生物奥赛培训细胞增殖与调控课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,细胞的增殖与调控,有丝分裂：,细胞周期的概述（识记）,分裂间期（理解）,有丝分裂过程,（理解）,减数分裂：,减数分裂过程,（理解）,减数分裂和有丝分裂的区别,（理解,）,减数分裂的发生时间,（识记）,减数分裂丰富基因组合,（识记）,细胞增殖是生命的基本特征，种族的繁衍、个体的发育、机体的修复等都离不开细胞增殖。一个受精卵发育为初生婴儿，细胞数目增至,10,12,个，长至成年有,10,14,个，而成人体内每秒钟仍有数百万新细胞产生，以补偿血细胞、小肠粘膜细胞和上皮细胞的衰老和死亡。细胞增殖是通过细胞周期（,cell cycle,）来实现的，而细胞周期的有序运行是通过相关基因的严格监视和调控来保证的。细胞无限制增长对个体来说意味着癌症，个体无限制繁殖对地球来说意味着灾难。,细胞增殖与调控,细胞增殖的意义,细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一，是生命繁育的基础。,单细胞生物细胞增殖导致生物个体数量的增加。,多细胞生物由一个单细胞（受精卵）分裂发育而来，细胞增殖是多细胞生物繁殖的基础。,成体生物仍然需要细胞增殖，主要取代衰老死亡的细胞，维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能。,机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等，都要依赖细胞增殖。,第一节 细胞周期与细胞分裂,一、细胞周期,概述：,细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程（也称细胞生活周期，或细胞繁殖周期），可分为四个阶段：,G,1,期,(gap1),，指从有丝分裂完成到期,DNA,复制之前的间隙时间；,S,期,(synthesis phase),，指,DNA,复制的时期，只有在这一时期,H,3,-TDR,才能掺入新合成的,DNA,中；,G,2,期,(gap2),，指,DNA,复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；,M,期又称,D,期,(mitosis or division),，细胞分裂开始到结束。,G,0,期,：细胞暂时离开细胞周期，停止分裂，去执行一定的功能，称静止期细胞，G,0,期多发生在,G,1,期。G,0,期一旦得到信号，会迅速返回细胞周期（如结缔组织中的成纤维细胞等）。,细胞周期,细胞周期分为4个阶段,S期,：,DNA合成，在真核生物立即与组蛋白结合，形成核小体。,G,2,期,：,合成大量蛋白质,和RNA分子，为细胞进入M期做准备。,能否进入M期，受G,2,期检验点的控制。,M期,：,细胞分裂,期，真核细胞的分裂主要有有丝分裂和减数分裂。,细胞周期长短测定：,细胞周期的时间长短与细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为,10,小时，人类胃上皮细胞,24,小时，骨髓细胞,18,小时，培养的人成纤维细胞,18,小时，,CHO,细胞,14,小时，,HeLa,细胞,21,小时。不同类型细胞的,G,1,长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。,1、脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法,H3-TdR标记，洗涤，培养，定时取样，放射自显影分析,BrdU标记，抗体染色观察,2、流式细胞分选仪检测法,根据DNA含量分类细胞，根据类群细胞的数量推断时间。,细胞周期各阶段的时间,(,细胞周期测定,),T,G2,G2期时间，T,M,M期时间，T,S,S期时间，T,C,细胞,周期时间，T,G1,T,C,（T,G2,T,M,T,S,）,流式细胞仪检测细胞周期,细胞周期的时间,细胞同步化：,细胞同步化,(synchronization),是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化，前者称自然同步化，后者称为人工同步化。,1、自然同步化,多核体,：,如粘菌只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。数量众多的核处于同一细胞质中，进行同步化分裂，使细胞核达,10,8,，体积达,69cm,。,某些水生动物的受精卵,：如海胆卵可以同时授精，最初的,3,次细胞分裂是同步的，再如大量海参卵受精后，前,9,次细胞分裂都是同步化进行的。,增殖抑制解除后的同步分裂,：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。,2、人工同步化,选择同步化,：,有丝分裂选择法,：使单层培养的细胞处于对数增殖期，此时分裂活跃。有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低，此时轻轻振荡，,M,期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，则可获得一定数量的中期细胞。其优点是，操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害，缺点是获得的细胞数量较少。（分裂细胞约占,1%,2%,）,细胞沉降分离法,：不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，因此可用离心的方法分离。其优点是可用于任何悬浮培养的细胞，缺点是同步化程度较低。,诱导同步化,DNA,合成阴断法,：选用,DNA,合成的抑制剂，可逆地抑制,DNA,合成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细胞群阻断在,S,期或,G/S,交界处。,5-,氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度,ADR,、,GDR,和,TDR,，均可抑制,DNA,合成使细胞同步化。其中高浓度,TDR,对,S,期细胞的毒性较小，因此常用,TDR,双,阻断法诱导细胞同步化。优点是同步化程度高，适用于任何培养体系。可将几乎所有的细胞同步化。缺点是产生非均衡生长，个别细胞体积增大。,中期阻断法,：利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较少。优点是无非均衡生长现象，缺点是可逆性较差。,TdR阻断法进行细胞同步化,特异的细胞周期,1、早期胚胎细胞周期,（受精卵的卵裂过程）：,G1和G2非常短，细胞体积不增加，或增加很少。,芽殖酵母细胞周期,裂殖酵母细胞周期,2、酵母细胞周期：,60-90分钟，核内有丝分裂。,特点：持续时间短，封闭式细胞分裂，即细胞分裂时核膜不解聚；纺锤体位于细胞核内。,3、植物细胞分裂,：,无中心体，但可以正常装配纺锤体；,以,形成细胞板,的形式进行胞质分裂,。,4，细菌的细胞周期,：,环状分子，一个复制起始点。,DNA复制前准备（G1）约10分钟；DNA复制（S）约40分钟；分裂前准备（G2）约20分钟；一个周期70分钟。实际上分裂和复制同时进行，一个周期只需35分钟。,细胞分裂的类型,细胞分裂,(cell division),可分为,无丝分裂,(amitosis),、,有丝分裂,(mitosis),和,减数分裂,(meiosis),三种类型。,无丝分裂又称为直接分裂，由,R.Remark,（,1841,）首次发现于鸡胚血细胞。表现为细胞核伸长，从中部缢缩，然后细胞质分裂，其间不涉及纺锤体形成及染色体变化，故称为无丝分裂。发现于原核生物和很多高等动植物，如植物的胚乳细胞、动物的胎膜，间充组织及肌肉细胞等等。,二、有丝分裂,有丝分裂，又称为间接分裂，由,W.Fleming(1882),年发现于动物及,E.Strasburger,（,1880,）年发现于植物。特点是有纺锤体和染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于高等动植物。,有丝分裂过程是一个连续的过程，为了便于描述人为地划分为六个时期：间期（,interphase,）、前期,(prophase),、,前中期,(premetaphase),、中期,(metaphase),、后期,(anaphase),和末期,(telophase),。其中，间期包括,G,1,期、,S,期和,G,2,期，主要进行,DNA,复制等准备工作。,前期两个中心体向两级移动,中期的光镜和电镜,前中期和中期,后期姊妹染色体分离,末期,细胞有丝分裂周期,细胞分裂周期,（一）有丝分裂过程,1，前期,标志前期开始的第一个特征是染色质开始浓缩形成有丝分裂染色体；第二个特征是细胞骨架解聚，有丝分裂纺锤体开始装配，分裂极确立。,最显著的特征是染色质通过螺旋化和折叠，变短变粗，形成光学显微镜下可以分辨的染色体，每条染色体包含,2,个染色单体。,前期末，染色体主缢痕部位形成一种蛋白复合物称为动粒（kinetochore）。,间期动物细胞含一个MTOC，即中心体，在S期末，两个中心粒在各自垂直的方向复制出一个中心粒，形成两个中心体。当前期开始时，2个中心体移向细胞两极，并同时组织微管生长，,当核膜解体时，两对中心粒已到达两极，,两极形成的微管通过微管结合蛋白在正极末端相连，最后形成有丝分裂纺锤体。,2，前中期,指由核膜解体到染色体排列到赤道面(equatorial plane)这一阶段。,核膜破裂成小的膜泡，这一过程是由核纤层蛋白中特异的Ser残基磷酸化导致核纤层解体。,纺锤体微管与染色体的动粒结合，捕捉住染色体，每个已复制的染色体有两个动粒，朝相反方向，保证与两极的微管结合；纺锤体微管捕捉住染色体后形成三种类型的微管：,着丝点处的分子马达使染色体向微管的负端移动。在光镜下可以看到，此时染色体也就是既向一极移动也向另一极移动，是以振荡的方式移向纺锤体中部的。其原因是姊妹染色单体的着丝点都结合有微管和分子马达。,不断运到的染色体开始移向赤道板，细胞周期也由前中期逐渐向中期运转。,着丝点,（动粒）,微管,（kinetochore mt）：由中心体发出，连接在着丝点上，负责将染色体牵引到纺锤体上，着丝点上具有马达蛋白。,星体微管,（,astral mt,）：由中心体向外放射出，末端结合有分子马达，负责两极的分离，同时确定纺锤体纵轴的方向。,极微管,（,polar mt,或,overlap mt,）：由中心体发出，在纺锤体中部重叠，重叠部位结合有分子马达，负责将两极推开。,有两类马达蛋白参与染色体和分裂极的分离，一类是动力蛋白（,dynein,）,，另一类是驱动蛋白（,kinesin,）,。,植物没有中心粒和星体，其纺锤体叫作无星纺锤体，分裂极的确定机理尚不明确。,3，中期,指从染色体排列到赤道面上，到姊妹染色单体开始分向两极的一段时间。,是什么机制确保染色体正确排列在赤道板上？动粒微管动态平衡形成的张力,4，后期,指姊妹染色单体分开并移向两极的时期，当子染色体到达两极后，标志这一时期结束,。后期大致可分为连续的两个阶段：,后期,A,，指染色体向两极移动的过程。这是因为染色体着丝点微管在着丝点处去组装而缩短，在分子马达的作用下染色体向两极移动，体外实验证明即使在不存在,ATP,的情况下，染色体着丝点也有连接到正在去组装的微管上的能力，使染色体发生移动。,后期,B,，指两极间距离拉大的过程。这是因为一方面极体微管延长，结合在极体微管重叠部分的马达蛋白提供动力，推动两极分离；另一方面星体微管去组装而缩短，结合在星体微管正极的马达蛋白牵引两极距离加大。可见染色体的分离是在微管与分子马达的共同作用下实现的,。,后期,A,，,B,是用药物鉴定出来的，如紫杉酚（,taxol,）能结合在微管的,(+),端，抑制微管,(+),端去组装，从而抑制后期,A,。动物中通常先发生后期,A,，再后期,B,，但也有些只发生后期,A,，还有的后期,A,、,B,同时发生。植物细胞没有后期,B,。,5，末期,末期是从子染色体到达两极，至形成两个新细胞为止的时期。末期涉及子核的形成和胞质分裂两个方面。,子核的形成,：,末期子核的形成，大体经历了与前期相反的过程，即染色体解聚缩，核仁出现和核膜重新形成。核仁由染色体上的核仁组织中心形成（,NORs,），几个,NOR,S,共同组成一个大的核仁，因此核仁的数目通常比,NORs,的数目要少。,前期核膜解体后，核纤层蛋白,B,与核膜残余小泡结合，末期核纤层蛋白,B,去磷酸化，介导核膜的重新装配。,胞质分裂：,虽然核分裂与胞质分裂（,cytokinesis,）是相继发生的，但属于两个分离的过程，例如大多数昆虫的卵，核可进行多次分裂而无胞质分裂，某些藻类的多核细胞可长达数尺，以后胞质才分裂形成单核细胞。,动物细胞的胞质分裂是以形成收缩环的方式完成的，收缩环在后期形成，由大量平行排列的肌动蛋白和结合在上面的,myosin II,等成分组成。,植物胞质分裂的机制不同于动物，其后期的纺锤体中央出现成膜体,(phragmoplast),。末期近两极处微管消失，中间微管保留，并数量增加，其中不断加入囊状物和电子密度高的物质，微管运送小泡，小泡不断融合扩大形成一片连续的质膜，细胞板,(cell plate),将细胞一分为二，最后在细胞板两侧积累多糖，形成细胞壁。,植物细胞分裂和成膜体的形成,（二）与有丝分裂直接相关的亚细胞结构,1、中心体：,与微管装配和细胞分裂密切相关，有一对位于细胞中央的中心粒和周围的无定型物质构成。两个中心粒相互成直角，每一个成圆筒状，直径0.2,m，圆筒壁由9组三联管构成，分,和,微管蛋白，圆筒的周围有,蛋白等。中心体连同四射的微管构成“星体”。,中心体G1期末开始复制，S期结束，G2期开始分开并向两级移动。,中心体和纺锤体,细胞分裂的中心体循环,2、动粒与着丝粒：,动粒（着丝点）是附在着丝粒上的结构，每条中期染色体上有两个动粒，分别位于着丝粒的两侧，分裂时进入子细胞，S期时动粒复制。电镜下，动粒为园盘状的结构，分内、中、外三层。动粒和着丝粒结构和功能联系紧密，常被称为着丝粒动粒复合体。,已有几种动粒蛋白被分离，包括CENP-A,B,C,E,F等。着丝粒DNA主要由a卫星DNA构成，常深入到动粒的内层。染色体依靠动粒捕捉纺锤体极体微管。,着丝粒和动粒,3、纺锤体,与染色体的分离直接相关，主要由微管和微管蛋白组成，两端为星体。动粒微管连接动粒和中心体，极性微管的一端游离，从两级发出的极性微管常在赤道处搭桥。,中心体装配涉及中心体周围微管的装配和中心体分离，中心体分离需要移动素类蛋白(kinesin related proteins KRPs)和细胞质动力蛋白(dynein)的作用。前者负责微管向正极移动，后者负责微管向负极移动。负向运动的蛋白先负责搭桥，将被结合的微管牵拉在一起，正向运动蛋白将纺锤体拉长。,有丝分裂过程中纺锤体和染色体的运动,纺锤体装配过程,（三）染色体运动的动力机制,1、染色体排队,（整列）,有数种蛋白与染色体的排队有关，包括Mad和Rub，他们可使动粒敏感化，便于微管与动粒接触。动粒被微管捕捉后如何排列在赤道板上有两种解释，即,牵拉假说,和,外推假说。,2、染色体分离,后期A：微管在动粒端解聚，动粒微管变短，是由于动粒蛋白沿微管向极部运动的结果。,后期B：极性微管蛋白聚合，微管拉长。,染色体列队,Mad 蛋白和Bub蛋白使动粒敏感化，使动粒与微管接触,有丝分裂后动粒沿动粒微管向极部运动,细胞分裂后纺锤体拉长,马达蛋白和微管蛋白共同协作，使染色体分离,动物细胞的胞质收缩环,三、减数分裂,减数分裂（,Meiosis,）的特点是,DNA,复制一次，而细胞连续分裂两次，形成单倍体的精子和卵子，通过受精作用又恢复二倍体，减数分裂过程中同源染色体间发生交换，使配子的遗传多样化，增加了后代的适应性。,减数分裂可分为,3,种主要类型：,配子减数分裂,（,gametic meiosis,），也叫终端减数分裂,(terminal meiosis),，其特点是减数分裂和配子的发生紧密联系在一起，在雄性脊椎动物中，一个精母细胞经过减数分裂形成,4,个精细胞，后者在经过一系列的变态发育，形成成熟的精子。在雌性脊椎动物中，一个卵母细胞经过减数分裂形成,1,个卵细胞和,2-3,个极体。,孢子减数分裂,（,sporic meiosis,），也叫中间减数分裂,(intermediate meiosis),，见于植物和某些藻类。其特点是减数分裂和配子发生没有直接的关系，减数分裂的结果是形成单倍体的配子体（小孢子和大孢子）。小孢子再经过两次有次分裂形成包含一个营养核和两个雄配子（精子）的成熟花粉（雄配子体），大孢子经过三次有丝分裂形成胚囊（雌配子体），内含一个卵核、两个极核、,3,个反足细胞和两个助细胞。,合子减数分裂,（,zygotic meiosis,），也叫初始减数分裂,(initial meiosis),仅见于真菌和某些原核生物，减数分裂发生于合子形成之后，形成单倍体的孢子，孢子通过有丝分裂产生新的单倍体后代。,减数分裂由紧密连接的两次分裂构成。通常减数分裂,I,分离的是同源染色体，所以称为异型分裂或减数分裂。减数分裂,II,分离的是姊妹染色体，类似于有丝分裂，所以称为同型分裂或均等分裂。和有丝分裂一样为了描述方便将减数分裂分为几个期和亚期。,（一）间期,有丝分裂细胞在进入减数分裂之前要经过一个较长的间期，称前减数分裂间期,(premeiotic interphase),或前减数分裂期,(premeiosis),。前减数分裂期也可分为,G,1,期、,S,期和,G,2,期，在,G,1,期和,S,期把麝香百合的花粉每细胞在体外培养，则发现细胞进行有丝分裂，将,G,2,晚期的细胞在体外培养则向减数分裂进行，说明,G,2,期,是有丝分裂向减数分裂转化的关键时期。,（二）减数分裂,过程,1,、前期,I,减数分裂的特殊过程主要发生在前期,I,，通常人为划分为,5,个时期：,细线期（,leptotene,）、,偶线,期（,zygotene,）、,粗线期（,pachytene,）、,双线期（,diplotene,）、,浓缩期（,终变期,）,（,diakinesis,）。这,5,个阶段本身是连续的，之间没有截然的界限。,1,）,细线期,（凝集期）,:,染色体呈细线状，具有念珠状的染色粒。持续时间最长，占减数分裂周期的,40%,。细线期虽然染色体已经复制，但光镜下分辨不出两条染色单体。由于染色体细线交织在一起，偏向核的一方，所以又称为凝线期,(synizesis),，在有些物种中表现为染色体细线一端在核膜的一侧集中，另一端放射状伸出，形似花束，称为花束期。,2,）,偶,线期：持续时间较长，占有丝分裂周期的,20%,。亦称,合线,期，是同源染色体配对的时期，这种配对称为联会,(synapsis),。这一时期同源染色体间形成联会复合体,(synaptonemal complex,，,SC),。在光镜下可以看到两条结合在一起的染色体，称为二价体（,bivalent,）。每一对同源染色体都经过复制，含四个染色单体，所以又称为四分体。,偶线期还合成zygDNA（0.3%）,3),粗线期：持续时间长达数天，此时染色体变短，结合紧密，在光镜下只在局部可以区分同源染色体，这一时期同源染色体的非姊妹染色单体之间发生交换的时期。在果蝇粗线期,SC,上具有与,SC,宽度相近的电子致密球状小体，称为重组节，与,DNA,的重组有关。,4,）,双线期：联会的同源染色体相互排斥、开始分离，但在交叉点,(chiasma),上还保持着联系。双线期染色体进一步缩短，在电镜下已看不到联会复合体。交叉的数目和位置在每个二价体上并非是固定的，而随着时间推移，向端部移动，这种移动现象称为端化,(terminalization),，端化过程一直进行到中期。,5,）,浓缩期,：二价体显著变短，并向核周边移动，在核内均匀散开，由于交叉端化过程的进一步发展，交叉数目减少，通常只有一至二个交叉。,浓缩期,二价体的形状表现出多样性,如V形、O形等。,核仁此时开始消失，核被膜解体。,减数分裂过程中染色体变化示意图,细线期,粗线期,偶线期,浓缩期,双线期,2,、中期,I,核仁消失，核被膜解体，标志进入中期,I,，中期,I,的主要特点是染色体排列在赤道面上。每个二价体有,4,个着丝粒、姊妹染色单位的着丝粒定向于纺锤体的同一极，故称联合定向,(co-orientation),。,3,、后期,I,二价体中的两条同源染色体分开，分别向两极移动。由于相互分离的是同源染色体，所以染色体数目减半。但每个子细胞的,DNA,含量仍为,2C,。同源染色体随机分向两极，使母本和父本染色体重新组合，产生基因组的变异。如人类染色体是,23,对，染色体组合的方式有,2,23,个（不包括交换），因此除同卵孪生外，几乎不可能得到遗传上等同的后代。,4,、末期,I,染色体到达两极后，解旋为细丝状、核膜重建、核仁形成，同时进行胞质分裂。,5,、减数分裂间期,在减数分裂,I,和,II,之间的间期很短，不进行,DNA,的合成，有些生物没有间期，而由末期,I,直接转为前期,II,。,6、减数分裂,II,可分为前、中、后、末四个四期，与有丝分裂相似。通过减数分裂一个精母细胞形成,4,个精子。而一个卵母细胞形成一个卵子及,2-3,个极体。,精子和卵细胞形成过程中的减数分裂,黑圆角蝉的精子发生,减数分裂模式图,染色体交换、基因重组,（三）联会复合体,联会复合体（,synaptonemal complex,SC),是减数分裂合线期两条同源染色体之间形成的一种结构，于1963年由Moses发现，后来证明它与染色体的配对，交换和分离密切相关。,SC,是同源染色体间形成的梯子样的结构。在电镜下观察，两侧是约,40nm,的侧生组分,(lateral element),，电子密度很高，两侧之间为宽约,100nm,的中间区,(intermediate space),，在电镜下是明亮区，在中间区的中央为中央组分,(central element),，宽约,30nm,。侧生组分与中央组分之间有横向排列的粗约,710nm,的,SC,纤维，使,SC,外观呈梯子状。,长期以来人们认为,SC,将同源染色体组织在一起，使伸入,SC,的,DNA,之间产生重组，但实验证明不仅,SC,的形成晚于基因重组的启动，而且基因突变不能形成,SC,的酵母中，同源染色体间照样可以发生交换。现在一般认为它与同源染色体间交换的完成有关。,在磷钨酸染色的,SC,中央，还可以看到呈圆形或椭圆形的重组节,(recombination nodules,RNs),，是同源染色体发生交叉的部位，有基因交换所需要的酶。,从形态学来看，,SC,形成于合线期，成熟于粗线期，并存在数天，消失于双线期。联会复合体的形成与合线期,DNA(Zyg-DNA),有关，在细线期或合线期加入,DNA,合成抑制剂，则抑制,SC,的形成。,a.,Electron micrograph of SC of human pachytene bivalent.(K:kinetochore;arrow:recombination nodules);,b.,Schematic diagram of SC;,c.,Electron micrograph of SC after treatment with DNase to remove chromasomal fibers.,联会复合体,非同源,染色体的,自由组合,组合方式（或产生的配子种类）,=,2,n,（,n,为同源染色体的对数）,如果染色体是三对而不是两对，那么将会产生多少种不同类型的配子？,增加了配子的多样性，从而产生遗传性变异,但一次只能实现2种,非同源,染色体的,自由组合,交,叉,互,换,A A a a,请思考,：,交换发生的时期？交换是在什么之间的进行了互换？,交,叉,互,换,A A a a,交,叉,互,换,A A a a,交,叉,互,换,A A a a,交,叉,互,换,A A a a,交,叉,互,换,A a A a,交,叉,互,换,A a A a,你认为在形成配子的过程中，交换有何影响？,交,叉,互,换,交叉互换使分裂产生,的四个子细胞所含的,遗传物质各不相同,A a A a,一、细胞周期调控系统的主要作用,在适当时候激活细胞周期各个时相的相关激酶和某种蛋白，确保细胞周期向下一个阶段进行，然后以某种方式失活（正调控）,当细胞周期中出现异常时，细胞会启动一系列的负调控机制，使细胞停止在某个特定的时期，这种调节机制可确保每一时相时间的全部完成。,外界环境因子（如多细胞生物对增殖信号的反应）通过酪氨酸蛋白激酶受体偶联的信号通路完成信号向细胞内的传递。,第二节 细胞周期调控,细胞周期的运行，是在一系列称为,检验点,（,check point,）的严格检控下进行的，当,DNA,发生损伤，复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。细胞周期检验点由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器构成，主要检验点包括：,G,1,/S,检验点,:,在酵母中称,start,点，在哺乳动物中称,R,点,(restriction point),，控制细胞由静止状态的,G,1,进入,DNA,合成期，相关的事件包括：,DNA,是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？,S,期检验点：,DNA,复制是否完成？,G,2,/M,检验点：,是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：,DNA,是否损伤？细胞体积是否足够大？,中,-,后期检验点,（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制,APC,的活性，引起细胞周期中断。,第二节 细胞周期调控,二,、MPF的发现及其作用,MPF,（卵细胞促成熟因子，matuation-promoting factor；细胞促分裂因子，mitosis-promoting factor；M期促进因子，M-phase-promoting factor）。,Johnson,和,Rao(1970),将,Hela,细胞同步于不同阶段，然后与,M,期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与,M,期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的,早熟凝集染色体,(prematurely condensed chromosome,，,PCC),。,G,1,期,PCC,为单线状，因,DNA,未复制；,S,期,PCC,为粉末状，因,DNA,由多个部位开始复制；,G,2,期,PCC,为双线染色体，说明,DNA,复制已完成。,注射实验表明：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，含有卵母细胞成熟的因子，称做MPF,人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC：提示M期细胞存在诱导PCC的因子；,不同形态的PCC,不仅同类,M,期细胞可以诱导,PCC,，不同类的,M,期细胞也可以诱导,PCC,产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着,M,期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子,(maturation promoting factor，MPF),。,早在,1960s，Yoshio Masui,发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂,(Germinal Vesicle Breakdown，GVBD),，后来,Sunkara,将不同时期,Hela,细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现,G,1,和,S,期的抽取物不能诱导,GVBD,，而,G,2,和,M,期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子,(MF),。后来在,CHO,细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的,MF,。这类物质被统称为,MPF,。,1988,年Maller实验室从非洲爪蟾卵中纯化出MPF，证明主要含p32和p45两种蛋白，表现出激酶活性。,三,、P34,cdc2,激酶的发现及其与MPF的关系,1960s,L.Hartwell,以芽殖酵母为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个与细胞分裂有关的基因,(cell division cycle gene,，,CDC),，如芽殖酵母的,cdc28,基因，在,G2/M,转换点发挥重要的功能。,Hartwell,还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了,checkpoint,（细胞周期检验点）的概念，意指当,DNA,受到损伤时，细胞周期会停下来。,以,P.Nurse,为代表的另一批酵母生物学家研究不同温度下培养的裂殖酵母细胞，也分离出数十种温度敏感的突变体。这些不同的突变体在限定温度下，会滞留在细胞周期的某个阶段。这些与细胞分裂和周期调控有关的基因被称为cdc(cell division cycle)基因，根据被发现的先后顺序被命名。,cdc2是第一个被分离出来的cdc基因，表达34kDa的蛋白，称p34,cdc2,。进一步研究发现其具有激酶活性，可以使许多蛋白磷酸化，在裂殖酵母的周期调控中起重要作用。芽殖酵母中的一个关键cdc基因是cdc28，是第二个被分离出来的cdc基因，编码34kDa的蛋白，具有激酶活性。,p34,cdc28,是,p34,cdc2,的同原物,，调控细胞周期，特别是G2/M期转变。但研究者很快发现，p34,cdc28,或p34,cdc2,单独并不具有激酶活性，需要同相关蛋白结合后才具有活性（如p34,cdc2,和蛋白p56,cdc13,结合）。,之后，,J.Maller和P.Nurse,实验室立即合作，很快证明爪蟾卵中的p32与p34,cdc2,是同原物。与此同时，,T.Hunt,实验室等以海胆卵为材料研究细胞周期调控，发现一类与细胞分裂有关的蛋白，称为周期蛋白(cyclin)。然后,J.Maller和T.Hunt,实验室合作，发现周期蛋白B，证明与p45和p56,cdc13,为同原物。,比较这几个实验得出的结论,MPF的p32亚基与酵母菌中的p34,cdc2,为同源产物，而MPF中的P45与p56,cdc13,和周期蛋白B是同源物。,p32=p34,cdc2,=CDK（催化亚基）,MPF,P45=cyclin=p56,cdc13,（调节亚基）,MPF是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶，由M期Cyclin-CDK形成的复合物,MPF的活化与功能,与MPF活化相关的因素：,随Cycilin浓度变化而变化,激酶与磷酸酶的调节,活化的MPF可使更多的MPF活化,Cyclin的降解,CDK激酶抑制蛋白的作用,功能：启动细胞从G2期进入M期的相关事件,细胞周期运转的阻遏,CDK抑制蛋白（CDI）阻止Cyclin-CDK复合物的装配或活性，而将细胞阻止在不同的检验点：如DNA受损后，细胞将停留在G1检验点让DNA修复或者凋亡,周期调控系统组分停止合成：如G0期细胞，大部分Cyclin和CDK都消失，这在多细胞生物尤其明显。,四,、周期蛋白,自发现周期蛋白后，在不长的时间里有数十种周期蛋白被克隆和分离。如酵母的Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6，在脊椎动物的,A,1-2,、,B,1-3,、,C,、,D,1-3,、,E,1-2,、,F,、,G,、,H,等。各类周期蛋白均含有一段约,100,个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与,CDK,结合，不同的周期蛋白框识别不同的CDK,组成不同的周期蛋白复合体，表现不同的CDK激酶活性。,M期周期蛋白分子的近N端含有一段9个氨基酸组成的破坏框，参与泛素介导的周期蛋白A和B的降解。G1期周期蛋白分子的C端含有一段特殊的PEST序列，可能与G1期周期蛋白的更新有关。,周期蛋白分子结构特征,不同周期蛋白的表达时期不同，与不同的CDK结合，调节不同CDK激酶的活性。,部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积累及其与CDK激酶活性的关系。,周期蛋白激酶,五、细胞周期转运调控,周期蛋白激酶的活性,失活的磷酸激酶,细胞内的因素控制细胞周期：,尚未与纺锤体微管连接的动粒的信号促进APC失活，延迟末期。,生长因子促进细胞分裂：,一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。存在于血小板和各种成体与胚胎组织及大多数培养细胞中，对不同种类细胞具有一定的专一性。通常培养细胞的生长需要多种生长因子顺序的协调作用，肿瘤细胞具有不依赖生长因子的自主性生长的特点。PDGF,细胞周期调控示意图,细胞周期中4个主要的检验点,其它内外因素对细胞周期的调控,P21cip1抑制CDK和PCNA,DNA损伤抑制细胞周期的G1,丝裂原刺激细胞分裂,生长因子的作用机理,DNA损伤抑制细胞周期的G1,丝裂原刺激细胞分裂的示意图,生长因子的作用机理,