生物统计与实验设计3常用分子生物学技术.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节,凝胶电泳技术,一、电泳的原理,将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。,在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，,DNA,和,RNA,实际上呈多聚阴离子状态（,Polyanions,）。将,DNA,、,RNA,放到电场中，它就会由负极,正极移动。,常用固体支持介质,琼脂糖（,agarose）,和聚丙烯酰胺（,polyarylamide）,都属于固体支持介质，使用支持介质的目的是防止电泳过程中的对流和扩散，使得被分离的成分得到最大的分辨率。这些固体支持介质可以形成复杂的网孔结构，,DNA,要穿过这些网孔才能到达正极，因此分子量小，结构致密的,DNA,分子就更容易穿过这些网孔，泳动的速度也越快。,凝胶类型及浓度 分离,DNA,片段的大小范围,0.3%琼脂糖 50000,1000,0.7%琼脂糖 20000,1000,1.4%琼脂糖 6000,300,4%聚丙烯酰胺 1000,100,10%聚丙烯酰胺 500,25,20%聚丙烯酰胺 50,1,琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶分辨,DNA,片段的能力,二、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，它的分子结构大部分是由,1,3,联接的,-,吡喃半乳糖，,1,，,4,联接的,3,，,6,脱水,-D,吡喃半乳糖交替而成的，其结构为：,第二节,探针技术,探针（,probe）：,用来探知被测物存在的小分子,DNA,或,RNA。,标记物：探针上结合的易被检测的化合物。,分子杂交（,molecular hybridization）：,探针,DNA,或,RNA,与被测物的互补结合叫分子杂交。,探针,核酸探针：,DNA、RNA,非核酸探针：酶、蛋白质等,一、核酸探针,双链,DNA,探针,DNA,探针,DNA,探针,核酸探针 单链,DNA,探针,cDNA,探针,RNA,探针 单链,RNA,探针,放射性标记探针 均匀标记探针,探针标记,非放射性标记探针 非均匀的末端标记探针,核酸探针的类型和称谓常有以下几种：,1.,双链,DNA,探针,切口平移法,利用了,DNaseI,和,DNA,聚合酶,I,的5 3 聚合酶活性和5 3,外切酶活性。产生均匀标记的探针。,随机引物合成法,原理：随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与,DNA,模板结合,，,在,Klenow,酶的作用下,，,合成与模板互补的,DNA,探针。,优点是：,(1),Klenow,片段没有,53,外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。,(2),反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒,DNA,模板也可进行反应。,(3),反应产物的比活性较高,可达,410,9,cpm/g,探针。,(4),随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。,2.,单链,DNA,探针,从,M13,载体衍生序列合成单链,DNA,探针,双链探针的缺点：易形成自身无效杂交。,-,32,P-dNTP,限制性酶切割,电泳分离,从,RNA,合成单链,cDNA,探针,方法：,用寡聚,dT,为引物合成,cDNA,探针。,本方法只能用于带,Poly(A),的,mRNA,，,并且产生的探针极大多数偏向于,mRNA 3,末端序列。,可用随机引物合成,cDNA,探针。,该法可避免上述缺点，产生比活性较高的探针。但由于模板,RNA,中通常含有多种不同的,RNA,分子，所得探针的序列，往往比以克隆,DNA,为模板所得的探针复杂得多，应预先尽量富集,mRNA,中的目的序列。,反转录得到的产物,RNA/DNA,杂交双链经碱变性后，,RNA,单链可被迅速地降解成小片段，经,Sephadex G-50,柱层析即可得到单链探针。,3、,寡核苷酸探针,若只知道待分离的目的基因的蛋白质编码产物，而对其核苷酸序列一无所知，即可设计合成寡核苷酸探针。,种类,单一已知序列的寡核苷酸探针,许多兼并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库,存在困难：,（1）所合成的寡核苷酸探针必须严格地只能同目的基因的,cDNA,序列互补。所以一般得掌握一段由6个连续排列的氨基酸组成的蛋白质序列的数据。,（2）遗传密码的兼并性问题。,因此，根据蛋白质序列所合成的寡核苷酸探针，通常是混合物形式。,4、RNA,探针,RNA,探针的优点：,许多载体如,pBluescript,，,pGEM,等均带有来自噬菌体,SP6,或,E.coli,噬菌体,T7,或,T3,的启动子，它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于,DNA,的,RNA,聚合酶所识别，合成特异性的,RNA,。,（1）稳定性高，杂交信号强。,（2）,RNA/RNA,杂交体用,RNaseA,酶切较用,S1,酶切,DNA/RNA,杂交体容易控制。,（3）产量高。,（4）用无,RNA,酶的,DNA,酶处理即可去除模板。,（5）启动子特异性高，故在异常位点起始,RNA,合成比率很低。,二、非核苷酸探针,被检测对象：蛋白质，可视为抗原。,抗原,完全抗原：具有免疫原性和反应原性。,半抗原：无免疫原性，有反应原性。,方法：,ELISA,图,探针：可视为抗体。,三、探针的标记,筛选探针的考虑因素：,（,1,）标记前后探针的结构、理化性质、,Tm,值等不变。,（,2,）检测灵敏度高。,（,3,）安全、无污染。,（,4,）经济,1,、放射性标记,主要用等放射性同位素标记核苷酸。,2,、非放射性标记,主要有生物素、酶类、荧光素，它们可使一些化合物生成有色物质，通过检测颜色反应来判断抗原的有无。,例：地高辛标记探针检出原理,第三节 核酸分子杂交技术,核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（,Cavnegie Institute of Washington）,的,Roy Britten,及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链,DNA,或,RNA，,当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。,步骤：,（1）将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程称为核酸印迹。,（2）将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的,DNA,或,RNA,探针杂交。故有时也称印迹杂交。,一、,Southern,DNA,印迹杂交,根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的,DNA,片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链,DNA,或,RNA,探针的杂交作用检测这些被转移的,DNA,片段，这种实验方法叫做,DNA,印迹杂交技术。由于它是由,E.Southern,于1975年首先设计出来的，故又叫,Southern DNA,印迹转移技术。,步骤,：,（,1,）,DNA,片段的转移。将电泳后的琼脂糖凝胶,先作碱变性处理,，经中和处理后凉干备用。然后将处理好的凝胶放到,Southern,转膜装置中，其装置如下（见图）：在一个装有缓冲液的磁盘中放一个玻璃架，铺,Whatman,滤纸一张，务使滤纸两端浸入缓冲液冲。变性的凝胶平铺在滤纸上，在凝胶上面盖上一张硝酸纤维素滤膜，再加一叠干滤纸，最后再压上一重物。由于上面干滤纸的吸引作用，下面的缓冲液就会通过滤纸的毛细管上升，造成由下到上的液体流，凝胶中的单链,DNA,便会随着缓冲液一起转移。一旦,DNA,分子接触到硝酶纤维素滤膜，就会牢牢地吸附而固定在上面。转移结束后将硝酶纤维素滤膜夹在两层滤纸中间,80,下烘干,1,2,小时。,（2）分子杂交,（,a）,（,b）,（,c）,（,d）,（,e）,基因组,DNA,DNA,限制片段,硝酸纤维素滤膜,同探针同源杂交的基因,DNA,片段,X,光底片,Southern,凝胶转移杂交技术,Southern DNA,印迹杂交之,X,光显像图片,水稻（,Oryza sativa L,.),的叶绿体,DNA,分别用核酸内切限制酶,Bgl,(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、,和,Hind（J-L）,消化，加样在含有,EtBr,染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同,32,P,标记的玉米,psbA,探针作,Southern,杂交。,X,光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的,psbA,基因序列。,二、,Southern,RNA,印迹技术（,Northern Northern blotting）,1979,年，,J.C.Alwine,等人发展而来，是将,RNA,分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩,DNA,印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩,RNA,印迹技术（,Northern blotting）。,而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,，,然后同放射性同位素,125,I,标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（,Western blotting）。,三、菌落杂交,检测重组体克隆的菌落杂交技术,四、,ELISA,ELISA,的方法程序是,：,将某一基因产物（抗原，从供体中提取、纯化），制成抗原制剂抗原制剂注射到免疫动物（鸡、鸭、兔、羊等，兔子最好）体内36周复注射，加强免疫7-10天后提取动物血液，分离出血清，叫抗血清（经免疫后，有抗体，主要是,球蛋白，的动物血清）纯化,球蛋白，即一抗与有关酶偶联制备酶标一抗。若需要时，要制备酶标二抗，方法同一抗。,第四节,PCR,技术,一、,PCR,技术的原理,（1）高温变性，,双链,DNA,变性（,90,95,）成为单链,DNA；,PCR,步骤：,（2）低温退火（,37-60,），引物与单链,DNA,互补序列结合；,（3）,适温延伸，,DNA,聚合酶催化（,70-75,）使引物延伸。,其原理是：以,DNA,的一条链为模板，在有,RNA,引物、,4,种脱氧核苷酸（,dNTP,）,时，和,DNA,聚合酶的条件下，在引物所结合的位置向,3,方向合成新的互补链。其反应以双链,DNA,的变性、退火、延伸为一个循环。经过多次循环（,25-30,次），便目标,DNA,片段得以大量扩增。由于每一次循环所产生的新链均可成为新的模板用于下一轮循环，故,PCR,产物以指数方式增加。,(,c),(,b),引物2,5,3,3,3,5,5,(,d),新引物,5,3,靶,DNA,的扩增,(,a),5,3,引物1,3,5,3,5,引物2互补链,引物1互补链,单位长度的链,不同长度的链,5,3,3,5,引物1互补链,引物2互补链,目的片段（不同长度的链未示出）,聚合酶链式反应示意图,(,e),(,f),(,g),温度（,）,时间（,min）,94,72,60,94,变性（1,min）,60,退火（1,min）,72,延伸,（1.5,min）,循环1 循环2 循环3,PCR,反应的温度循环周期,PCR,反应的每一个温度循环周期都是由,DNA,变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94变性1,min，60,退火1,min，72,延伸1.5,min。,如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。,Reaction Condition for a Typical PCR Assay,Typical PCR Thermal Profile,*,This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any“unfinished”product from previous amplification to achieve its full length,Characteristics of Taq Polymerase,二、,PCR,反应中的几种成分,1、,Taq DNA,聚合酶,1976,年，,Chien.A,从一种生活在温度高达,75,的热泉的细菌（即栖热水生菌，,Thermus Aquaticus,）,中分离纯化出了一种耐高温的,DNA,聚合酶，现命名为,Taq,DNA,聚合酶。这种酶经,95,持续温育仍有活性，因此在,DNA,变性加热的温度下不会失活，故无需在每轮反应中补加新酶。,TaqDNA,聚合酶与,Klenow,大片段相比，缺少,3,5,的外切核酸功能，但具有,5,3,的外切核酸酶功能，故,Taq,酶缺少校对活性。,2、关于,PCR,引物,Rappolee,指出引物设计需要根据以下原则：,（1）引物应是,DNA,序列的一段高保守区；,（2）引物3端的保守序列很重要，并要求非简并性密码，密码的第三个碱基不应摇摆；,（3）引物3端不能互补，不能具有反转重复序列，避免形成引物二聚体；,（4）引物的设计应避免形成二级结构；,（5）避免引物中,G/C,和,A/T,富聚区的不平衡分布，但允许有,OligodT,和,polydC；,（6）,引物是特异性的，不能与其它基因的序列同源；,（7）根据实验设计要求可以在引物5端进行特殊设计，即加入几个碱基以便在扩增产物中创造一个限制性酶切位点，或一个,GC box,，,或一个启动子。较长的引物-模板杂合体的,Tm,值较高，因此在,PCR,的最初几次循环之后需要适当增加融合温度；,（,8,）为了进行未知序列的扩增，需要对引物进行特殊设计。,3、,用于,PCR,扩增的模板,4,、用于,PCR,扩增的,dNTP,单链、双链,DNA,以及通过逆转录的,cDNA,都可以作为,PCR,反应的模板。无论哪种,DNA,，,都要具有较高的纯度。模板,DNA,的用量，依,DNA,的性质而定。,PCR,扩增使用的,dNTP,的浓度一般为,50,200,mol/L,。,对于典型的,PCR,扩增反应，一般要求四种,dNTP,的浓度相等。,用于,PCR,的标准缓冲液中含有：,50,mmol/LKCL,、,10mmol/L TrisCl,（,pH8.3,，,于室温,),和,1.5,mmol/L MgCl,2,。,其中,Mg,2+,对,PCR,反应的成败起着关键作用。镁离子的最佳作用浓度相当低（,1.5,mmol/L,）。,5、用于,PCR,的缓冲液,PCR,反应管中往往要加入适当的灭菌矿物油，以防止反应液在高温下的蒸发并减少污染。但矿物油的用量一定要适当，太少起不到应有的作用，太多又会降低热循环效率，一般是在100,ul,反应体积中加70,ul，50ul,体积加40,ul，25ul,反应体积加30,ul。,6、矿物油,7、,循环次数,分析性,PCR,的最适循环次数是,25,35,次，即使微量的,PCR,产物也能用琼脂糖凝胶电泳检测，而制备性,PCR,是循环次数不能超过,40,次。循环次数太多是不利的，会使非特异性扩增产物增加。,第五节,DNA,序列测定,一、,Sanger,双脱氧链终止法,这种方法利用,DNA,聚合酶的两个性质：,（1）在有单链模板、引物，带有,3,-,OH,末端的引物，,4,种,dNTP,存在时，,DNA,聚合酶能够以单链,DNA,作为模板，按照碱基互补配对原则，不断将,dNTP,加到引物,3,-,OH,末端，合成出与单链模板互补的新链。,（2）,DNA,聚合酶还可以,ddNTP,（,2,3,-,双脱氧核苷酸）作为底物，使之掺入到正在延伸的,DNA,链中，但是由于,ddNTP,缺少,3,-,OH,，,无法和下一个核苷酸之间形成,3,，,5,-,磷酸二酯键，所以在,ddNTP,掺入的位置，链延长终止。,脱氧核苷三磷酸（,dNTP,）,和双脱氧核苷三磷酸（,ddNTP,）,的分子结构式,Sanger,双脱氧链终止,DNA,序列分析法原理,C T G A C T T C G A C A A,T G T T,ddATP，dNTP,C T G A C T T C G A C A A,G C T G T T,C T G A C T T C G A C A A,A G C T G T T,C T G A C T T C G A C A A,C T G A A G C T G T T,A,A,A,A,（1）,（2）,（3）,二、,Maxam-Gilbert DNA,化学降解法,表17-1,Maxam-Gilbert,法所用的化学修饰技术,碱基,特异修饰方法,G,在,pH8.0,下，用硫酸二甲酯对,N,7,进行甲基化，使,C,8,C,9,键对碱裂解具有特异的敏感性,A+G,在,pH2.0,下，哌啶甲酸可以使嘌呤环的,N,原子质子化，从而导致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键,C+T,肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去,C,在1.5,mol/LNaCl,存在下，只有胞嘧啶可同肼发生明显可见的反应,A+C,在90下，用1.2,mol/LNaOH,处理，可使,A,位点发生剧烈的断裂反应，而,C,位点的断裂反应较微弱,（一）原理,化学法是对一个末端标记的,DNA,片段，用化学试剂在,A,、,G,、C、,T,处特定地裂解,DNA,片段。把反应分为四组，每一组反应特异性地针对某一种或某一类碱基，并且要保证每个,DNA,分子平均只有一个靶碱基被修饰，这样，在每一组反应中虽然都在同一个或两个核苷酸处,DNA,链发生断裂，但由于碱基位置不同，就会产生一组不同长度的,DNA,片段。最后，经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影后就可读出待测,DNA,的核苷酸序列。,（二）步骤,（,1）首先用一个限制性酶消化待测,DNA,片段，得到长度为100200,bp,的一组片段。,（2）用碱性磷酸酶处理，这些,DNA,片段，使其脱去5磷酸。,（3）通过多核苷酸激酶的催化作用，将,r,32,PNTP,的放射性磷酸转移到,DNA,片段的5端，给,DNA,片段5末端作上放射性标记。,（,4,）将标记的双链,DNA,变性成单链。,（,5,）对特定碱基进行化学修饰。,A C T T C G A C A A,A C T T C G A C A A,C A A,C G A C A A,C T T C G A C A A,C A A,C G A C A A,C T T C G A C A A,T C G A C A A,T T C G A C A A,3,6,9,3,6,9,7,8,C,C+T,C,C+T,3,6,9,三、,DNA,大片段的连续测序,四、,DNA,序列分析的自动化,随机引物,测出的序列,作为下一次引物,二轮测出的序列,设计为二轮引物,第六节,寡核苷酸片段固相合成,寡核苷酸片段的固相合成有两种基本方法，一种叫做磷酸三酯法，另一种叫做亚磷酸三酯法。这两种方法的步骤基本相同，都是将活化了的核苷酸在存在特定偶联试剂的条件下依次同与固相载体相连的核苷,5,羟基产生偶联反应，从而在参加的两核苷酸之间形成磷酸三酯键。磷酸三酯法主要包括：偶联反应，封闭反应，去,5,端保护基反应。而亚磷酸三酯法除了上述几个步骤外，还有一个氧化反应，即使亚磷酸三酯键转变为磷酸三酯键。现在，磷酸三酯法已不再使用，在,DNA,自动合成仪上使用的均是亚磷酸三酯法。,一、用于寡核苷酸化学合成的单体,寡核苷酸化学合成中所用的单体为亚磷酰胺，可分为两种类型：甲基化的亚磷酰胺和,-,氰乙基,-,亚磷酰胺。,二、寡核苷酸片段合成的步骤,1,脱三苯甲氧基作用。,2,偶联反应。,3,闭封反应。,4,氧化反应。,DNA,片段的合成就是上述四个反应循环进行，直至合成出所需长度的寡核苷酸片段为止。,DNA,片段的化学合成是,3,5,方向进行。当合成反应终止后，需将脱氧核苷酸上的保护基团去除，并将合成的寡核苷酸链从固相载体上释放出来，然后，用乙醇沉淀法纯化这些寡核苷酸，再用高效液相色谱法或凝胶电泳法使之进一步纯化，并同未完成全段合成的较短片段分开，最后得到真正需要的产物。,第七节 分子标记技术,遗传标记主要有4种类型，即形态标记、细胞学标记，生化标记和分子标记,。,形态标记是以生物的外部特征，如：株高、穗长、粒色、花色、粒重等宏观性状作为遗传研究的标志。,最初的细胞学标记主要是指染色体的核型，后来又发展出了染色体显带技术。,生化标记主要指同工酶。,广义的分子标记是指可遗传并可检测的特异,DNA,序列、,RNA,或蛋白质。狭义的分子标记仅指,DNA,或,RNA,标记。,一、,RFLP,标记,1,、原理,RFLP,指应用特定的核酸内切酶切割有关的,DNA,分子所产生的,DNA,片段在长度上的变化。,细胞内,DNA,量通常用绝对量（,Pg,）或碱基对（,bp,）数目表示，也常用千碱基对（,Kb,）或万碱基对（,Mb,）表示。,1Pg=0.96510,9,bp=6.110,11,dalton=29cM,生物能快速、精确地复制自身的,DNA,，但这种精确性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量的,DNA,序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几乎不可能有两个生物体,DNA,的碱基序列是相同的。,限制性内切酶酶解,DNA,长链，是识别,DNA,上的特异的位点并在这些位点上切断的过程。酶识别位点碱基对越少，,DNA,分子中被识别的位点越多，所产生的限制片段越短。,来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源,DNA,分子，都会在同样的位点被准确切割。但是在不同物种、不同品种、甚至同一品种的不同的两个个体之间，,DNA,会发生变异，其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制片段长度的多态性。,用限制性酶来酶解植物核,DNA,会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。进行,Southern,印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的,DNA,杂交，经过放射自显影就能检测到高等植物核,DNA,的,RFLP,。,0.1kb,0.2kb,0.4kb,0.5kb,0.3kb,0.4kb,0.5kb,(1),(2),0.2kb,0.3kb,0.5kb,品系,1,品系,2,0.4kb,0.1kb,+,3,、,RFLP,的方法与步骤,（,1,）,DNA,的分离,（,2,）酶切,（,3,）琼脂糖凝胶电泳,（,4,）,Southern,印迹转移,（,5,）,DNA,杂交及放射自显影,可用,CTAB,法或,SDS,法。,一般根据基因组总,DNA,的复杂性选用限制酶。,二、,RAPD,技术,1990,年，由美国杜邦公司的科学家,Williams,推出。,与,RFLP,相比的优越之处：检测效率高、样品用量少、灵敏度高等。,缺点：,（,1,）由于采用的引物的,Tm,值较低，扩增结果易受外界因素的影响，实验的重复性差。,（,2,）,RAPD,为显性标记，不能提供完整的遗传信息。,（一）,RAPD,的基本概念和原理,RAPD,的引物,:,（,1,）为随机引物，,（,2,）序列较短（通常为,10,个核苷酸）,（,3,）为一个寡核苷酸单链引物,RAPD,方法是在,PCR,技术基础上发展起来的，它利用一系列单个随机引物（通常为,10,个核苷酸），对所研究的基因组,DNA,进行,PCR,扩增，引物与基因组,DNA,某一区段互补时，就与其结合，就可对引物下游,DNA,进行合成，即扩增。,0.2kb,0.5kb,0.3kb,0.2kb,0.5kb,0.3kb,0.2kb,0.3kb,0.5kb,品系,1,品系,2,(,三,)RAPD,的基本实验程序,1,、,DNA,的提取,（,1,）碱法 （,2,）,CTAB,法 （,3,）,SDS,法,2,、模板,DNA,浓度和质量的检测,3,、,PCR,扩增,4,、电泳检测：,PCR,结束后每个样品加,4ul,凝胶上样缓冲液，每个泳道点样,20ul,。,5,、将凝胶浸于,1ug/ml,的,EB,中,30min60min,，用水清洗约,10min,。,6,、观察、拍照。,三、,AFLP,AFLP,技术是,1992,年由荷兰,Keygene,公司的科学家,Zabeau Mare,和,Vos Pieter,发明并发展起来的一种选择扩增限制酶切片段的方法。,（一）,AFLP,的基本原理,其,原理,是选择性地扩增基因组,DNA,限制性酶切片段。植物基因组,DNA,经限制性内切酶消化形成相对分子量大小不等的随机限制性酶切片段，随后将特定的接头连接在这些,DNA,片段两端，接头序列和邻近限制性酶切位点作为引物进行,PCR,扩增，最后通过,PAGE,分离扩增的特异限制性片段。在不需要,DNA,序列的情况下，利用一套特定引物可在一次单个反应中检测到大量的片段。,AFLP,引物是一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度为,1820,个核苷酸。引物主要由,3,部分组成：,（,1,）核心序列（,CORE,），该序列与人工接头互补；,（,2,）限制性内切酶识别特异序列（,ENZ,）；,（,3,）选择性延伸序列（,EXT,），即引物,3,端的选择碱基，选择碱基延伸到,酶切片段区,。,如：,EcoRI,引物和,MseI,引物,CORE,ENZ,EXT,EcoRI 5 -GACTGCGTACC AATTC NNN-3,MseI 5 -GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3,四、,SSR,技术,真核生物基因组中散布着大量的小卫星,DNA,和微卫星,DNA,，小卫星,DNA,由串联重复的短序列组成，它的重复单位一般在十几到几十,bp,，一个小卫星,DNA,的总长度达几十到几千个,bp,不等。微卫星,DNA,由更短的重复单位串联而成，重复长度一般为,26bp,，一个,SSR,总长度可达几十到几百,bp,。许多小卫星和微卫星间的不等交换或复制过程中的,DNA,滑动而高度可变，因而显示出了丰富的限制性片段多态性。正因为真核生物中富含简单重复序列，而重复序列两端往往是相对保守的限制酶位点，所以通过特异引物进行,PCR,扩增反应、琼脂糖凝胶电泳和放射自显影，就可检测到简单重复序列单位数不同的,DNA,区域多态性,。,五、,mRNA,差异显示反转录,PCR,技术,mRNA,差异显示原理,：,是通过比较两个来源不同的材料的,mRNA,来确定差别显示的原因，并可进一步分离出差异的基因。其方法是：人工合成两组引物，对细胞中约,15000,种转录的,mRNA,进行,cDNA,扩增，并显示出它们的电泳条带，不同材料的电泳条带比较，就可发现差异的基因。,5,AGAAAAAAA3 5GTAAAAAAA3,5CGAAAAAAA3 5TTAAAAAAA3,5GGAAAAAAA3 5ACAAAAAAA3,5TGAAAAAAA3 5CCAAAAAAA3,5ATAAAAAAA3 5GCAAAAAAA3,5,CTAAAAAAA3,5,TCAAAAAAA3,在第一条,cDNA,合成时所加入的含有,Oligo(dT)n,的寡核苷酸引物，是根据,mRNA,分子3端序列结构而设计的。,mRNA,分子3端的,poly(A),序列起点碱基之前的2个碱基，除了,AA,组合外，只可能有如下12种可能的排列组合：,根据这种序列结构特征，,Pliang,等人设计合成了共12种不同的下游引物，称之为,3端锚定引物,（,anchor primer,Anp.），,它由11或12个脱氧胸苷酸（,T）,加上两个3端锚定脱氧核苷酸组成。可用通式5,T11MN,或5,T12MN,来表示。其中,M,为除了,T,以外的任何一种核苷酸（即,A、G,或,C），,而,N,则为任何一种核苷酸（即,A、T、C、G）。,因为某一特定细胞类型或发育阶段的,mRNA,总的含量相当低。因此我们还必须通过,PCR，,才能使,cDNA,在量上得以扩增。因此，需要再加入一种随机引物，使之与,mRNA（cDNA）5,端结合，对两个引物间的,cDNA,序列扩增。如果5 端引物在,mRNA（cDNA）,上的识别位点距,poly（A）,尾在23,kb,范围内，则任一,cDNA,可通过,PCR,而扩增，,5-gatcggaccctt-mnAAAAAAAA,5mnTTTTTTTTTT,5-ctagcctgggaa-mnAAAAAAAA3 cDNA,5-,_ _ _,_ _,_ _ _,_ _,