环境微生物实验课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验内容,实验一 显微镜使用及微生物观察（教材实验一）,实验二 培养基,的制备,（教材实验六）,实验三,消毒和灭菌,（教材实验六）,实验四,微生物的接种技术,（教材实验七）,实验五,细菌革兰氏染色,（教材实验四）,实验六 水中大肠杆菌群的测定（教材实验十）,实验一,显微镜使用及微生物观察,一、实验目的,1.掌握显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作和保养方法,2.观察细菌的形态并绘图,3.培养通过实验发现问题、分析问题、解决问题的能力,二、仪器和材料,光学显微镜、擦镜纸、香柏油、,二甲苯、细菌标本,三、实验步骤,1.显微镜的取送：右手握镜臂；左手托镜座；置于胸前。2.显微镜的旋转：镜筒朝前，镜臂朝后；置于观察者座位前的桌子上，偏向身体左侧，便于左眼向目镜内观察；置于桌子内侧，距桌沿5cm左右。3.对光：转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐上升，然后转动转换器，使低倍物镜对准通光孔；用手指转动遮光器（或片状光圈），使最大光圈对准通光孔，左眼向目镜内注视，同时转动反光镜，使其朝向光源，使视野内亮度均匀合适。,4.低倍物镜的使用：用手转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐下降，同时两眼从侧面注视物镜镜头，当物镜镜头与载物台的玻片相距,23mm,时停止。用左眼向目镜内注视（注意右眼应该同时睁着），并转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐上升，直到看清物象为止。如果不清楚，可调节细准焦螺旋，至清楚为止。,5.高低倍物镜的使用,6.油镜的使用：,A、将标本片放载物台上，用标本推进器固定，将欲检部分移至接物镜下。先用低倍镜找出标本的位置，然后提高镜筒，在标本的待检部位滴香柏油一滴，再换油镜观察。,B、转动粗调节器使载物台徐徐上升（或使镜筒渐渐下降），直至油镜头浸没至油中。此时眼睛应从侧面观察，以免压碎标本片和损坏镜头。,C、然后双眼移至接目镜，一面从接目镜观察，一面反方向缓慢地转动粗调节器（下降载物台，或上升镜筒），当出现模糊物象时，换用细调节器，转动至物象清晰为止。,D、观察完毕，应先提高镜筒，并将油镜头扭向一侧，再取下标本片。油镜头使用后，应立即用擦镜纸擦净镜头上的油。若镜油粘稠干结于镜头上，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，并随即用干的镜纸擦去残存的二甲苯，以免二甲苯渗入，溶解用以粘固透镜的胶质物，造成镜片移位或脱落。,7.镜头的擦拭：用专门的擦镜纸；擦镜头时，先将擦镜纸折叠几次，然后朝一个方向擦，不可来回擦或转动擦；如果镜头被油污污染，则可在擦镜纸上滴几滴二甲苯，然后按上述方法擦拭。8.显微镜的放大对象：是物体的长和宽，不是面积，更不是体积。9.显微镜的焦距问题：物镜离装片的远近，准焦螺旋的使用。,10.显微镜使用时物象移动方向：相反，即物象在视野何方，则装片即向该方向移动。,四、实验结果,名称 形态 大小,大肠杆菌 杆状 （0.51.0）m（15）m,五、注意事项,1.用显微镜观察微生物不清楚时，可对光圈（强大、弱小）、滤光片、聚光器进行调节。,2.细调时可先微微向一个方向调节，如果物像越变越清晰则继续朝原方向调节，反之逆向调节,六、思考题,使用油镜时，为什么先要用低倍镜观察？,实验二,培养基的制备,培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素,外,还应具有适宜的酸碱度,pH,值、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。,二、实验器材,(1),药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、,NaCl,、,10,NaOH,溶液、,l0,盐酸溶液、琼脂。,(2),器材：小烧杯、天平、牛角匙、,1000mL,刻度烧杯、玻棒、,pH,试纸、试管、分装漏斗、棉花、三角烧瓶,。,一、实验目的,学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤,三、方法与步骤,1,、牛肉膏蛋白胨培养基的配制,(1),培养基配方：,牛肉膏,5.0g,蛋白胨,10.0g,、,NaCl5.0g,、琼脂,20.0g,、自来水,1000mL,、,pH7.0,。,(2),操作步骤：,1,）称药品,按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。,2,）加热溶解,在烧杯中加入少于所需要的水量，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。,3,）调,pH,检测培养基的,pH,，若,pH,偏酸，可滴加,1,滴,10NaOH,，边加边搅拌，并随时用,pH,试纸检测，直至达到所需,pH,范围。若偏碱，则用,10,HCl,进行调节。,pH,的调节通常放在加琼脂之前。应注意,pH,值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。,4,）过滤,液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用,4,层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。,5,）分装,按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染,(,见,图,4,1),。,6,）加棉塞,试管口和三角瓶口塞上用普通棉花,(,非脱脂棉,),制作的棉塞，棉塞制作方法如,图,4,3,。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约,3,5,塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。,7,）包扎,加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。,8,）培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。培养基经灭菌后，必须放,37,温室培养,24h,，无菌生长者方可使用。,图 例,图,4,1,培养基分装,图,4,2,斜面制作,图,4,3,棉塞制作方法,四、注意事项,称药品用的牛角匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖。调,pH,时要小心操作，避免回调，不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。,五、问题和思考,1,培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌,?,若不能及时灭菌应如何处理？,2.已灭菌的培养基如何进行无菌检查？,3,牛肉膏蛋白胨培养基属何种培养基？,采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌。灭菌是要进行微生物纯培养的需要。,实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。高温主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比优于干热灭菌。湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，加速其变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。,实验三,消毒和灭菌,一、实验目的和内容,目的：了解消毒和灭菌的原理并掌握各种灭,菌方法的操作步骤。,内容：,1,高压蒸汽灭菌法。,2,干热灭菌法。,二、实验材料和用具,待灭菌的培养基、移液管、蒸馏水、培养皿、试管,高压蒸汽灭菌锅、电热烘箱,三、操作步骤,(,),高压蒸汽灭菌法,高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。,1,加水,将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为至。,2,装料,将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。,3,加盖,将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀；,4,排气,加热待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。一般认为，当水沸后约,5min,，表明锅内空气已排净。,5,升压,当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。,6,保压,当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源。开始计时并维持压力至所需时间。本实验用,121,，,20min,灭菌。,7,降压,达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀。放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。,8,无菌检查,将已灭菌培养基于,37,培养,24h,，无杂菌生长，即可待用。,(,二,),干热灭菌法,干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌；,1,装入待灭菌物品,预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放人电热烘箱中。,2,升温,关好电烘箱门，打开电源开关，旋动恒温调节器至所需温度刻度,(,本实验所需为,160,170,),，此时烘箱红灯亮，表明烘箱已开始加热，当温度上升至所设定温度后则烘箱绿灯亮，表示已停止加温。,3,恒温,当温度升到所需温度后，维持此温度,2h,。,4,降温,切断电源，自然降温。,5.,取出灭菌物品,待电烘箱内温度降到,70,以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。,四、注意事项,1,使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。,2,干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触以免包装纸烤焦起火。,五、问题和思考,1,比较各种灭菌方法的原理及适用范围。,2,高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖,?,微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。,无菌操作是微生物接种技术的关键。平板浇注、平板划线、斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。,由于接种方法不同，采用的接种工具也有区别，如平板划线和固体斜面培养体转接时用接种环；穿刺接种时用接种针，液体转接用移液管等。,实验四,微生物的接种技术,一、实验目的：,了解各种微生物接种方法。,掌握无菌操作和平板浇注法接种技术,二、实验材料和用具：,酒精灯、标签,、,无菌采样瓶、灭菌移液管、灭菌培养基、灭菌培养皿、灭菌试管,三、方法和步骤,(,一,)用无菌瓶,采集一定量环境水样,(,河水、污水、游泳池水或港湾水等,),，迅速带回实验室。,(,二,),吸取,1mL,水样注入盛有,9mL,无菌水的试管中，混匀成,10,-1,稀释液，注意在吸水样前，水样及稀释水应彻底搅动均匀。,(,三,),吸稀释液,1ml,按,10,倍稀释法稀释成,10,-2,、,10,-3,、,10,-4,、,10,-5,、,10,-6,等连续的稀释度。见教材图1313,(,四,),选取（,10,-4,、,10,-5,、,10,-6）,三个连续稀释度。吸取由高倍至低倍的稀释液，每个稀释液分别注入一个培养皿，每皿,1mL,。,(五),浇注平板接种（教材图1314）,左手持三角瓶,右手反转手掌用中指和无名指拨出棉塞,(或不翻转手掌用小指和手掌拨出棉塞),左手拿平皿，以大拇指和中指将皿盖打开一缝,三角瓶口经火焰烧灼迅速倾入,5560的培养基约15ml,盖好皿盖,置于桌上轻轻旋转平皿,冷凝后即为平板培养基,(,六,),接种水样的培养皿，倒置于,37,培养,24h,，培养到长出明显菌落。,四、结果与分析,画图分析菌落形态,取同一稀释度的平板培养物，依菌落计算原则进行计算。,五、问题和讨论,培养时，为什么要把已接种的培养基倒置保温培养？,(,一,),菌落计算原则,平皿菌落的计算可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，防止遗漏，也可借助于菌落计数器计数。对那些看来相似，并且长得相当接近，但并不相触的菌落，只要它们之间的距离至少相当于最小菌落的直径，便应该一予以计数。对链状菌落看来似乎是由于一团细菌在琼脂培养基和水样的混合中被崩解所致，应把这样的一条链当做一个菌落来计数，不可去数链上各个单的菌链。若同个稀释度中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿计数该稀释度的平均菌落数。若片状菌落少于平皿的一半时，而另半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的,2,倍作为全皿的数目。在记下各平皿菌落数后，应算出同一稀释度的平均菌数，供下步计算时用。,(,二,),计算方法,l,、首先选择平均菌落效在,30,300,者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可用它作为平均值乘其稀释倍数。,2,、若有两个稀释度的平均菌落数都在,30,300,之间，则应按两者的比值来决定。若其比值小于,2,，应报告两者的平均数；若大于,2,，则报告其中较小的数字,(,见表,13,6,例,2,和例,3),。,3,、如果所有稀释度的平均菌落数均大于,300,，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之,(,见表,13,6,例,4),。,4,、若所有稀释度的平均菌落数均小于,30,，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍,数报告之,(,见表,13,6,例,5),。,5,、如果全部稀释度的平均菌落数均不在,30,300,之间，则以最接近,300,或,30,的平均菌落数乘以稀释倍数报告之,(,见表,13,6,例,6),。,6,、菌落计数的报告，菌落在,100,以内时按实有数报告；大于,100,时，采用二位有效数字；在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数也可用,10,的指数来表示。在所需报告的菌落数多至无法计算时，应注明水样的稀释倍数。,菌落厚，有金黄色光泽呈圆形状，可断定为金黄色葡萄球菌,菌落边缘光滑，有点湿润、粘稠的圆形可断定为大肠杆菌,菌落边缘褶皱不规则、淡黄色可断定为枯草芽孢杆菌,菌落与菌苔,菌落,菌苔,实验五,细菌革兰氏染色,简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于对细菌细胞进行分类。,革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌,(G,),和革兰氏阴性菌,(G,),两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。,该染色法所以能将细菌分为,G,菌和,G,菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。,G,菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。,G,菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层脱水而孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。,一、实验目的和内容,目的：巩固无菌操作技求，掌握细菌及其结构的染色技术。,内容：学习革兰氏染色技术。,二、实验材料和用具,（1）,大肠杆菌（,E.coli,）菌液,（2）,革兰氏染色液,(,结晶紫染液、卢戈氏碘液、,95,乙醇、沙黄（番红）染色液等,),、,（3）,香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。,三、操作步骤,1,、制片,（,1,）,涂菌,滴一滴无菌水在载玻片中央，,用接种环以无菌操作方法从培养基上挑取少许菌种与玻片上水滴混匀后，在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约,1cm,的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。,（,2,）干燥,于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥,(,温度不宜过高,),。,（,3,）固定,目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片面向上，通过火焰,3,次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。,2,、染色,（,1,）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染,1min,后，用水洗去剩余染料。,（,2,）滴加卢戈氏碘液，,1min,后水洗：,（,3,）滴加,95,乙醇脱色，摇动玻片几下即倾去乙醇，重复23次至紫色不再后即水洗,(,根据涂片之厚薄需时,30s,至,1min),。,（,4,）复染,滴加沙黄（番红）染色液复染,1min,，水洗。,（,5,）用滤纸吸干，油镜镜检。,3,、结果,革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。,四、注意事项,1,载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌过厚。,2,在染色过程中，不可使染液干涸。,3,在革兰氏染色过程中脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌，另外，老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。,五、结果报告,绘图,大肠杆菌革兰氏染色视野图。,并进行结果分析。,六、问题和思考,1涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题?,2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？,3试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。,实验六,水中大肠杆菌群的测定,一、实验目的,了解总大肠菌群的检测方法。,了解总大肠菌群的数量指标在环境领域的重要性,二、材料与器皿,(,),培养基,1,、普通乳糖蛋白胨培养液,蛋白胨,10g,牛肉膏,3g,乳糖,5g,氯化钠,5g,1.6,溴甲酚紫乙醇液,1.0mL,蒸馏水,1000mL,pH 7.27.4,将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于,1000mL,蒸馏水中，调节,pH,为,7.27.4,，再加入,1.6,溴甲酚紫乙醇液,1.0mL,，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管,10mL,，,115,灭菌,20min,。,2,、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液,按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管5mL。,(,二,),灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、锥形瓶、棉塞,三、方法与步骤,(一),水样的采集,供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过,4,小时，在,0,4,下保存不应超过24小时，如不能在4小时内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。,（1）自来水取样：应在水龙头打开放水5分钟，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3Na,2,S,2,O,3,.5H,2,O溶液1mL。,江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。,（二）初发酵试验,水样稀释：制备水样,10,-1,、,10,-2,的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样,1mL,放于盛有,9mL,无菌水的试管中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为,10,-1,稀释液；再从,10,-1,制备,10,-2,稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。,（2）,接种和培养：以无菌操作分别吸取,1mL10,1,稀释,水样,和原水样,于,2,支,装有,10,mL的,普通浓度乳糖蛋白胨培养液（,接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡,）试管中，另取10,mL原水样于装有5mL,三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液试管中，再取100,mL原水样于装有50mL,三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液瓶中,，,小心混匀放入,37,培养箱中培养24小时后观察。,（,3,）,结果观察：,37,中培养,24h,后取出观察，观察有无气体（杜汉氏小管内有无气体）和酸产生（培养基有无变色）。在,48h,之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。,根据大肠杆菌群存在的阳性管数或瓶数查教材附录六表2，报告每升水样中的总大肠菌群数。,四、结果记录,记录阳性管数，查出水样中大肠菌群数。,在初发酵试验中，可能有极少数能发酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可疑反应管中，通过对初发酵中的阳性可疑管进行平板分离和复发酵试验，并进行革兰氏染色和细菌形态的观察，可将那些少量的非大肠菌群细菌,(,“假阳性管”,),删除去，故在记录时只能把三步试验都呈阳性的试管计入阳性反应管。,五、问题与思考,1.测定水中总大肠菌群数有什么实际意义？,2.,实验过程中有什么问题，你认为原因何在，如何克服？,实验安排,第十周周二开始，加上周四周五总共做3天，每天4节课。,实验顺序为：,周二 实验二、三、四,周四 实验一、五、六,周五 观看实验结果，打扫实验室卫生,实验安排,两个班分批做实验：1班上午，2班下午,上午要求8点正到实验室，下午2:30到,实验室地点：主教西裙楼2楼,每班分10小组，实验前学习委员将分组名单交给老师,记得带上10张报纸,实验报告,全部手写（写明班级、姓名、学号）,总共6个实验，报告内容包括,实验目的,实验仪器和器材,实验步骤,注意事项,实验结果,思考题,