化试验 尿素酶（,Urease,）试验,氧化酶试验 硫化氢（,H,2,S,）试验 三糖铁（,TSI,）琼脂试验,氨基酸脱羧酶的测定 耐盐性试验 卵磷脂酶的测定,石蕊牛奶反应 酪蛋白水解 苯丙氨酸脱氨试验,氰化钾试验 对叠氮化钠的抗性,硫化氢,-,靛基质,-,动力（,SIM,）琼脂试验,含碳化合物的利用（柠檬酸盐或丙酸盐利用）,Biochemical and Metabolic Properties of Microbes,Microorganisms can be classified,or distinguished from one another,by the ability to(1),grow on different substrates and/or production of different end products,(2),produce specific enzymes,(3),use oxygen,or(4),be motile,.,For example,certain microbes can use different carbohydrates as sources of energy and/or carbon.,Because such variability exists in carbohydrate utilization between different microbes,this can aid in the group,genus,or species identification.,第二节 微生物常规鉴定技术,三、血清学试验,血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。,在细菌的检测中，应用最多的是凝集试验、沉淀反应和补体结合试验。,Serological testing,Serology,is a,medical,blood test,to detect the presence of,antibodies,against a,microorganism,.,Certain microorganisms(antigens)stimulate the body to produce antibodies during an active infection.,血清学试验,的一般特点：,1),抗原体的结合具有,特异性,，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。,2),抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是,可逆的,。,3),抗原体的结合是按,一定比例,进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。,4),血清学反应大体分为,两个阶段,进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。而且，在第二阶段反应中，电解质、,PH,、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。,第二节 微生物常规鉴定技术,三、血清学试验,、凝集反应（,Agglutination reaction,）,颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。,）直接凝集反应：,a.,玻片凝集法；,b.,试管凝集法,）间接凝集反应,第二节 微生物常规鉴定技术,三、血清学试验,、凝集反应（,Agglutination reaction,）,、沉淀反应（,Precipitation test,）,可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，故应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。,）环状沉淀反应,）絮状沉淀反应,）琼脂扩散试验,第二节 微生物常规鉴定技术,三、血清学试验,、凝集反应（,Agglutination reaction,）,、沉淀反应（,Precipitation test,）,、补体结合反应,(Complement fixation reaction),补体结合反应是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合，就会出现溶血现象,;,如果与细菌及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象。因此，如果出现溶菌，说明抗原抗体是相对应的（试验结果阳性）；如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应（阴性）。,此反应操作复杂，敏感性高，特异性强，能测出少量抗原和抗体，所以应用范围较广。,第二节 微生物常规鉴定技术,三、血清学试验,、凝集反应（,Agglutination reaction,）,、沉淀反应（,Precipitation test,）,、补体结合反应,(Complement fixation reaction),其它方法：,荧光抗体技术,ELISA,免疫组化,。,第三节 食品微生物检验新技术,微生物检验新方法,1,检查某些细菌的专有酶及代谢产物进行快速鉴定,2,应用免疫学方法检测微生物抗原或抗体：,放射免疫分析,(RIA),、酶免疫分析,(EIA),、荧光免疫分析,(FIA),、化学发光免疫分析,(CIA),、生物发光免疫分析,(BIA),等,3,细菌毒素的快速检测,4,细菌对抗菌药物敏感性的快速检测,5,分子生物学技术在检测微生物中的应用,核酸探针、聚合酶链反应、基因芯片技术,6,快速检测细菌生化反应及成套鉴定系统,7,病原微生物的自动化系统：,最有代表性的是,AMS,微生物自动分析系统,。,AMS,微生物自动分析系统,3M,快速检验方法,放射免疫分析,(RIA),酶免疫分析,(EIA),荧光免疫分析,(FIA),化学发光免疫分析,(CIA),生物发光免疫分析,(BIA),微生物与免疫学方法,分子生物学方法,核酸探针,(Nuclear acid probe),聚合酶链反应,(Polymerase chain reaction,，,PCR,）,核酸分子杂交技术,基因芯片技术（,microarray,）,16S rRNA,序列分析,RAPD,基因分型技术,。,一些参考文献：,食品微生物检验技术的研究进展,现代食品科技,张洁梅,病原微生物检验新技术研究进展,畜禽业,许信刚,张琪,食品中病原微生物快速检测方法研究进展,食品研究与开发,宋宏新,马娜,食品微生物检验新方法简介,现代食品科技,郑东宏,核酸杂交技术在食品微生物检验中的应用,中国卫生检验杂志,何宏艳,膜过滤法微生物检验简介,-,快速微生物检验法与检测,中国食品工业,王震,食品安全的微生物学检验的质量控制,食品科技,姚明兰,吴定,刘长鹏,，,关于食品卫生微生物检验方法若干问题的探讨,中国卫生检验杂志,胡巅,国内外的食品微生物检验,检验检疫科学,李志勇,胡小云,凌莉,微生物快速检验最新进展,食品研究与开发,刘炳智,朱蓓,王涛,Go for it,！,