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独活寄生汤通过调节免疫功能发挥对膝骨关节炎小鼠软骨损伤的缓解作用陈文锦，庄 胤，彭 伟，崔 巍，张树军，王建伟 无锡市第九人民医院（无锡市骨科医院）骨科，江苏 无锡；无锡市中医医院骨科，江苏无锡 收稿日期：基金项目：江苏省自然科学基金项目（）作者简介：陈文锦，男，博士，副主任医师，从事骨科临床治疗与基础研究。：通信作者：王建伟，男，博士，主任医师，从事骨科医学临床治疗与基础研究。：摘要：目的 研究独活寄生汤通过调节免疫功能缓解膝骨关节炎（）小鼠软骨损伤的作用机制。方法小鼠分为正常组、模型组和独活寄生汤低、高剂量组（、），除正常组外，其余各组小鼠右关节腔每周注射 次 木瓜蛋白酶，连续 周，建立 模型，随后给予相应药物干预 周。给药结束后测量足趾厚度以评价小鼠关节肿胀度，法检测血清 水平，染色评估膝关节软骨及脾脏病理组织学改变，免疫组化染色检测软骨、及脾脏、表达，蛋白印迹法检测软骨、蛋白表达，法检测软骨组织、表达。结果 与正常组比较，模型组小鼠右侧爪中心点厚度，血清 水平，膝关节软骨组织、和 蛋白表达，膝关节软骨组织、表达，脾脏、蛋白表达升高（，），软骨出现病理性损伤，病理评分升高（），脾脏组织无明显病理损伤；与模型组比较，独活寄生汤各剂量组上述指标均有改善（，）。结论 独活寄生汤可减轻木瓜蛋白酶诱导的 小鼠软骨损伤，该作用与其调节脾脏免疫功能，减少膝关节软骨 的过度激活相关。关键词：独活寄生汤；膝骨关节炎；木瓜蛋白酶；脾脏；免疫功能；炎症；凋亡中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：膝骨关节炎（，）是与衰老相关的退行性疾病，其特征是膝关节软骨损伤和凋亡，是导致残疾的主要原因。目前，的药物治疗以镇痛药和非甾体抗炎药为主，但它们往往只缓解疼痛，在改变 疾病进程方面临床效果不显著。软骨细胞凋亡与 的严重程度呈正相关，是促进关节软骨破坏和基质降解的主要原因。炎症是介导软骨细胞凋亡的关键因素。由于免疫异常，如巨噬细胞异常激活，会促进炎症过度积累及软骨细胞凋亡。故调节免疫可能为改变 患者疾病进程提供更优的治疗选择。独活寄生汤出自 备急千金要方，是中医治疗“顽痹”的经典名方。其已被证明具有多种药理特性，包括抗炎、软骨保护、抗氧化和抗凋亡作用。课题组前期研究证实了独活寄生汤对 大鼠的干预作用。临床研究显示，独活寄生汤是治疗腰椎间盘突出症、类风湿性关节炎、膝骨关节炎的有效方剂。迄今为止，少有基础研究报道独活寄生汤在 小鼠模型中是否具有缓解软骨损伤的作用。此外，独活寄生汤对减轻软骨细胞损伤的机制尚未完全阐明。故本研究评估了独活寄生汤在 小鼠模型中的药效，同时探索了独活寄生汤是否可通过调节脾脏的免疫功能缓解 小鼠的软骨细胞炎症和凋亡。材料 药物与试剂独活寄生汤由无锡市中医院制剂部提供。小鼠 试剂盒（货号，杭州联科生物技术股份有限公司）；脱钙液、苏木素伊红（）染色试剂 盒、显 色 试 剂 盒 购（货 号、，北京索莱宝科技有限公司）；多克隆抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多克隆抗体、多克隆抗体、多克隆抗体（货号、，武汉三鹰生物技术有限公司）；逆转录试剂盒、反应试剂盒 货号、，翌圣生物科技（上海）股份有限公司。仪器 数显 防水游标卡尺（桂林广陆数字测控有限 公 司）；组 织 脱 水 机、全自动组织包埋机、半自动轮转式切片机（德国 公司）；小型垂直电泳转印系统、凝胶成像系统（美国 公司）；年 月第 卷 第 期中 成 药 实时荧光定量 系统（美国 公司）；全 波 长 酶 标 仪（美 国 公司）。动物 雄性小鼠，周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司 实验动物生产许可证号（苏），饲养于南京中医药大学实验动物中心 级屏障环境 实验动物使用许可证号为（苏），动物实验研究方案由南京中医药大学动物伦理委员会批准（伦理号）。方法 分组、造模及给药 将小鼠随机分为正常组、模型组和独活寄生汤低、高剂量组，每组 只。除正常组外，其余组小鼠右膝关节腔注射 木瓜蛋白酶溶液（生理盐水配制），每周注射 次，连续 次，复制 小鼠模型。周后，对照组和模型组灌胃生理盐水，独活寄生汤低、高剂量组灌胃、独活寄生汤药液，每天 次，连续 周。关节肿胀评价及取材 造模前后及给药后每周，使用游标卡尺测量小鼠右侧爪中心点厚度。给药结束后，小鼠摘眼球取血，离心后取血清，保存备用。每组小鼠取 只右膝关节及脾脏固定于 多聚甲醛溶液；另取 只右膝关节软骨冷冻保存。法检测血清 水平取各组小鼠血清，按照小鼠 试剂盒检测说明书，加入血清和标准品，孵育 ，加入显色试剂，终止显色后，清洗反应板 次，使用酶标仪测定每孔在 波长处的吸光度值。拟合标准曲线，计算各组小鼠血清 水平。染色评估膝关节软骨及脾脏病理组织学改变将固定于多聚甲醛中的胫骨用水洗涤后在 溶液中脱钙 周，然后在梯度乙醇（、）中脱水；固定后的小鼠脾脏可直接脱水。将小鼠胫骨标本或脾脏用石蜡包埋，制成蜡块，使用石蜡切片机制备切片，常规脱蜡、复水后，使用 染色液进行染色。封片后于光学显微镜下拍照，并进行一般组织学评估。对于小鼠软骨组织，依据软骨结构受损程度、细胞数量和软骨边缘的完整性进行评分，标准即 分为无损伤，分为轻度损伤，分为中度损伤，分为重度损伤。免疫组化染色检测软骨、及脾脏、表达将小鼠胫骨或脾脏组织切片浸于过氧化氢溶液中 ，清洗 次，使用柠檬酸钠抗原修复液对组织内的抗原进行热修复，清洗 次，使用 孵育 以封闭抗原，股骨组织切片滴加稀释后的、和 抗体，脾脏组织切片滴加稀释后的 和 抗体，孵育过夜，清洗 次，各切片滴加 修饰的山羊抗兔 （），于保湿盒中孵育 ，清洗 次后使用 显色试剂盒进行染色。封片后于光学显微镜下拍照，并分析股骨组织中、表达及脾脏中、表达。蛋白质印迹法检测膝关节软骨组织、蛋白表达参考课题组前期研究方法，将冻存的小鼠股骨软骨组织电动匀浆裂解，、离心 ，取上清液，试剂盒测定蛋白质浓度。通过 分离等量蛋白质（），然后转移到 膜上，于 封闭缓冲液中室温封闭 ，加 （）、（）一抗 孵育过夜，次日清洗后加二抗（）孵育 ，洗涤 次，使用超敏 发光试剂盒进行显色，通过凝胶成像系统曝光，并对蛋白条带进行定量分析。法 检 测 软 骨 组 织、表达使用 试剂提取小鼠软骨组织总，使用逆转录试剂盒将其逆转录为，进行 扩增反应，以 为内参，法计算各炎症因子 相对表达。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表。表 引物序列基因正向序列反向序列 统计学分析 通过 软件进行处理，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 检验。表示差异具有统计学意义。结果 独活寄生汤对 小鼠关节肿胀和炎症的影响与正常组比较，其余各组小鼠右侧足在注射木瓜蛋白酶 周后明显肿胀，右侧足中心厚度增厚（），血清 水平和软骨病理评分升高（），软骨组织受损，透明软骨厚度减小；与模型组比较，独活寄生汤各剂量组干预 周后，小鼠右侧足中心厚度减小（），干预 周后足肿胀情况缓解，独活寄生汤高剂量组血清 水平和软骨病理评分降低（），膝关节软骨损伤有所改善，见图。独活寄生汤对 小鼠软骨降解与凋亡的影响 图 显示，与 正 常 组 比 较，模 型 组 小 鼠 软 骨 组 织、年 月第 卷 第 期中 成 药 注：为各组小鼠右侧足代表性图片，为各组小鼠在造模前后及给药后每周的右侧足厚度（，），为各组小鼠血清 水平（，），为各组小鼠右侧膝关节软骨 染色图（），为各组小鼠软骨病理学评分（，）。与正常组比较，；与模型组比较，。图 独活寄生汤对 小鼠关节肿胀和炎症的影响注：与正常组比较，；与模型组比较，。图 独活寄生汤对 小鼠软骨组织、表达的影响（，）年 月第 卷 第 期中 成 药 表达增加（）；与模型组比较，独活寄生汤各剂量组小鼠软骨组织、表达降低（，）。独活寄生汤对 小鼠膝关节软骨组织 信号的影响 图 显示，与正常组比较，模型组小鼠软骨组织、蛋白表达升高（）；与模型组比较，独活寄生汤各剂量组小鼠软骨组织、蛋白表达降低（）。注：为各组小鼠软骨组织 免疫组化染色图（），为各组小鼠软骨组织 免疫组化平均光密度值（，），为各组小鼠软骨组织、蛋白条带图，为各组小鼠软骨组织、蛋白表达（，）。与正常组比较，；与模型组比较，。图 独活寄生汤对 小鼠膝关节软骨组织、表达的影响 独活寄生汤对 小鼠软骨组织炎症因子 表达的影响 图 显示，与正常组比较，模型组小鼠软骨组织、表达升高（），、表达降低（）；与模型组比较，独活寄生汤各剂量组小鼠软骨组织、表达降低（，），、表达升高（，）。独活寄生汤对 小鼠脾脏免疫功能的影响 染色结果显示，各组小鼠脾脏边界清晰，几乎无生发中心，说明 模型小鼠脾脏无明显的病理学损伤，且独活寄生汤未影响 小鼠脾脏病理组织学，见图。免疫组化结果显示，与正常组比较，模型组小鼠脾脏组织、表达升高（）；与模型组比较，独活寄生汤各剂量组小鼠脾脏组织、表达降低（），见图。讨论 是老年人常见的退行性疾病，其发病过程与炎症密切相关。炎性因子进入关节腔作用于关节软骨，会加剧软骨破坏，促进 进展。独活寄生汤是中医的经典名方，很多临床研究报道了其对不同类型骨关节疾病具有显著的疗效。但目前独活寄生汤的基础研究仍不足，故本研究探索了独活寄生汤在 动物模型中的作用及潜在机制。本研究使用木瓜蛋白酶连续注射 周复制了 小鼠模型，给予独活寄生汤干预，证明了独活寄生汤可延缓模型小鼠的 进展。独活寄生汤干预后小鼠软骨破坏减少，尤其是软骨内炎症因子表达降低。研究还发现独活寄生汤 可 抑 制 软 骨 组 织 中 的 激 活，包 括、及 在内的多个环节。是调节炎症因子表达的关键调控因子之一，其激活导致 表达增加，促进其他炎症细胞因子水平升高，破坏软骨促进 发生。本研究发现独活寄生汤可抑制膝关节软骨的降解与凋亡以保护关节软骨治疗，表现为降低 小鼠膝关节软骨中过度表达的 和。在 患者的血清和关节液中 表达增加会降解变性胶原破坏关节软骨。而 不仅是 炎症信号的关键因子，同时是促凋亡因子。独活寄生汤对 的抑制导致炎症的减少，可能是其减少关节软骨降解与凋亡的原因。软骨细胞损伤主要由炎症所致。因此，本研究检测了关节软骨中的多种促炎和抗炎细胞因子，以进一步确认独活寄生汤对炎症的作用。结果表明，小鼠软骨组织中异常增高的促炎因子、及 表达受到独活寄生汤抑制，而抗炎因子、年 月第 卷 第 期中 成 药 注：与正常组比较，；与模型组比较，。图 独活寄生汤对 小鼠软骨组织炎症因子 表达的影响（，）注：与正常组比较，；与模型组比较，。图 独活寄生汤对 小鼠脾脏免疫功能的影响（，）表达被上调。在退行性骨关节疾病中，、及 等促炎因子均被证明促进骨破坏，而抗炎因子 及 则具有抑制软骨损伤的作用。骨关节炎的病理学不仅包含炎症，还包括免疫系统的激活。在 中缺乏关于不同免疫细胞如何影响软骨的直接证据，较多免疫相关的研究集中于类风湿性关节炎中。鉴于脾脏是最为重要的免疫器官，因此，本研究检测了 小鼠脾脏病理学及脾脏中 阳性和 阳性细胞的数量。作为 细胞的标志物，几乎表达于所有成熟 细胞，而 则是小鼠成熟巨噬细胞的标志物。本研究结果显示，正常小鼠脾脏中 和 阳性细胞数量较少，模型组小鼠脾脏中 和 阳性细胞数增加；给予独活寄生汤干预后，小鼠脾脏中 和 阳性细胞数量减少，提示脾脏可能通过促进 细胞和巨噬细胞激活导致 的过度激活，独活寄生汤可调节脾脏免疫功能减少软骨中 的激活。综上所述，独活寄生汤可减轻木瓜蛋白酶诱导的 小鼠软骨损伤，其作用与降低脾脏 细胞和巨噬细胞激活，抑制软骨 通路，从而减少软骨的凋亡与降解有关。参考文献：，（）：，：，（）：年 月第 卷 第 期中 成 药 ，（）：，（），（）：，：，：，（）：夏文辉 独活寄生汤临床应用现状 实用中医药杂志，（）：周子齐，关雪峰，杨永菊 独活寄生汤治疗膝骨关节炎机制的研 究 进 展 中 华 中 医 药 杂 志，（）：，：陈旭平 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