第12专题-分子生物学技术在昆虫分类学中发展课件.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,江西农业大学农学院植保系,王建国,2013-11-03,分子生物学技术在昆虫分类学中的运用,唐觉教授,对日本臭蚁的鉴定,蚂蚁分类专家,浙江大学唐觉教授,来源：,geminata,电子显微镜,电子显微镜,和,扫描电子显微镜,的问世，使昆虫的形态学分类达到了超微结构水平。,五、分子生物学方法,目前，应用于昆虫系统演化及分类鉴定方面的分子生物学技术主要有：,RAPD,技术、,RFLP,方法、,DNA,序列,分析、分子,杂交,技术，,SSCP,方法及,DSCP,技术等。,PCR,技术,聚合酶链式反应技术,PCR,Polymerase chain reaction,1985年，,Kerry Mullis,发明了,DNA聚合酶链式反应PCR(Polymerase chain reaction)技术，目前这一技术在分子生物学领域获得了广泛的应用，已经在很大程度上代替了传统的DNA克隆方法。,利用PCR技术能够从复杂的DNA分子群体中选择性地复制一段特异的DNA序列，从而使某一DNA片段得到特异性的扩增；同时这一技术在昆虫学领域也得到了广泛的应用。,PCR技术常与RAPD技术结合应用，如Kambhampati等,(1992),应用,RAPD-PCR技术对蚊虫和蚜虫进行了分子系统学的研究。Paskewitz(1993)用PCR技术识别按蚊种类。此外，RFLP,、,RARDPCR,、,DNAfp等方法也应用在同翅目蚜科、蝉科和叶蝉科等昆虫的研究方面。直翅目蝗科、鞘翅目叶甲科、鳞翅目凤蝶科等方面也有类似研究。,1.RAPD标记技术,R,andom,A,mpifled,P,olymphic,D,NA,随机扩增多态性,DNA,。,RAPD是由williams等,1990年发明的一种遗传标记方法，其原理是用随机序列的910个核苷酸的引物，对基因组的,DNA进行PCR扩增，再进行电泳分离和溴化乙锭染色。多态性的产生由互补核苷酸引物的碱基差别形成。,RAPD要求对每个分离群体中的标记所进行的PCR扩增和电泳分离有高度的重复性，所以操作一般采用自动化。,目前，,RAPD已成为昆虫遗传图谱构建中的一种普遍方法。我国近年来已在果蝇、蚊虫、玉米螟、棉铃虫等昆虫研究中应用RAPD技术在DNA分子水平上进行了研究，取得了一些成绩。,RAPD技术一出现，就被用于蚊虫的分子系统学研究。孙珊、徐茂磊等应用RAPD方法对我国黑龙江、北京、陕西、浙江 云南和新疆等,6个地区的玉米螟种群进行了分析，并通过聚类分析为我国不同地区玉米螟的现代系统学研究提供了新的分类依据。吴厚永、赵彤言利用,RAPD技术从DNA分子水平探讨了尖音库蚊复合组,4个亚种的分化，结果表明，尖音库蚊是原始的类群，而致倦库蚊和淡色库蚊是最为进化的类群。,RAPD,标记技术,论文,1,论文,2,2.SCAR,技术,S,equence-,c,haracterized,A,mplified,R,egion,，,SCAR,特征序列扩增区域（,SCAR,）标记法,标记通常是由,RAPD,标记转化而来的。为了提高所找到的某一,RAPD,标记在应用上的稳定性，可将该,RAPD,标记片段从凝胶上回收并进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特异引物（,18-24,碱基左右）。也可只对该,RAPD,标记片段的末端进行测序，根据其末端序列，在原来,RAPD,所用的,10,碱基引物上增加相邻的,14,个左右碱基，成为与原,RAPD,片段末端互补的特异引物。以此特异引物对基因组,DNA,再进行,PCR,扩增，便可扩增出与克隆片段同样大小的特异带。这种经过转化的特异,DNA,分子标记称为,SCAR,标记。,SCAR,标记一般表现为扩增片段的有无，为一种显性标记；但有时也表现为长度的多态性，为共显性的标记。若待检,DNA,间的差异表现为扩增片段的有无，可直接在,PCR,反应管中加入溴化乙锭，通过在紫外灯下观察有无荧光来判断有无扩增产物，从而检测,DNA,间的差异，这样可省去电泳的步骤，使检测变得方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体。相对于,RAPD,标记，,SCAR,标记由于所用引物较长及引物序列与模板,DNA,完全互补，因此，可在严谨条件下进行扩增，结果稳定性好、可重复性强。随着研究工作的发展，会有越来越多重要作物农艺性状的,SCAR,标记被开发出来，它们将在分子标记辅助育种方面发挥巨大作用。,3.RFLP技术,R,estriction,F,ragrnem,L,ength,P,olymorphism,限制性片段长度多态,RFLP,是由于不同个体的等位基因之问碱基代换、重排、插人、缺失等引起的。,限制性内切酶,能把很大的,DNA,分子降解成许多较小片段，所产生的,DNA,片段的数目和长度又反映了限制性内切酶的切割位点在,DNA,分子上的分布。对于每一个,DNA,限制性内切酶组合来说，它产生的片段是特异性的，因而它能够作为含有这种,DNA,的生物所特有的,“,指纹,finger print,”,DNA,指纹,(DNAfp),。,当一个基因组比较小时，就可以将提纯的,DNA用限制内切酶消化成各种不同长度的DNA片段，进行琼脂糖凝胶电泳分离并用溴化乙锭染色后，可以在紫外灯下直接观察多态性，但对于大分子DNA来说各种片段在电泳胶上连成一片，相互重叠，根本无法进行分辨，因此不能直接观察限制性片段长度的多态性。要检测大分子DNA的RFLP,，就要借助分子杂交技术，用某一标记的,DNA片段作为探针，与电泳后的DNA片段进行杂交，这样，与探针片段有高度同源性的DNA片段就可以被检测出来。,目前典型的,RFLP,研究都选择,mtDNA,进行。龙漫远,(1993),报道了选择,mtDNA,进行,RFLP,研究获得,DNA,限制性内切酶图谱以及片段长度多态性等的分析方法。赵惠燕等在同翅目昆虫的分类方面也应用了同样的分析方法。对于昆虫来说，目前大多数,mtDNA,的限制性片段长度多态性研究都是在种内或近缘种间进行，而科、属等高级阶元问的分析较少。,Chapco(1994),用同样的方法研究了,l1,种蝗虫之间的演化关系。乔传令等,(1996),对库蚊,(Culex pipiens),的限制性内切酶片段长度多态性,(RFLP),进行了研究，结果表明不同地理种群都有相同的单基因扩增，但在扩增水平上有较大差异。,应用,RFLP,分析方法，使传统的昆虫分类区系及系统进化研究获得了新的发展和飞跃，解决了一些用传统分类方法无法解决的难题,4.AFLP,技术,A,mplified,F,ragment,L,ength,P,olymorphism,扩增片段长度多态性,一项新的分子标记技术，是基于,PCR,技术扩增基因组,DNA,限制性片段，基因组,DNA,先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到,DNA,片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了,RFLP,和,PCR,技术特点，具有,RFLP,技术的可靠性和,PCR,技术的高效性。由于,AFLP,扩增可使某一品种出现特定的,DNA,谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及,DNA,扩增后得到的,DNA,多态性可做为一种分子标记。,AFLP,可在一次单个反应中检测到大量的片段。以说,AFLP,技术是一种新的而且有很大功能的,DNA,指纹技术,5.SSCP,技术,Single-Strand Conformation Polymor-phism,，,SSCP,单链构象多态性,检测是一种基于,DNA,构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链,DNA,，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。,单链,DNA,片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链,DNA,分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同,.,因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,(PAGE),，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开,.,作者称该方法为单链构象多态性,(Single-Strand Conformation Polymor-phism,，,SSCP),分析,.,基本原理，都是依据,DNA,分子在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，其迁移率除与,DNA,的长短有关外，更主要的是取决于,DNA,链所形成的构象,6.DSCP,技术,D,ouble-,S,trand,C,onformational,P,olymorphism,双链构象多态性分析,DSCP,技术在昆虫分类上的应用不多在国内未见有相关报道。,Sequence and Sequencing,包括DNA的序列分析和RNA的序列分析。,7.核酸序列分析技术,在种内或近缘种的系统发育关系确定方面，通常用进化较快的,mtDNA,核苷酸片段，对于科、属等高级阶元的系统发育研究中，通常用进化较慢的,rDNA,和,rRNA,核苷酸片段。,现在许多昆虫特别是双翅目的果蝇、膜翅目的蜜蜂、直翅目的飞蝗等的,mtDNA,的序列已经很清楚了，由于,rRNA,在昆虫中分布广泛，易于分离，且,rRNA,属于慢速进化的基因，因此对不同昆虫,rRNA,的序列分析可以广泛地应用到科、属等高级阶元的系统发育研究。,近年来，核酸序列分析方法与,PCR及RFLP技术相结合，在昆虫系统发育研究方面取得了一定成就。,Chapco(1994)应用按酸序列分析方法对直翅目l1种蝗虫的进化关系进行了研究。,曹功杰,(1988)对7种昆虫的5,SrRNA结构特点进行了比较研究。,通过测定,DNA,，,RNA,的核苷酸顺序，对昆虫进行分类并构建其系统发育关系，有望在重要的农、林、医学昆虫鉴定上发挥作用。当前核酸测序技术与,RAP,PCR,及,RFLP,相结合的综合分析方法，既快速又准确，是今后昆虫分子系统学研究的重要方向。,8.DNA,条码技术,DNA barcoding,9.,探针杂交技术,Probe,探针,核酸分子杂交即具有一定同源性的,DNA单链分子或DNA单链分子与RNA分子，其互补的区段在去掉变性条件后能够复性形成双链DNA分子或DNA,RNA异质双链分子。,核酸的分子杂交技术有不同的形式和方法，包括,Southern分子杂交技术,、,Northern分子,杂交技术和,原位杂交,技术。,应用核酸分子杂交技术检测昆虫的遗传多态性、,DNA同源性及mRNA 的差异，进行昆虫近缘种和地理种群鉴别是当前昆虫系统学研究中常用的分子生物技术。,如Conins(1987)用DNA探针杂交鉴定按蚊属近缘种类。,牛玲玲,(1992)将,DNA探针用于中华按蚊和嗜人按蚊的分类研究。,可以预见，未来对重要农、林、医学昆虫基因文库或,cDNA文库中的目的基因可以利用核酸分子杂交技术来筛选获得。,10.,生物芯片技术,Bio-chip,Gene-chip,基因芯片,Mirco-array,寡核苷酸微阵列,组织芯片,