现代分子生物学技术课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学研究方法,基因操作,DNA,分子的切割与连接,核酸分子杂交,凝胶电泳,细胞转化,核酸序列分析,基因的人工合成,基因的定点突变,PCR,扩增等,核心技术,（一）三大成就：,1,、,40,年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是,DNA,而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；,一、发展历程及基础,2.50年代揭示了,DNA,分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；,Rosalind Franklin,X-ray,光源,DNA,Maurice Wilkins,成像,1953-Franklin&Wilkins,3.50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。,Jacob and Monod,二、,DNA,操作技术,（一）核酸的凝胶电泳,基本原理：,一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比,与分子的摩擦系数成反比,DNA,和,RNA,被称为多聚阴离子（,polyanions,），,核酸分子放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，,DNA,分子的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。,大分子量的,DNA,移动的慢,小分子量的,DNA,移动的快,电泳缓冲液,阳极,阴极,DNA,加样孔,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶分辨,DNA,片段的范围为0.250,kb,之间,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1到1000个碱基对之间,凝胶类型及浓度,分离,DNA,片段的大小范围（,bp）,0.3%琼脂糖,50 0001 000,0.7%琼脂糖,20 0001 000,1.4%琼脂糖,6 000300,4.0%聚丙烯酰胺,1 000100,10.0%聚丙烯酰胺,50025,20.0%聚丙烯酰胺,501,凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强；反之浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。,在紫外线的照射下结合溴化乙锭（简称,EtBr,）,的,DNA,分子发出荧光,每条,DNA,带中仅含有0.05,g,的微量,DNA,也可以被清晰地检测出来。,称样,溶解,加热,制板,倒胶,电泳操作基本程序,取样,点样,电泳,检测,结果分析,（二）核酸的分子杂交,将带有互补的特定核苷酸序列的单链,DNA,或,RNA,混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为,杂种核酸分子,。,DNA/DNA,或,DNA/RNA,不同温度下,DNA,的构型变化,在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的,DNA,或,RNA,分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“印迹杂交”。,材料：,尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜（,DEAE,）,步骤：,第一，将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上核酸印迹转移、电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法,;,第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的,DNA,或,RNA,探针进行杂交,Southern Blotting,的过程,（1）碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的,DNA,（2）,通过电泳液的移动转移胶中的,DNA,（3）,固定胶中的,DNA,（4）,预杂交和杂交（放射性和荧光检测）,（5）结果检测,1、Southern Blotting,（,DNA,印迹技术）,常用的荧光染料：,C,5,、C,3,等,2.Northern blotting,（,RNA,印迹技术）,是将,RNA,分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。,分离的,mRNA,(,不同长度,),探针,DNA,结合,3.Western blotting,（蛋白质杂交技术）,将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素,125,I,标记的特定蛋白质之抗体进行反应。,主要步骤：,蛋白质样品的制备,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶(,PAGE),电泳,蛋白质的电转移：硝酸纤维素滤膜,靶蛋白的免疫学检测,Step 1.,靶蛋白于第一抗体（一抗）反应,Step 2.,与标记的第二抗体（酶标二抗）反应,Step 3.,显色反应：酶促反应,4,、原位杂交（,in situ hybridization,）,DNA,的定位,RNA,定位,将标记的核酸探针与,细胞或组织中的,核酸进行杂交，称为原位杂交。,特点,:,能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究,不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高,能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,核酸原位杂交的基本步骤,细胞或组织的固定：载玻片,组织细胞杂交前的预处理,:,用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质,探针的选择和标记,杂交,杂交结果检测,检测重组体克隆的菌落杂交技术,5,、探针的标记,探针的种类,:,根据核酸的性质，可分为,DNA,和,RNA,探针,;,根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针,;,根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针,;,根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。,标记物,:,核素标记物（同位素标记）：,32,P、,35,S、,3,H,等,非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素,缺口平移法,（,1,）双链,DNA,探针,当双链,DNA,分子的一条链上产生切口时,E.coli,DNA,聚合酶,就可将核苷酸连接到切口的,3,羟基末端。,同时该酶具有从,53,的核酸外切酶活性,能从切口的,5,端除去核苷酸。,由于在切去核苷酸的同时又在切口的,3,端补上核苷酸,从而使切口沿着,DNA,链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。,最合适的切口平移片段一般为,50-500,个核苷酸。,随机引物法,随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与,DNA,模板结合,在,Klenow,酶的作用下,合成,DNA,探针。产物平均长度为,400-600,个核苷酸。,（,2,）单链,DNA,从,M13,载体衍生序列合成单链,DNA,探针,从,RNA,合成单链,cDNA,探针,（,3,）寡核苷酸探针,（,4,）末端标记,DNA,探针,（,5,）,RNA,探针,从,M13,载体衍生序列合成单链,DNA,探针,从,RNA,合成单链,cDNA,探针,所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的,DNA,而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。,提供转化,DNA,的菌株叫作供体菌株，接受转化,DNA,的细菌菌株则被称为受体菌株。,处于能够接受外源,DNA,状态的细胞称为感受态细胞。,（三）细菌转化,步骤：,1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。,2.与转化混合物中的外源,DNA,形成粘附在细胞表面的复合物。,3.立即将该体系转移到42下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。,4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复,5.涂布于选择性培养基中分离转化子。,（四）,基因扩增,聚合酶链式反应，即,PCR,技术，是一种在体外快速扩增特定基因或,DNA,序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。,1、,基本原理,：,PCR,由变性,-,退火,-,延伸三个基本反应步骤构成。,模板,DNA,的变性：模板,DNA,经加热至,93,左右,一定时间后，使模板,DNA,双链或经,PCR,扩增形成的双链,DNA,解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,模板,DNA,与引物的退火,(,复性,),：模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降至,55,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合；,靶序列,引物,1,引物,2,5,3,5,5,3,5,3,靶序列,3,靶序列,靶序列,引物,1,引物,2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq,DNA,聚合酶,引物的延伸：,DNA,模板,-,引物结合物在,TaqDNA,聚合酶的作用下，以,dNTP,为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板,DNA,互补的链。,第一次,PCR,循环的结果是产生两个靶序列的复制。,1,cycle=2 Amplicon,2,cycle=4 Amplicon,3,cycle=8 Amplicon,4,cycle=16 Amplicon,5,cycle=32 Amplicon,6,cycle=64 Amplicon,7,cycle=128 Amplicon,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target,12,24,38,416,532,664,201,048,576,301,073,741,824,2、PCR,反应五要素：引物、酶、,dNTP、,模板和,Mg,2+,（1）PCR,引物设计,一对引物，与3端互补,长度：1530个核苷酸,碱基分布随机,引物内、引物间不应有互补序列,引物与非特异扩增区无同源性,3端必须互补,5端可游离,引物浓度一般为0.1 0.5,mol/L,（2）DNA,聚合酶,在核苷酸底物的存在下，以一条,DNA,链为模板催化新链的合成,需要具有,3-OH,的引物,具有 5 到3 方向聚合的能力,通常具有 3到,5,外切酶活性,Taq,DNA,聚合酶在7080具有最高聚合活性,(3)镁离子浓度,:,Taq,酶活性需要,Mg,2+,，Mg,2+,浓度过高导致非特异扩增，一般常用1.5,mmol/L,(4)底物浓度,:,dNTP,浓度在20200,mol/L,，四种,dNTP,必须浓度相等,(5)PCR,反应的缓冲溶液,:,提供合适的酸碱度和某些离子：,10,50,mmol/L Tris-HCl,缓冲液、50,mmol/L KCl,、明胶,PCR,仪,（五）核苷酸序列分析,1.,Sanger,双脱氧链终止法,(,dideoxy-termination sequencing),原理：,双脱氧（2，3）-核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的,DNA,链中，但因3 端不具,OH,基，,DNA,链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个,DNA,分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的,DNA,片段测定出核苷酸序列。,不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来,AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5,3,添加,DNA polymerase,所有4,dNTPs,其中一种标记的,ddNTP,在四个不同的反应管中各只包含一种,ddNTP.,ddTTP ddCTP ddGTP ddATP,AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG,5,3,T,TCGA,T,TCGAT,T,TCGATT,T,T,C,TCGATTT,C,TCGATTTC,C,TC,G,TCG,A,T,反应,C,反应,G,反应,A,反应,每一管中的复制的序列都停留在,ddNTPs,处,5,反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,.,这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基,.,电泳结构通过显色指示.,T,C,G,A,3,C,C,T,T,T,A,G,C,T,5,过程：,制备,ss-DNA,与引物退火分为4个反应系统每个系统中加入,dNTP（,其中,dATP,常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸,DNA,聚合酶定序反应反应产物变性后电泳凝胶干燥放射自显影,（,该法亦适合,mRNA,的序列分析）。,GC,富集区常出现“,隐影,”或“,停止,”现象，如在反应中加入,dITP,（,脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决,GC,富集区的测序。,1）模板制备,:,可自动化,2）定序反应,:,可自动化,3）凝胶电泳,:,自动化有一定困难,4）核苷酸序列阅读与计算机输入,:,可自动化,2.,DNA,序列测定的自动化,1.凝胶阻滞试验,:,凝胶阻滞试验（,gel retardation assay,），,又叫作,DNA,迁移率变动试验（,DNA mobility shift assay,），,是用于体外研究,DNA,与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。,（六）,DNA,与蛋白质相互作用研究,在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的,DNA,朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时,DNA,分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。,凝胶阻滞实验的基本原理图,A,C,B,放射自显影,*,*,*,*,凝胶电泳,放射性标记的,DNA,细胞蛋白质提取物,蛋白质与,DNA,结合,*,*,*,*,*,*,B,DNA-,蛋白质结合物电泳迁移缓慢,滞后带表明,DNA,与蛋白质结合,在,DNaseI,足迹试验（,DNA foot-printing assay,）,过程中，首先将待检测的双链,DNA,分子用,32,P,作末端标记，并用限制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链的单个末端标记的双链,DNA,分子，与细胞蛋白质提取物混合。,待二者结合之后，再加入少量的,DNaseI,（,它可沿着靶,DNA,作随机单链切割）消化,DNA,分子，并控制酶的用量使之达到平均每条,DNA,链只发生一次磷酸二酯键断裂。,2.,DNaseI,足迹试验,如果蛋白质提取物中不存在与,DNA,结合的特异蛋白质，经,DNaseI,消化之后便会产生出距放射性标记末端1个、2个、3个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的连续的,DNA,片段梯度群体。,如果有一种蛋白质已经结合到,DNA,分子的某一特定区段上，那么，它就将保护这一区段的,DNA,免受,DNaseI,的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹”。,32,p,1 5 10,*,1 4 8 10,*,加入蛋白质,X,加入,DNaseI,凝胶电泳放射自显影,1,5,10,A B,足迹,(,a),(,c),(,b),DNaseI,足迹实验,作业：,1,、凝胶电泳的原理是什么？有哪两种，分辨范围各是多少？凝胶的浓度和分辨率的关系是什么？,2,、什么是核酸分子杂交？几种杂交方法的过程各是什么？,3,、探针的类型有哪些？叙述一种探针的制作过程。,4,、什么是细菌转化？其步骤如何？,5,、什么是基因体外扩增？步骤如何？,6,、,Sanger,双脱氧链终止法的原理和过程各是什么？,（七）实时荧光定量,PCR,定义,：在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,实时荧光定量,PCR,的几种方法介绍,：,1,、,SYBR Green I,法：,SYBR Green I,是一种只与,DNA,双链的小沟部位结合的荧光染料。,基本过程是：,开始反应，当,SYBR Green,染料与,DNA,双链结合时发出荧光。,DNA,变性时，,SYBR Green,染料释放出来，荧光急剧减少。,在聚合延伸过程中，引物退火并形成,PCR,产物。,聚合完成后，,SYBR Green,染料与双链产物结合，定量,PCR,系统检测到荧光的净增量加大。,因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链,DNA,分子的数量。,2,、,TaqMan,探针技术,TaqMan,探针法是高度特异的定量,PCR,技术，其核心是利用,Taq,酶的,5 3,外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。,在,TaqMan,探针法的定量,PCR,反应体系中，包括一对,PCR,引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。,探针的,5,端标记有报告基团,(Reporter,R),，,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),。,当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着,PCR,的进行，,Taq,酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其,5 3,外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。,每经过一个,PCR,循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板,DNA,的拷贝数。,通过,Ct,值和标准曲线对起始模板进行定量分析：,CT,值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的,PCR,循环次数,确定未知样品的,C(t),值后通过标准曲线由未知样品的,C(t),值推算出其初始量,通过一系列酶作用，使总,mRNA,转变成双链,cDNA,并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的,cDNA,基因文库。,（八）,RNA,基本操作技术,1,、总,RNA,的提取,Trizol,试剂,(,苯酚,-,异硫氰酸胍）提取法：,液氮研磨材料，匀浆，加入,Trizol,试剂进一步破碎细胞并溶解细胞成分；,加入氯仿抽提、离心，分离水相和有机相，收集含有,RNA,的水相，通过异丙醇沉淀，获得比较纯的,mRNA,；,通过,OD,260,和,OD,280,测定,RNA,的纯度和浓度，并用含有甲醛的凝胶电泳检测,RNA.,2,、,mRNA,的纯化,寡聚,-,纤维素柱色谱法；,Promega,公司的,PolyAT,Ttract,mRNA,分离系统,将用生物素标记的寡聚(,dT,),引物与细胞总,RNA,共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(,dT,),引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的,mRNA。,3,、,cDNA,的合成,第一链的合成：以,mRNA,为模板，反转录成,cDNA,，由反转录酶催化，并由,oligodT,作引物。,OligodT,引物由,12,20,个,dT,构成，后面加上一个具有,Xho,等酶切位点的连接引物。,在,cDNA,合成过程中，应选用活性较高的反转录酶及甲基化,dCTP,，,保证新合成的,cDNA,链被甲基化修饰，以防止构建克隆时被限制性内切酶切割；,cDNA,两端应加上不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得双链,cDNA,的方向性。,第二链的合成：以第一链为模板，由,DNA,聚合酶催化，以,RNaseH,切割杂合链中的,mRNA,序列产生的小片断为引物，由,DNA,连接酶连接成完整的,DNA,链。,同时加入另一个酶切位点的黏性接头（,EcoR,),，与,cDNA,连接后用,Xho,酶切。,4,、,cDNA,文库的构建：基因重组,5,、基因文库的筛选：,核酸杂交法,PCR,筛选法,免疫筛选法,（九）,SNP,的理论与应用,单核苷酸多态性（,single nucleotide polymorphism,，,SNP,），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的,DNA,序列多态性。,通常所说的,SNP,都是二等位多态性的，这种变异可能是转换（,C T,，在其互补链上则为,G A,），也可能是颠换（,C A,，,G T,，,C G,，,A T,），具有转换型变异的,SNP,约占,2/3,；,转换的几率之所以高，可能是因为,CpG,二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。,1,、根据,SNP,在基因组中的分布位置可分为：,基因调控区,SNP(pSNP,),；,基因间随机非编码区,SNP(rSNP,),；,基因编码区,SNP(cSNP,),。,基因编码区,SNP(cSNP),分为两种：,一种是同义,cSNP,（,synonymous,cSNP,），即,SNP,所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；,另一种是非同义,cSNP,（,non-synonymous,cSNP,），指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。,2,、,SNP,的特点,:,密度高：,SNP,在人类基因组的平均密度估计为,300,1000,bp,在整个基因组的分布达,3 10,6,个,遗传距离为,2-3cm,密度比微卫星标记更高,可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。,富有代表性：某些位于基因内部的,SNP,有可能直接影响蛋白质结构或表达水平,因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。,遗传稳定性：与微卫星等重复序列多态性标记相比,SNP,具有更高的遗传稳定性。,易实现分析的自动化：,SNP,标记在人群中只有两种等位型,(allele),故也称为双等位标记,(,biallelic,marker),。这样在检测时只需一个,+/-,或,全,/,无,的方式,而无须象检测限制性片段长度多态性,微卫星那样对片段的长度作出测量,这使得基于,SNP,的检测分析方法易实现自动化。,3,、,SNP,的检测分析技术,（,1,）基因芯片技术,(gene chips),基因芯片又称,DNA,芯片,(DNAchips),或生物芯片,(biological chips),，是用标记的探针与特定的,DNA,样品杂交,然后通过检测杂交信号的强弱判断样品中靶分子的数量。,基因芯片检测技术的主要过程,:,首先,用生物素标记扩增后的靶序列或样品,然后再与芯片上大量的探针进行杂交,;,其次,用含链霉素的荧光素作为显色物质,图像的分析则用激光共聚焦显微镜或其他荧光显微镜对片基扫描,由计算机搜集荧光信号,并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。,（,2,）,Taqman,技术,利用,Taq,酶的,5,核酸外切酶活性,切割与,PCR,扩增产物结合的,DNA,探针,此探针带有一个供体,-,受体荧光染料对,两者能发生荧光共振能量转移,(FRET),。,Taq,酶切割使供体染料与淬灭的受体染料分离,结果使供体染料的荧光极大增强。,（,3,）分子信标技术,供体和受体荧光染料分别位于有互补序列的探针两侧,当未与靶序列杂交时,探针形成一个,发夹环,结构,使供体,-,受体染料对相互靠近而产生淬灭。反之,探针与正确的靶序列杂交时,染料对分离,荧光信号可增强至,900,倍。,（,4,）焦磷酸测序法,是一项全新的,DNA,测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理如下：,第,1,步：一个特异性的测序引物和单链,DNA,模板结合，然后加入酶混合物,(,包括,DNA Polymerase,、,ATP,Sulfurylase,、,Luciferase,和,Apyrase,),和底物混合物,(,包括,APS,和,Luciferin,),。,第,2,步：向反应体系中加入,1,种,dNTP,，如果它刚好能和,DNA,模板的下一个碱基配对，则会在,DNA,聚合酶的作用下，添加到测序引物的,3,末端，同时释放出一个分子的焦磷酸,(,PPi,),。,第,3,步：在,ATP,硫酸化酶的作用下，生成的,PPi,可以和,APS,结合形成,ATP,；在荧光素酶的催化下，生成的,ATP,又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过,CCD,光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。,第,4,步：反应体系中剩余的,dNTP,和残留的少量,ATP,在,Apyrase,的作用下发生降解。,第,5,步：加入另一种,dNTP,，使第,2,4,步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的,DNA,序列信息。,（十）基因克隆技术,1,、,RACE,技术：,在已知,cDNA,序列的基础上克隆,5,端或,3,端缺失序列的技术。,（,1,）获得高质量总,RNA,；,（,2,）去磷酸化作用；,（,3,）去掉,mRNA,的,5,帽子结构，并以,RNA,连接酶连接上特异,RNA,寡聚接头；,（,4,）以特异性寡聚,dT,为引物，在反转录酶的作用下合成第一条,cDNA,链；,（,5,）分别以第一条,cDNA,链为模板进行,RACE,反应；,（,6,）将纯化后的,PCR,产物克隆到载体,DNA,中，进行序列分析。,2,、克隆基因的分离,（,1,）应用核酸探针分离克隆目的基因,把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的分离或筛选。,应用核酸探针分离目的基因的方法叫作核酸杂交筛选法。,（,2,）应用,cDNA,差示分析法克隆基因,RDA,法充分发挥了,PCR,以指数形式扩增双链,DNA,模板的特性，通过降低,cDNA,群体复杂性和更换,cDNA,两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。因为试验对象（,Tester,）,和供试探针（,Driver,）,在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256,bp,的代表群（,representation,），,保证绝大部分遗传信息能被扩增。,（,3,）基因的图位克隆法,首先，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的,RFLP,或,RAPD,分子标记。,其次，通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的,RFLP,标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。,然后，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。在,RFLP,作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1,cm（,厘摩）相当于1%的重组率。,（十一）基因敲除技术,基因敲除是自,80,年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。,通常意义上的基因敲除主要是应用,DNA,同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。,1,、完全基因敲除,指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因的活性的基因敲除。,实验室采用取代型或插入型载体在,ES,细胞中根据正负双向选择原理进行实验：,正向选择基因,neo,通常被插入到载体靶,DNA,功能最关键的外显子中或通过同源重组法置换靶基因的功能区，其功能是：,形成靶位点的插入突变；,作为正向筛选标记。,负向选择基因,HSV-,tk,置于目的基因外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长。,完全基因敲除动物模型的基本步骤：,基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的,DNA,分子都重组到带有标记基因,(,如,neo,基因，,TK,基因等,),的载体上，成为重组载体。,ES,细胞的获得：现在基因敲除一般采用是鼠胚胎干细胞。常用的鼠的种系是,1,及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。,同源重组：将重组载体通过一定的方式,(,电穿孔法或显微注射,),导入同源的胚胎干细胞,(ES cell),中，使外源,DNA,与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的,DNA,序列整合到内源基因组中，从而得以表达。,选择筛选已击中的细胞：正负筛选法（,PNS,法），,表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。,得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中，所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。,2,、条件性基因敲除法,将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。,是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶,Cre,介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。,利用,Cre/LoxP,和来自酵母的,FLP,frt,系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型,;,通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的,1oxP,，并以此两侧装接上,loxP,的,(“,loxP,floxed”)ES,细胞产生“,loxP,floxed,”,小鼠,;,然后，通过将“,loxP,floxed,”,小鼠与,Cre,转基因鼠杂交产生靶基因发生特定方式,(,如特定的组织特异性,),修饰的条件性突变小鼠,;,在“,loxP,floxed,”,小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个,loxP,，但靶基因并没有发生其他的变化，故“,1oxP,floxed,”,小鼠表型仍同野生型的一样,;,但当它与,Cre,转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“,loxP,floxed,”,靶基因和,Cre,基因。,Cre,基因表达产生的,Cre,重组酶就会介导靶基因两侧的,1oxP,间发生切除反应，结果将一个,loxP,和靶基因切除,.,靶基因的修饰是以,Cre,的表达为前提的：即,Cre,在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰就发生在哪种组织细胞；而,Cre,的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。,所以只要控制,Cre,的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度,3,、基因捕获法,利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法，基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是,neo,基因，,neo,基因插入到,ES,细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的,ES,克隆可以很容易地在含,G418,的选择培养基中筛选出来。,中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼,cDNA,或染色体组序列分析来获得。,基因敲除技术的应用及前景：,建立生物模型。,疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。,提供廉价的异种移植器官。,免疫学中的应用。,改造生物、培育新的生物品种。,（十二）基因芯片,基因芯片（又称,DNA,芯片、生物芯片）技术，指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于,400,）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。,基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。,如在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针，当溶液中带有荧光标记的核酸序列,TATGCAATCTAG,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列,基因芯片技术：,1,、芯片制备：目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或,cDNA,作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。,2,、样品制备：将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或,DNA,、,RNA,，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。,3,、杂交反应：是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。,4,、信号检测和结果分析：杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。,数据可靠性分析,生物学意义分析,基因芯片的应用,1,、药物筛选和新药开发,2,、疾病诊断,3,、环境保护,4,、司法,5,、现代农业,6,、研究领域：包括基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变和多态性分析以及基因文库作图等方面。,