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第三章 层析概论
一、层析
以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。
目前，这种方法已作为纯化或鉴定各种化合物的一种重要手段。
1903年俄国植物学家茨维特首先将碳酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物色素溶液倾入，让其通过碳酸钙柱，接着用石油醚洗涤发现，各种色层彼此可分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，这就是早期的吸附层析
碳酸钙细粉
植物色素溶液
石油醚洗涤
二、层析类型
层析方法可根据不同的标准分成若干类型：
按流动相分类：液相层析和气相层析；
按固定相“床”的形式分类：柱层析、薄板(层)层析、薄膜层析等等，详见表3~1。
三、层析常用术语
1．固定相
固定相是由层析基质组成的。
其基质包括：固体物质(如吸附剂、离子
交换剂)
液体物质(如固定在纤维素
或硅胶上的溶液)，

这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。
2．流动相
在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。

在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液)。

在薄层层析时，流动相又称展层剂。
3．操作容量
即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量；

一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。(mmol/g, mg/g, mmol/ml, mg/ml)

其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。
4．床体积(Vt)
通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。
Vt是基质的外水体积(V0)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和，即:
Vt = V0+ Vi + Vg

(详见图3-1)
5．外水体积(V0)
外水体积指基质颗粒之间体积的总和。
6．内水体积(Vi)
内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。
7．基质体积(Vg)
基质体积是指基质自身所具有的体积。
V0、Vi 、 Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。
8．洗脱体积(Ve)
洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。用Ve表示(见图3-7中OB)。
9．膨胀度
在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积用Vβ表示。即每克溶胀基质所具有的床体积。

Vβ = Vt / g

一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。
10．分配系数和迁移率
1）分配系数(K)
是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示。
K=Cs/Cm
影响因素：被分离物本身的性质
固定相和流动相的性质
层析柱的温度
InK=-△G0/RT
△G0：标准自由能变化一般情况下为负值
R：气体常数
T：热力学温度
T与K成反比，T上升20摄氏度，K下降一半，导致组分移动速率增加。
因此：层析时最好采用恒温柱
对于K值相近的不同物质，可改变温度他，增大K值之间的差异，从而分离。
2）迁移率:
是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值，常用Rf（≥1）表示。

K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小； 反之则结合力小，迁移率大。

不同物质的分配系数和迁移率是不一样的。
几种物质之间的分配系数或迁移率,其差异程度越大，分离效果就越好。
溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示, Rf= a/b.
a：溶质在固定相移动的距离;
b：流动相移动的距离;
Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比.
影响因素:物质的结构和极性, 滤纸, 层析所用的溶剂,pH值,温度,展开方式,样品溶液中杂质.
四、层析的基本原理

五、层析柱的制备与层析操作
柱层析的设备主要有：
层析柱
部分收集器
磁力搅拌器
恒流泵
检测仪
详见图3-4
1．层析柱
绝多数层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。
柱的直径与长度之比，一般为1：10～1：40。

采用极细颗粒吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。
反之，则宜用比例小的层析柱。
这样有利于节省时间和提高分辨率。
2．吸附剂的用量
根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。

当操作容量高时，吸附剂用量少。
一般吸附剂的用量为被分离样品的30--50倍。
若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于100倍。
3．装柱
装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。
装柱后，层析柱中基质应符合如下标准：
填装均匀、松紧一致、没有气泡

装柱的方法分干装法和湿装法两种：
干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒人溶剂，此法不易将气泡排尽。
而湿装法系先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾人柱中(见图3-5)，待其自然沉降至柱高的1／4—1／3时打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。
吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生。后一种装柱法对各种基质都适用。
装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在约50cm高的操作压下(见第五章)，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。
4．上样和洗脱
当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。
待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面的高度约5cm计)，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始洗脱(见图3-6)。
同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。
随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定
5.绘制出洗脱曲线
根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线
(以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标)。
理想的洗脱曲线如图3-7所示。
图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。
层析峰的面积(EFG)、峰高(BE)和半峰高的宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。
6．吸附剂的再生
用过的吸附剂，经适当方法处理后，又恢复其性能的过程称吸附剂的再生。

一般不同吸附剂(或基质)的再生方法是不同的。详细操作参阅各章基质的处理方法及有关文献。
六、应用与实例
1．应用
（1）纯化生命物质
使用吸附剂的柱层析或分批吸附法(见实例1)可纯化生命物质。
如用羟基磷灰石吸附剂能把酸性、中性和碱性蛋白质分开，也能把不同结构的核酸分开(见图3-8)。
用该吸附剂分离含不同磷酸基团的蛋白质和脂类等化合物也是有效的。
（2）分离蛋白质的亚基
一般蛋白质经SDS(十二烷基硫酸钠)或Triton X-100(聚氧乙基十六烷基酚醚)等去污剂处理后，会产生分子质量不同的蛋白质亚基。
这些物质可通过吸附柱层析方法得到分离(见图3-9)。
（3）浓缩溶液
有些稀的溶液经层析柱处理后，浓度可大幅度提高。
例如，Tiselius把200ml稀的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液上HA层析柱，收集到的洗脱液仅有几毫升，其浓度提高数十倍。
2．实例
用HA层析柱分离胞质型多角体病毒双链RNA
90μg胞质B型多角体病毒(CPV)双链RNA
混合样品 2μg枯草杆菌(Bacillus subtilis)3H-双链DNA
2μg枯草杆菌14C-双链DNA
上5mm直径的层析柱(内装140mgHTP，用前预先加热的)。
用磷酸梯度缓冲液洗脱，其流量为30ml／h，以0．5ml／管进行收集。
每管收集液经紫外分光光度仪和液闪仪的测定分析，根据得到的数据即可绘制出分离示意图(见图3-10)。
从图看出，双链RNA是在低磷酸盐缓冲液中先被洗出，而双链DNA则后被洗出。
第二节 薄层层析
薄层层析(thin layer chromatography，TLC)：
是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
其基本原理和柱层析、纸层析比较相近。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
薄层层析可根据固定相的种类分为：
吸附薄层层析(固定相:吸附剂)
分配薄层层析(固定相:固定在支持剂上的水
溶液或有机溶剂)
离子交换薄层层析(固定相:离子交换剂)
等

层析原理
吸附薄层层、分配薄层层析、离子交换薄层层析
分别与吸附柱层析、分配层析、反相层析和离子交换层析相似。
薄层层析有以下优点：
1．展层时间短，薄层层析分离混合物一般仅需15-60min；
2．设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备；
3．温度变化和溶剂饱和程度对Rf值（迁移率）影响较小；
4．可使用腐蚀性显色剂(用淀粉作黏合剂和葡聚糖凝胶作固定相的薄板除外)；
5．灵敏度高。
主要是用于鉴定小分子物质和制备少量样品。
各种展层装置示意图
薄层层析图谱
第三节 聚酰胺薄膜层析
聚酰胺薄膜层析是1966年之后发展起来的一种层析方法。
它可用于酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸碱基、核苷、核苷酸、杂环化合物、合成染料、磺胺、抗菌素、环酮、杀虫剂和维生素B等16类化合物的分析。
一、基本原理
聚酰胺对极性物质的吸附作用是： 由于它(羰基或氨基）能和被分离物（羟基或氧原子）之间形成氢键。
如:
酚类(包括黄体酮、鞣酸等)和酸类是以羟基与聚酰胺的羰基形成氢键。
硝基化合物和醌类则是以氧原子与聚酰胺的形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
展层剂使分离物在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的连续过程，就能导致分离物达到分离目的。
所以这种层析与其他层析一样，选择适当的溶液作流动相是层析获得满意结果的重要因素之一。
二、应用实例
用DNS—氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽N末端
每条肽链(除环状链外)都有游离的N末端氨基酸，它可与荧光试剂DNS-Cl(二甲氨基萘磺酰氯)结合成DNS-氨基酸复合物。
(1)DNS-Cl的性质
DNS-Cl是一种荧光物质，能溶于有机溶剂，在pH9.5～10.5时，它能与氨基酸的一级胺、二级胺、巯基、咪唑基和酚羟基缩合成具有黄绿色荧光的衍生物。DNS-氨基酸衍生物比较稳定。
另外，DNS-Cl也能与氨和氢氧根分别生成显黄色荧光的DNS-NH2和显蓝色荧光的DNS-OH。

（2）展层
样品制备 将DNS-Cl与样品氨基酸混合。
展层 双向展层。

用DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜(10cmXl0cm)层析，获得一个分离效果较好的双向层析图谱(见图3-19)，仅需3h。
在紫外分析仪中观察可见图谱。