第3章--细胞生物学研究方法-9-9.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,翟中和 王喜忠 丁明孝 主编,细胞生物学（第,4,版）,Copyright,高等教育出版社,2011,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,本章主要内容,细胞形态结构的观察方法,细胞及其组分的分析方法,细胞培养与细胞工程,细胞及其生物大分子的动态变化,模式生物与功能基因组的研究,第一节 细胞形态结构的观察方法,病毒,20-200 nm,支原体,0.1-0.3 m,细菌,0.5-5.0 m,动植物细胞,20-30 m,活细胞多是,无色透明,的,直径,显微镜观察范围 肉眼观察范围,（一）普通复式光学显微镜,组成,由,3,部分组成：,光学放大系统（目镜与物镜）,照明系统（光源和聚光镜）,镜架及调节系统,（一）普通复式光学显微镜,成像,放大的倒立虚像,经物镜形成倒立实像,经目镜进一步放大成虚像,（一）普通复式光学显微镜,分辨率,分辨率：,显微镜最重要的性能参数,分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离,普通光学显微镜最大分辨率,0.2 m,:,光源波长,N,:,介质折射率,空气为,1,油为,1.4,:,物镜镜口角,(,最大,140,o,Sin,/2,最大,0.94),镜口角是指被观察点射入物镜前透镜的边缘光线之间的夹角。,（一）普通复式光学显微镜,样品制备,Figure 9-10,11a,Molecular Biology of the Cell,(Garland Science 2008),石蜡切片,H.E,染色,（二）相差显微镜和微分干涉显微镜,利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对,非染色活细胞,的观察,A.,当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加,B.,当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低,（二）相差显微镜和微分干涉显微镜,相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加“环状光阑”和“相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差,体外培养,MDCK,细胞在普通（明视场）光学显微镜（,A,）和相 差显微镜（,B,）下拍摄图像效果的比较,（二）相差显微镜和微分干涉显微镜,微分干涉显微镜以平面偏振光为光源，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别,分辨率比普通光镜提高了一个数量级,录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程,Figure 9-9,Molecular Biology of the Cell,(Garland Science 2008),Four types of light microscopy,(A)The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell,a technique known as,bright-field microscopy,(B),phase-contrast microscopy,(C)Nomarski,differential-interference-contrast microscopy,(D),dark-field microscopy,Figure 9-8,Molecular Biology of the Cell,(Garland Science 2008),正置显微镜与倒置显微镜比较,组成一样，倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。,（三）荧光显微镜,基本原理,荧光：,分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光,(,波长比入射光长,),（三）荧光显微镜,基本原理,光源和光学系统与普通光学显微镜不同,核心部件是,滤光片系统,及,专用物镜镜头,滤光片系统由,激发滤光片,和,阻断滤光片,组成,1.,照明方式通常为落射式,2.,光源为紫外光或其他短波,长的光,3.,有两个特殊的滤光片,(,发射滤片和阻断滤片,),荧光显微镜光路系统,（三）荧光显微镜,样品制备,免疫荧光技术,荧光素直接标记技术,绿色荧光蛋白,(GFP),的基因与编码某种蛋白质的基因相,融合表达,两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位,（三）荧光显微镜,应用,在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具,荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，,纺锤体微管（绿色）,、,中期染色体（蓝色）,和,原纤维状蛋白（,fibrillarin,）（红色）,等结构成分,（四）激光扫描共焦显微镜,以激光为光源,聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像,利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像,分辨率比普通荧光显微镜,1.4,1.7,倍,（四）激光扫描共焦显微镜,可通过“光学 切片”叠加后重构出样品的三维结构,Figure 9-20,Molecular Biology of the Cell,(Garland Science 2008),(,二向的,),3,D Image Reconstruction,z,x,y,z,x,y,z,y,y,荧光显微镜（,a,）和激光扫描共焦显微镜（,b,）,二、电子显微镜,透射电镜,transmission electron microscope,TEM,扫描电镜,scanning electron microscope,SEM,（一）透射电子显微镜,电子束,作为光源,电磁透镜,聚焦,镜筒高度,真空,图像通过荧光屏或感光胶片记录,1,电子显微镜与光学显微镜的基本区别,Figure 9-42(part 1 of 2),Molecular Biology of the Cell,(Garland Science 2008),光镜 电镜,光源 可见光（300-700,nm）,电子束,紫外光（200,nm）,分辨率 200,nm 0.2nm,透镜 玻璃透镜 磁透镜,真空 无要求 1.33*10,-3,10,-5,Pa,电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为,50,100,千伏时，电子束波长约为,0.0053,0.0037,纳米,2,电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数,电子显微镜,分辨率,可达,0.2 nm,电镜的,分辨本领,是指电镜处于最佳状态下的分辨率,3,电子显微镜的基本构造,电子束照明系统,成像系统,真空系统,记录系统,（二）透射电镜制样技术,超薄切片技术,戊二醛和四氧化锇,环氧树脂,厚度,40-50nm,重金属盐,超薄切片,黑白图像,超薄切片技术显示的细胞超微结构,应用超薄切片技术，几乎可以观察细胞的各种超微结构,Figure 9-45,Molecular Biology of the Cell,(Garland Science 2008),（二）透射电镜制样技术,负染色技术,观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等,重金属盐沉积在铜网上，而,样品未被染色,（故名负染）,分辨率可达,1.5 nm,左右,（二）透射电镜制样技术,冷冻蚀刻技术,包括,冰冻断裂,与,蚀刻复型,两步,观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感,样品不需固定包埋,冰冻蚀刻电镜照片,透射电镜照片与冰冻断裂,和冰冻蚀刻电镜照片比较,电镜三维重构与低温电镜技术,电镜三维重构技术,低温电镜技术,电子扫描断层成像技术,核孔复合物,（三）扫描电镜技术,利用电子,“,探针,”,在样品表面进行,“,扫描,”,激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌,（三）扫描电镜技术,样品利用,CO,2,临界点干燥,法处理,样品观察前,喷镀一层金膜,一般扫描电镜的,分辨本领仅为,3 nm,Figure 9-49(part 1 of 2),Molecular Biology of the Cell,(Garland Science 2008),小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较,注意样品制备技术的差异！,三、扫描隧道显微镜,探测微观世界,物质表面形貌,利用量子力学中的,隧道效应,具有原子尺度的,高分辨本领,可以在真空、大气、液体等,多种条件下工作,非破坏性测量,en.wikipedia.org/wiki/File:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png,第二节 细胞及其组分的分析方法,一、用超离心技术分离细胞组分,差速离心：,利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开,差速离心,一、用超离心技术分离细胞组分,密度梯度离心：,通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带,二、细胞成分的细胞化学显示方法,显色剂与细胞组分中特殊基团的结合,通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量,福尔根反应,Feulgen stain,特异显示,细胞内呈紫红色的,DNA,的分布,原理：,酸水解可以去除,RNA,，仅保留,DNA,，并除去,DNA,上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤，使 脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂（,Schiffs reagent,）反应呈紫红色,三、特异蛋白抗原的定位与定性,细胞内特异蛋白的显示可通过,抗原抗体特异结合,的方法得以实现,若,抗体偶联荧光染料,，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察,为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，,抗体需偶联电子致密物,(,胶体金,),，用电镜观察,（一）免疫荧光技术,直接间接免疫荧光,技术（,A,）,间接免疫荧光,技术（,B,）,（二）免疫电镜技术,在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位,免疫胶体金技术受到越来越多的青睐,四、细胞内特异核酸的定位与定性,原位杂交：,用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置,原位杂交技术,光镜水平,同位素标记或荧光素标记的探针,电镜水平,生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合,FISH,(,F,luorescent,I,n,S,itu,H,ybridization),五、定量细胞化学分析与细胞分选技术,流式细胞术,流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和,荧光,，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达,99%,。（,flow cytometer,）。,RNA,含量和细胞表面分子含量,2.,细胞、细胞组分的分选,第三节 细胞培养与细胞工程,line),极少数细胞在传10代后可渡过危,机而传下去40-50代次并,仍保持原来的染色体的二,倍体数量,及接触抑制行为,有限细胞系,永生细胞系：,细胞发生了遗传改变,(,染色体明显改,变,),，有,癌变,特点,细胞株,（,Cell strain),单个细胞增殖而来，所有细胞具有相,同的遗传性状,.,目前实验室中常用的几种细胞系,细胞系名称,细胞类型,来源,3T3,成纤维细胞,小鼠,HeLa,宫颈癌上皮细胞,人,BHK21,成纤维细胞,叙利亚仓鼠,PtKl,上皮细胞,袋鼠,L6,成肌细胞,大鼠,PC12,嗜铬细胞,大鼠,SP2,浆细胞,小鼠,SP2,0,骨髓瘤浆细胞,小鼠,CHO,卵巢细胞,中国地鼠,一、细胞培养,植物细胞培养,单倍体细胞培养：,用花药或花粉在人工培养基上进行培养，通过发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通 过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株,一、细胞培养,植物细胞培养,原生质体培养：,体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株,二、细胞工程,（一）细胞融合与单克隆抗体技术,细胞融合,灭活的病毒,化学物质（如,PEG,）,电融合,同核体,（,homokaryon,）,异核体,（,heterokaryon,）,合核体,（,synkaryon,）,单克隆抗体与多克隆抗体,单克隆抗体的制备,（二）显微操作技术与动物的克隆,细胞拆合：胞质体，核体,物理法：机械法或短波光,化学法：细胞松弛素,显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等,克隆羊多莉的培育,第四节 细胞及生物大分子的动态变化,Martin D N,Baehrecke E H Development 2004;131:275-284,一、荧光漂白恢复技术,亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联,高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭,由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复,测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率,fluorescence photobleaching recovery,，,FPR,Figure 10-36a,Molecular Biology of the Cell,(Garland Science 2008),二、单分子技术与细胞生命活动的研究,指在单分子水平上对生物分子的行为,(,构象变化、相互作用、相互识别等）的实时,动态检测以及在此基础上的操纵,调控等,use optical traps to probe the stepping of single molecules of kinesin,Fluorescent image of single motor proteins(left):Motion of two diffusing kinesin molecules(green)on a microtubule(red)shown as a time series kymograph.Schematic(right):By dragging diffusing kinesin molecules with laser tweezers over a microtubule,the friction force between the motor and its microtubule track can be measured very precisely,三、酵母双杂交技术,在体内,分析蛋白质蛋白质相互作用,利用转录激活因子的,DNA,结合域,(DB),和转录激活域,(AD),结合在一起才具有完整转录激活功能的原理,四、荧光共振能量转移技术,(FRET),分子具有不同能级：分子中的外层电子，一般处于电子的基态,S,0,(electronic ground state),的最低振动能级,吸收光能以后，它可以被,激发,到第一电子激发态,S,1,的任意振动能级。这过程发生在,10,-15,s,时间内,被激发的分子，首先释放能量回到,S,1,的最低振动能级，此过程发生在,10,-12,s,内；然后,从,S,1,的最低振动能级回到,S,0,的各振动能级,，并以光子的形式释放能量，即发射,荧光,FRET产生的条件,D,、,A,都能发荧光,D,的发射光谱和,A,的激发（或吸收）光谱必须有部分重叠,D,和,A,之间的距离必须小于,10nm,。,FRET,的基本原理,检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用,如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光,两个蛋白未相互作用,相互作用,五、放射自显影技术,利用放射性同位素的电离射线对乳胶,(,含,AgBr,或,AgCl),的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究,两个主要步骤：,即,同位素标记的生物大分子前体的掺入,和,细胞内同位素的显示,根据实验要求选择合适的同位素,研究,DNA,合成时通常用氚（,3,H,）标记的,3,H-TdR,研究,RNA,合成用,3,H-U,在研究含硫蛋白分子代谢时，用,35,S,标记的蛋氨酸和半胱氨酸,对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪：,持续标记,、,脉冲标记,显微放射自显影,电镜放射自显影,胰岛B细胞电镜放射自显影结果,3,H-,亮氨酸脉冲标记完成,10,分钟后，被标记的胰岛素蛋白（黑色银颗粒）从粗面内质网进入高尔基复合体中,3,H-,亮氨酸脉冲标记完成,45,分钟后，被标记的胰岛素蛋白进入分泌颗粒内,第五节 模式生物与功能基因组的研究,Figure 1-44,Molecular Biology of the Cell,Fifth Edition(Garland Science 2008),一、细胞生物学研究常用的模式生物,模式生物通常,个体较小，容易培养，操作简 单，生长繁殖快,由于基因在进化上的保守性以及遗传密码的通用性，从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息往往也适用于其他生物,Why do we need model systems?,All cells are descended from a common ancestor,Simple systems to study a biological question,Extrapolate,（外推）,results to higher organisms,Advantageous characteristics found in model organisms,Amenable to genetic manipulation,Reproduce rapidly,Transparent,Defined cell lineage,（一）大肠杆菌,原核细胞，培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变，分离和鉴定容易，转基因技术成熟，进行基因定位简便易行,（二）酵母,单细胞真核生物的代表：芽殖酵母和裂殖酵母，生长迅速并且易于遗传操作,常用于白质相互作用、细胞周期、基因表达调控、膜泡运输、细胞分化和衰老等,（三）线虫,(,Caenorhabditis elegans,),遗传背景清楚、生命周期只有,3,天，成体只有,959,个细胞，通体透明，便于胚胎发育中细胞分裂、分化以及细胞的死亡的研究,（四）果蝇,(,Drosophila melanogaster,),基因组序列已测定，与人类基因有很高的同源性，在遗传分析、染色体特性研究、胚胎发育的基因调控和细胞分化机制的研究、神经退行性疾病和学习、认知等领域的研究发挥重要的作用,（五）斑马鱼,(,Danio rerio,),小型脊椎动物。许多基因与人类的基因存在对应关系,3,个月性成熟、产卵多、胚胎体外发育，利于研究胚胎发育过程中细胞行为,（六）小鼠,(,Mus musculus,),小型哺乳动物，遗传背景清楚，进化方面最接近人类，用于转基因小鼠、基因打靶、条件基因打靶、,RNA,干涉以及疾病模型,（七）拟南芥,(,Arabidopsis thaliana,),十字花科的植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学、细胞生物学和分子生物学的研究,二、突变体制备技术,RNA,水平,RNA,干扰（,RNAi,）,二、突变体制备技术,DNA,水平,基因敲除,(knock out),