低磷胁迫下番茄转录因子WRKY6功能分析.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(10):136-147收稿日期：20230411基金项目：山西省研究生教育创新项目（2021Y325），山西省基础研究计划（202203021211263）作者简介：陈浩婷，女，博士研究生，研究方向：设施蔬菜栽培与生理；Email:通讯作者：张毅，男，博士，教授，研究方向：设施蔬菜栽培与生理；Email:；李天来，男，博士，教授，研究方向：设施蔬菜栽培与生理；Email:低磷胁迫下番茄转录因子 WRKY6 功能分析陈浩婷1 张玉静1 刘洁1 代泽敏1 刘伟1 石玉1 张毅1 李天来1，2（1.山西农业大学园艺学院，太谷 030801；2.沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110866）摘 要：本研究旨在分析番茄转录因子 WRKY6 在低磷胁迫应答中的作用，为研究番茄耐低磷分子机制及挖掘提高番茄低磷耐受性和磷素利用率的基因资源奠定理论基础。试验以野生型番茄 Ailsa Craig 为材料，以其 cDNA 为模板克隆基因 SlWRKY6，利用根癌农杆菌介导转化法构建 RNAiSlWRKY6 和 OESlWRKY6 转基因番茄株系，并对野生型、RNAiSlWRKY6 和 OESlWRKY6 3 种不同基因型的番茄植株进行低磷胁迫处理，在处理第 18 天对叶片与根系进行表型观察和生理生化指标测定。表型观察结果显示，与 RNAiSlWRKY6 转基因番茄相比，OESlWRKY6 转基因番茄植株较矮壮，叶片数量较多，受低磷胁迫影响较小，表现出较强的耐低磷性。生理生化指标分析结果表明，与野生型相比，OESlWRKY6 转基因番茄根系与叶片的有机磷和总磷含量显著升高，根系酸性磷酸酶活性和部分有机酸含量显著增加，磷转运体表达量显著降低。而 RNAiSlWRKY6 转基因番茄受到低磷胁迫后，这些指标的变化趋势与过表达株系相反。低磷胁迫后，LePT1 的相对表达量在 OESlWRKY6 植株根系中呈下降趋势，与 RNAiSlWRKY6 植株中变化相反。在野生型、RNAiSlWRKY6 和 OESlWRKY6 植株根系中 LePT2 的相对表达量均呈整体上升趋势，而LePT3 则呈整体下降趋势。由上述可知，SlWRKY6 能够响应低磷胁迫，其表达量高低与番茄植株的低磷耐受性呈正相关，且可能影响磷转运体基因对低磷的响应。该研究结果可为进一步揭示番茄 WRKY 转录因子家族的功能及其对低磷胁迫的响应机制提供理论依据。关键词：番茄；转录因子；SlWRKY6；低磷胁迫；功能分析；磷含量；酸性磷酸酶；有机酸DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.20230339Functional Analysis of WRKY6 Gene in Tomato Under Low-phosphorus StressCHEN Haoting1 ZHANG Yujing1 LIU Jie1 DAI Zemin1 LIU Wei1 SHI Yu1 ZHANG Yi1 LI Tianlai1,2（1.College of Horticulture,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801;2.College of Horticulture,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866）Abstract:The purpose of this study is to analyze the role of tomato transcription factor SlWRKY6 in response to lowphosphorus stress,and to lay a theoretical foundation for studying the molecular mechanism of lowphosphorus tolerance in tomato and exploring tomato germplasm resources of improving lowphosphorus tolerance and phosphorus utilization.Wildtype tomato Ailsa craig was used as the material and its cDNA was used as the template to clone SlWRKY6,and the RNAiSlWRKY6 and OESlWRKY6 transgenic tomato plant lines were constructed by agrobacterium tumefacienmediated transformation.Tomato plants with three different genotypes of wild type,RNAiSlWRKY6 and OESlWRKY6,were subjected to low phosphorus.On the day 18 of lowphosphorus treatment,the results of phenotype and physiological and biochemical indexes in the leaves and roots were determined.Phenotypic observation showed that OESlWRKY6 transgenic tomato plants were of thicker and shorter after low phosphorus treatment while compared with RNAiSlWRKY6 transgenic tomato plants,they had a higher number of leaves,and were less affected by lowphosphorus stress,and showed stronger lowphosphorus tolerance.The analysis results of physiological and biochemical indexes showed that the organic phosphorus and total phosphorus content in the roots and leaves of transgenic tomato plant 2023,39(10)137陈浩婷等：低磷胁迫下番茄转录因子 WRKY6 功能分析磷是植物生长发育必需的大量元素之一，在遗传信息的传递和细胞结构的维持中起重要作用。磷的供应减少，会使细胞分裂和增殖受到限制，植物新器官不能形成，代谢停滞，生长发育受阻1。研究表明，低磷胁迫能使大多数植物的根冠比增大、根直径变细、侧根和根毛密度增大，大多数植物根系还可改变生长角度，在表层土壤富集，形成“伞状”根系构型，以便于吸收表层土壤中的磷2。低磷胁迫下，植物自身还能产生一系列适应性反应，通过增强根系酸性磷酸酶活性等，增加根系对外界磷的获取和内部磷的循环再利用，通过根系释放的低分子量有机酸活化土壤中的无机、有机磷，通过诱导响应磷饥饿基因表达量变化等提高植物对磷的吸收，进而维持植物体内的磷稳态3-5。然而，设施番茄（Solanum lycopersicum L.）生产中普遍存在土壤磷总量高但磷肥利用率严重偏低的问题，每年仍需大量增施磷肥才能满足番茄生产的养分需求（磷肥用量达需求量的 28.7 倍），阻碍产业发展6。因此，采用有效的生物技术手段，解析磷素营养调控的分子通路，挖掘提高番茄低磷耐受性和磷素利用率的种质资源，具有重要的理论价值和现实意义。大量研究表明，WRKY 转录因子家族成员广泛参与应答各种生物和非生物胁迫反应7。WRKY 转录因子作为应答逆境胁迫的主要成分，通过与启动子区域中的顺式作用元件 Wbox 结合调控与抗逆有关靶标基因的表达，最终赋予植物抗逆性8。依据结构域数量和锌指结构特征，WRKY 主要分为 3类：第 I 类含 2 个 WRKY 结构域，又可分为 2 个亚类（Ia 和 Ib，锌指结构分别为 C2H2型和 C2HC 型）；第 II、III 类含 1 个 WRKY 结构域，其中第 II 类锌指结构为 C2H2型（IIa-IIe，5 个亚类），第 III 类锌指结构为 C2HC 型9。近年来，WRKY 通过结合靶基因启动子调控磷胁迫信号通路中相关基因表达的作用引起了广泛关注10。AtWRKY75 是 WRKY 家族中首次被报道参与磷转运、分配和信号转导的转录因子，AtWRKY75 RNAi 株系中磷转运体基因的表达量显著下降，表明该基因可正向调控磷转运体应对低磷胁迫11。过表达 WRKY42 促进了拟南芥（Arabidopsis thaliana）对磷的吸收，导致根部磷含量的增加；而在 WRKY42 突变体中磷的吸收能力下降，导致根中磷含量降低，使植株对低磷胁迫敏感。AtWRKY6 和 AtWRKY42 都可直接结合在 PHO1 的启动子上抑制其表达，降低植株对低磷胁迫的耐受性12。过表达 OsWRKY21 或 OsWRKY108 通过增强PHT1;1 基因的表达而促进磷的积累，而 OsWRKY21和 OsWRKY108 双突变体中 PHT1;1 基因表达水平和磷积累量均降低13。总之，WRKY 对下游缺磷响应基因有正向或负向的调控，并对植物的磷素信号和磷素稳态产生影响。本研究前期转录组结果显示，低磷胁迫下大量 WRKY 家族基因表达出现显著变化，尤其是 SlWRKY6 基因表达量降低了 67.14%14。为发掘番茄中应答低磷胁迫的 WRKY 转录因子，利用转基因技术获得SlWRKY6的干扰和超表达转基因番茄材料，解析 SlWRKY6 的功能，为揭示设施番茄磷高效利用的分子调控网络提供新观点，同时为利用 WRKY 转录因子改良茄科作物的低磷耐受性和提高磷利用效率提供科学依据。OESlWRKY6 significantly increased compared with wild type,while the acid phosphatase activity and some organic acid contents in the roots significantly increased.The expressions of phosphorus transporters also significantly reduced.However,the trend of changes in these indicators in the transgenic tomato plant RNAiSlWRKY6 under lowphosphorus stress was opposite to that in transgenic tomato plant OESlWRKY6.After lowphosphorus stress,the relative expressions of LePT1 decreased in the roots of OESlWRKY6 plants,which was opposite to that of RNAiSlWRKY6 plants.The relative expressions of LePT2 in the roots of wild type,RNAiSlWRKY6 and OESlWRKY6 plants showed an overall increasing trend,while the relative expressions of LePT3 showed an overall decreasing trend.According to the above results,SlWRKY6 responded to lowphosphorus stress and its expression was positively correlated with the lowphosphorus tolerance of tomato plants,and might affect the response of phosphorus transporter genes to low phosphorus.The results of this study may provide certain theoretical basis for further revealing the function of tomato WRKY transcription factor family and its response mechanism to lowphosphorus stress.Keywords:tomato;transcription factors;SlWRKY6;lowphosphorus stress;functional analysis;phosphorus content;acid phosphatase;organic acid生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.101381 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验材料 试验于 2022 年 4-12 月在山西农业大学园艺实验中心人工气候室进行，以实验室自存的 Ailsa Craig 野生型番茄为试验材料。1.1.2 主要试剂 RNAiso Plus（Trizol）购自宝生物（TaKaRa）工程（大连）有限公司；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；在上海生工生物工程股份有限公司（https:/ 方法1.2.1 材料培养及试验处理 将番茄种子清洗、浸种、催芽，播种；待“三叶一心”时选取长势良好、大小一致的幼苗，将其根系表面洗净，定植于 1/2倍 Hoagland 营养液中进行不同磷水平处理。其中正常磷处理的 KH2PO4浓度为 0.66 mmol/L，低磷处理的 KH2PO4浓度为 0.066 mmol/L。待缓苗 5 d 后换 1倍营养液开始处理，在胁迫处理 0 d 和 18 d 后取番茄幼苗根系和叶片组织，液氮速冻后置于 80保存，用于各生理生化指标的测定。1.2.2 番茄 SlWRKY6 基因的克隆及农杆菌介导的番茄遗传转化 根据 NCBI 中 SlWRKY6 的 Gene ID（101247683），从 Sol Genomics Network 网 站 下 载CDS 序列。利用 Primer5 设计特异性引物，参照周涛等15和王茹等16的方法构建 SlWRKY6 基因的过表达和干扰载体。将测序正确的菌液提取质粒，通过冻融法转入根癌农杆菌中，筛选单克隆阳性菌株进行后续侵染。将成熟的番茄种子温汤浸种消毒后，均匀地播在 MS 固体培养基上。待番茄子叶完全展开时，在超净台中将叶片两端切去开始预培养 3-4 d，获得番茄野生型植株的外植体。将含有过表达和RNAi 重组质粒的农杆菌菌液培养至 OD600值为 0.6，5 000 r/min 离心 10 min，将收集菌体用 MS 液体培养基重悬至 OD600=0.4。将外植体置于重悬好的菌液中侵染，暗培养 2 d 后，进行正常光下培养，开始芽诱导分化、生根以及抗性植株筛选等步骤。1.2.3 RNAiSlWRKY6 和 OESlWRKY6 阳性转基因植株的鉴定 随机称取 0.2 g 已形成完整幼小植株的组织，进行 DNA 的提取；选取载体上一段序列和基因上一段序列设计引物进行 PCR 检测，将最终获得的阳性植株即 T0代转基因番茄移栽到田间留种。其中 PCR 反应体系为 20 L：DNA 4 L，Forword Primer（10 mol/L）1 L，Reverse Primer（10 mol/L）1 L，2Rapid Taq Mastermix 10 L，ddH2O 4 L。PCR 反应程序为：预变性 95 3 min；变性 95 15 s，退火 55 15 s，延伸 72 30 s，35 次循环；终止延伸 72 5 min。检测过表达转基因植株引物为表1 中 JCWRKY6F 和 JCWRKY6R；检测干扰转基因植株引物为表 1 中 JCRNAiWRKY6F 和 JCRNAiWRKY6R。将收获的T0代种子浸种催芽播于穴盘中，待三叶一心转移至温室中培养，获得 T1代转基因植株。按照该步骤继续传代培养至 T2代，对 T2代转基因番茄幼苗再次进行 PCR 检测（PCR 体系和扩增体系同上）和 RTqPCR 检测（RTqPCR 体系和扩增体系见 1.2.4），挑选过表达株系中表达量较高的两个株系 OESlWRKY61、OESlWRKY62，以及干扰株系中表达量较低的两个株系 RNAiSlWRKY61、RNAiSlWRKY62，用于后续生理生化指标的测定。选取 OESlWRKY61 和 RNAiSlWRKY61 两个株系的地下部进行磷转运体家族基因相对表达量的测定。表 1 引物列表Table 1 Table of primers引物名称 Primer name引物序列 Primer sequence（5-3）SlWRKY6FCAACCACCCATTACCACCAGSlWRKY6RGTTTGGATTTTGGGCTGTGLePT1;1FTTGGTGGTGATTATCCCCTTTCLePT1;1RGGCAGTTTCAGGCATCTTCATALePT1;2FAAAATGGGACGAAAAAAGGTGLePT1;2RGATGGTAGCGGACAAAGGGTLePT1;3FTTCGATTTTGGCTTGGTTTTGLePT1;3RGTGCTGTCTCAGGCATCTTCAActinFACCACTGAGCACAATGTTACCGActinRGTCCTCTTCCAGCCATCCAJCWRKY6FATGACGCACAATCCCACTATCJCWRKY6RCTACCGTTGACTGATCACTTCCJCRNAiWRKY6FGGAAGGTGGCTCCTACAAATGJCRNAiWRKY6RCTTCCGATGAAGAGCGAGAATG1.2.4 总 RNA 提取、cDNA 合成及实时荧光定量检测 利用 RNAisoPlus（TaKaRa，大连，中国）提2023,39(10)139陈浩婷等：低磷胁迫下番茄转录因子 WRKY6 功能分析取样品中的 RNA，将所得 RNA 按照金沙生物反转录试剂盒的说明书进行反转录。使用诺唯赞公司试剂盒合成第一链 cDNA，反应体系为：UnionScript Firststrand cDNA Synthesis Mix 4 L、总 RNA 1 L、dsDNase 1 L、ddH2O 14 L。混 匀 后 42 15 min，95 3 min，在 PCR 仪上进行。采用 RTqPCR 方法检测不同基因的表达水平，番茄库中Solyc03g078400 被用作 Actin 内参基因，用 3 次技术重复进行 RTqPCR 扩增。其中 RTqPCR 反应体系为 20 L：cDNA 4 L，Forword Primer（10 mol/L）0.4 L，Reverse Primer（10 mol/L）0.4 L，2ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 L，ddH2O 5.2 L。RTqPCR 反应程序为：预变性 95 30 s；95 10 s，60 30 s，40 个循环；溶解曲线 95 15 s；60 60 s；95 15 s。计算基因相对表达量的方法采用 2-Ct，本研究中使用的所有荧光定量引物序列均见表 1。1.2.5 根系与叶片无机磷含量和酸性磷酸酶活性的测定 随机称取约 0.2 g 冻样，加提取液 2 mL（0.4 mL TCA+1.6 mL 蒸馏水）充分研磨，离心提取上清液。将 0.1 mL 样品上清液与 1.5 mL 试剂（6 mol/L 硫酸蒸馏水2.5%钼酸铵水溶液1%抗坏血酸=1422 配置）混匀置于 45水浴保温 30 min，室温冷却 10 min 后于 660 nm 测定吸光度。由于钼蓝与磷酸根生成 660 nm 有特征吸收峰的物质，即可计算无机磷含量。随机称取约 0.3 g 冻样，加提取液8 mL 醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH 5.8）冰浴充分磨 样，高速冷冻离心提取上清液。将 0.2 mL 样品上清液与 5 mL 5 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠，37水浴30 min 后加入 1 mL 1 mol/L 的 NaOH 溶液结束反应。酸性磷酸酶（ACP）活性通过测量对硝基苯酚在 405 nm 下的吸光值来评估，一个单位的 ACP 活性即每克组织在 405 nm 处每分钟吸光度单位的变化量17。1.2.6 根系有机酸含量的测定 随机选取同一处理下 3 株幼苗的根系用蒸馏水冲洗干净，加适量液氮研磨成粉末，加入适量的超纯水定容到 5 mL，室温水浴超声提取 30 min，离心提上清液，用 0.45 m微孔滤膜，每个处理重复 3 次，采用高效液相色谱（HPLC）测定根系中的有机酸含量。高效液相色谱条件：安捷伦 C18柱（XDBC18，5 m，4.6 mm 250 mm）；流动相为 0.01 mol/L KH2PO4，pH 为 2.5（磷酸调节）；流速 0.5 mL/min；柱温 40；进样量 10 L；检测波长 215 nm18。1.2.7 根系与叶片总磷含量的测定 随机选取同一处理下 4 株幼苗的根系和叶片，用蒸馏水冲洗干净称其鲜重记录，105杀青 2 h，75烘干至恒重后先称其干重记录，再磨成粉末过 0.25 mm 筛。每个处理 3 个重复，每个重复称取 0.1-0.2 g 样品。参照梁颖等19的方法，采用 H2SO4H2O2消煮。首先将已称取干样用 5 mL 浓 H2SO4过夜酸解，第 2 天将其在消煮炉上先 120加热 30 min，再 380加热 1 h后加 4-5 滴 H2O2过氧化氢，重复此操作直至溶液清澈透明，最后 380煮 20 min 以上消除多余 H2O2，消解完成。参照梁颖等19的方法，采用钼锑抗比色法测总磷含量。吸取消煮液 0.2 mL 定容至 10 mL，加入两滴 2,4 二硝基苯酚指示剂，滴加 4 mol/L NaOH 溶液至液体变为黄色，再加 2 mol/L H2SO4溶液使黄色刚刚褪去，加钼锑抗显色剂 2 mL 后定容至50 mL，室温摇匀 30 min 后于 700 nm 测定吸光度。1.2.8 数据处理分析 为了获得可重复性的结果，每个处理进行 3 个生物重复。数据采用方差分析（ANOVA）进行统计学分析，均数比较采用Duncan s 在 SPSS 20.0（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）中 P0.05 水平下进行。图表绘制采用 GraphPad prism8.0 绘制（GraphPad Software,San Diego,California USA,www.graphpad.Com）。2 结果2.1 农杆菌介导的番茄遗传转化以及阳性植株的鉴定获得 T0代番茄的过程如图 1A-C 和 E-F 所示，经传代培养后获得 T2代转基因植株，在三叶一心时对部分 T2代番茄运用 PCR 和 qPCR 技术进行检测，结果如图 1D,H 和图 2 所示，共获得 T2代转基因番茄过表达 7 株、干扰 8 株，最终选择其中表达量最高的过表达株系和表达量最低的干扰株系用于后续研究。生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.101402.2 在低磷胁迫下转基因番茄的表型观察和生理生化指标的测定2.2.1 在低磷胁迫下转基因番茄的表型变化 低磷处理 18 d 后，过表达株系茎秆粗壮、叶片伸展且色泽鲜艳、生长趋势良好；而干扰株系茎秆细弱、叶片卷曲枯黄、生长势较弱（图 3）。从表型观察可得，SlWRKY6 过表达显著提高了番茄植株的耐低磷性。在低磷条件下，与 WT 相比，OEWRKY6 的各项生长指标都有显著变化，其中茎粗、地上鲜重、地下鲜重、地上干重、地下干重、总鲜重、总干重均显著增加，OEWRKY61 分别提高了 35.29%、79.75%、104.47%、112.82%、66.82%、88.04%、100.12%；OEWRKY62 分 别 提 高 了 80.58%、102.74%、110.27%、67.13%、88.01%、98.35%。与OEWRKY6 相比，RNAiWRKY6 的各项生长指标除株高显著提高外，茎粗、地上鲜重、地下鲜重、地上干重、地下干重、总鲜重和总干重等均显著降低（表 2）。2.2.2 低磷胁迫下不同转基因番茄植株无机磷含量和酸性磷酸酶活性的测定 在处理 0 d 时，WT和 RNAiWRKY6 叶片的无机磷含量显著低于 OEWRKY6；而 WT 和 OEWRKY6 根系的无机磷含量显著高于 RNAiWRKY6。低磷胁迫处理后，不同基因型番茄植株叶片和根系的无机磷含量均呈下降趋势，其与处理时间呈负相关关系。在处理 18 d 时，OEWRKY6 叶片和根系的无机磷含量仍然显著高于 WT和 RNAiWRKY6，与 WT 相 比，RNAiWRKY6 叶片的无机磷含量较少但未形成显著差异，但根系无机磷显著增高。低磷胁迫下，OEWRKY61 和 OEWRKY62 叶片和根系的无机磷含量较 WT 分别显著增加了 13.25%、13.39%和 46.65%、38.79%（图 4）。在未处理时，WT 和 RNAiWRKY6 叶片与根系的酸性磷酸酶活性显著低于 OEWRKY6，其中RNAiWRKY62 根系的酸性磷酸酶活性显著低于OEWRKY61，且降低了 28.75%。低磷胁迫后，不ABCDHGFEA、E：共培养；B、F：筛选及分化；C、G：生根；D、H：T2代番茄 PCR 鉴定；M：DNA marker DL2000；P：质粒对照；CK：阴性对照；WT：对照植株；D（1-7）和 H（1-8）：分别是过表达株系和干扰株系的阳性苗A,E:Coculture.B,F:Screening and differentiation.C,G:Rooting.D,H:PCR identification of T2 generation tomato.M:DNA marker DL 2000.P:Plasmid groups.CK:Negative control.WT:Controlled plant.D（1-7）and H（1-8）:Positive strains of overexpressing and interfering strains,respectively图 1 番茄的遗传转化和 T2代番茄的 PCR 验证Fig.1 Genetic transformation in tomato and PCR valida-tion in the tomato with the T2 generationaabbcdbcdbcddeabce00.511.522.533.54OE-SlWRKY6-1OE-SlWRKY6-2OE-SlWRKY6-3OE-SlWRKY6-4OE-SlWRKY6-5OE-SlWRKY6-6OE-SlWRKY6-7WT?Relative expression不同小写字母表示不同处理间差异显著（P0.05）。下同Different letters indicate significant differences among different treatments（P 0.05）.The same below图 2 RT-qPCR 检测 T2代转基因番茄植株 RNAi-WRKY6和 OE-WRKY6 中 WRKY6 的表达量Fig.2 Expressions of WRKY6 in RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6 in T2 generation transgenic tomato plants detected by RT-qPCR2023,39(10)141陈浩婷等：低磷胁迫下番茄转录因子 WRKY6 功能分析同基因型番茄幼苗叶片与根系的酸性磷酸酶活性均显著提高，其与处理时间呈正相关关系。在低磷处理 18 d 时，WT 和 RNAiWRKY6 叶片的酸性磷酸酶活性显著高于 OEWRKY6，而 WT 和 RNAiWRKY6根系的酸性磷酸酶活性显著低于 OEWRKY6。其中与 RNAiWRKY62 相比，OEWRKY61 叶片的酸性磷酸酶活性显著降低了 27.23%；与 RNAiWRKY61相比，OEWRKY61 根系的酸性磷酸酶活性显著提高了 17.53（图 5）。2.2.3 低磷胁迫下不同转基因番茄植株全磷含量的 测 定 处 理 0 d 时，WT、RNAiWRKY6 和 OEWRKY6 的叶片全磷含量均无显著差异；处理 18 d后，3 种基因型番茄植株叶片的全磷含量均呈下降趋势。低磷胁迫下，与 RNAiWRKY62 相比，OEWRKY61 叶片的全磷含量显著提高了 18.50%。处理 0 d 时，与 OEWRKY6 相 比，RNAiWRKY6 根系的全磷含量均显著提高；在处理 18 d 后，3 种基因型番茄植株的根系全磷含量均呈下降趋势。与WT 相比，OEWRKY6 根系的全磷含量显著提高，OEWRKY1 和 OEWRKY2 分 别 提 高 了 21.23%、23.80%；而 RNAiWRKY6 根系的全磷含量却显著下降，RNAiWRKY61 和 RNAiWRKY62 分别下降了25.82%、26.71%。在处理 18 d 后，RNAiWRKY62相较于OEWRKY62的根系全磷含量降低更为显著，WTRNAi-WRKY6-1RNAi-WRKY6-2OE-WRKY6-1OE-WRKY6-205101520?Plant height/cmbabbaWTRNAi-WRKY6-1RNAi-WRKY6-2OE-WRKY6-1OE-WRKY6-20246?stem diameter/mmWTRNAi-WRKY6-1OE-WRKY6-1bbaRNAi-WRKY6-2OE-WRKY6-2abRNAiWRKY6 从左往右依次为 RNAiWRKY61、RNAiWRKY62；OEWRKY6 从左往右依次为 OEWRKY61、OEWRKY62RNAiWRKY6 from left to right is RNAiWRKY61,RNAiWRKY62;OEWRKY6 from left to right is OEWRKY61,OEWRKY62图 3 低磷条件下转基因番茄植株 RNAi-WRKY6 和 OE-WRKY6 的表型观察Fig.3 Phenotypes of transgenic tomato plant RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6 under low phosphorus conditions表 2 低磷条件下转基因番茄植株 RNAi-WRKY6 和 OE-WRKY6 生物量的测定Table 2 Biomass of transgenic tomato plants RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6 under low phosphorus conditions处理 Treatment地上鲜重 Aboveground fresh weight/g地下鲜重 Underground fresh weight/g地上干重 Aboveground dry weight/g地下干重 Underground dry weight/g总鲜重 Total fresh weight/g总干重 Total dry weight/gWT1.880.25b0.950.08b0.220.05b0.080.01b2.830.18b0.300.05bRNAiSlWRKY611.710.34b1.350.16b0.200.04b0.080.01b3.060.49b0.280.05bRNAiSlWRKY621.68+0.33b1.34+0.14b0.20+0.04b0.09+0.01b3.02+0.45b0.28+0.05bOESlWRKY613.380.08a1.940.14a0.460.04a0.140.01a5.330.19a0.600.05aOESlWRKY623.40+014a1.93+0.13a0.45+0.05a0.14+0.01a5.33+0.22a0.59+0.06a注：同列数据后标不同小写字母表示各处理在 P0.05 水平上差异显著，下同Note:Different lowercase letters after the data in the same column in the table indicate that the values of each treatment are significantly different at the P WTRNAiWRKY6；在低磷处理 18 d 后，LePT2 在 WT、RNAiWRKY6 和 OEWRKY6 植株中的表达量相较于 0 d时均有大幅度的提高，而 LePT3 在 3 种基因型植株中的表达量却均呈下降趋势。与 LePT2、LePT3 不同，低磷处理 18 d 后，LePT1 的表达量在 WT 和 RNAiWRKY6 植株中显著增加，呈上升趋势，而在 OEWRKY6 中却显著降低，呈下降趋势（图 7）。3 讨论3.1 低磷胁迫下SlWRKY6影响番茄幼苗表型变化和生物量分配植株表型和生长特性的变化是植株主动适应逆0 d18 d04080120?Inorganic phosphorusin leaves/(gg-1)WTRNAi-WRKY6-1OE-WRKY6-1bbabbaRNAi-WRKY6-2OE-WRKY6-2abab0 d18 d020406080?Inorganic phosphorusin roots/(gg-1)abacbababa图 4 低磷条件下转基因番茄植株 RNAi-WRKY6 和 OE-WRKY6 无机磷含量的测定Fig.4 Determination of inorganic phosphorus content in transgenic tomato plants RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6 under low phosphorus conditionWTRNAi-WRKY6-1OE-WRKY6-1RNAi-WRKY6-2OE-WRKY6-20 d18 d0123?Activity of APase in leaves/(Ug-1)bccaaaabbcab0 d18 d01234?Activity of APase in roots/(Ug-1)abbabaabba图 5 低磷条件下转基因番茄植株 RNAi-WRKY6 和 OE-WRKY6 酸性磷酸酶活性的测定Fig 5 Determination of acid phosphatase activity in transgenic tomato plant RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6 under low phosphorus condition2023,39(10)143陈浩婷等：低磷胁迫下番茄转录因子 WRKY6 功能分析境胁迫最显著的表现。低磷胁迫下，植株会根据外界环境缺磷的程度调节地上部、地下部生物积累量，而根系是最先受到胁迫影响的器官20。研究表明，在适应低磷胁迫的过程中，小麦（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays L.）等作物可