豆腐皮常温贮藏过程中菌相变化及优势菌致腐性分析.pdf

闫彦君，张友慧，高凤，等.豆腐皮常温贮藏过程中菌相变化及优势菌致腐性分析 J.食品工业科技，2023，44（19）：140149.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023010088YAN Yanjun,ZHANG Youhui,GAO Feng,et al.Changes in the Bacterial Phases of Soybean Curd Sheets and Analysis of SpoilageAbility of Dominant Bacteria Stored at Normal TemperatureJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(19):140149.(inChinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023010088 生物工程 豆腐皮常温贮藏过程中菌相变化及豆腐皮常温贮藏过程中菌相变化及优势菌致腐性分析优势菌致腐性分析闫彦君1，张友慧1，高凤1，李雅1，刘常金1,2,*（1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2.天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457）摘要：本文以中国传统豆类食品豆腐皮为研究对象，采用传统分离鉴定和高通量测序技术共同分析豆腐皮的腐败菌，并将优势菌回接至无菌豆腐皮，通过定期测定样品贮藏过程中菌落总数、挥发性盐基氮（TVB-N）、pH、感官评分和质构特性来确定优势菌对品质的影响，通过扫描电子显微镜、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和傅里叶红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR）来确定优势菌对蛋白的影响。结果表明，豆腐皮的菌相在贮藏过程中发生了明显变化，贮藏 2 d 的优势腐败菌主要为不动杆菌（Acinetobacter）、葡萄球菌（Staphylococcus）和库特氏菌（Kurthia）。对上述腐败菌，选择 3 株有代表性的进行回接，发现一株产蛋白酶的松鼠葡萄球菌和混菌的致腐能力最强，可以导致 TVB-N、黏性显著增加，硬度、弹性和咀嚼性显著下降（P0.05）。扫描电子显微镜显示接种松鼠葡萄球菌和混菌的样品表面蛋白结构扭曲，有许多孔洞；SDS-PAGE 结果表明大豆蛋白的 7S 亚基出现不同程度的褪色或消失，25 kDa 以下区域明显加深且出现一个新的条带；傅里叶红外光谱显示样品的-折叠降低，-转角增加。因此，松鼠葡萄球菌被鉴定为豆腐皮常温贮藏的特定腐败菌，为后续靶向控制豆腐皮中腐败菌的生长提供参考。关键词：豆腐皮，高通量测序，优势腐败菌，腐败能力，蛋白结构本文网刊:中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）19014010DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023010088ChangesintheBacterialPhasesofSoybeanCurdSheetsandAnalysisofSpoilageAbilityofDominantBacteriaStoredatNormalTemperatureYANYanjun1，ZHANGYouhui1，GAOFeng1，LIYa1，LIUChangjin1,2,*（1.College of Food Science&Engineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China；2.National Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Tianjin University ofScience and Technology,Tianjin 300457,China）Abstract：The bacterial phase changes and the effect of dominant spoilage bacteria on quality were studied with traditionalidentification method and high-throughput sequence technique using Chinese traditional food soybean curd sheets asmaterials.Sterile soybean curd sheets were inoculated with three dominant bacteria and their combination.The total viablecounts,total volatile base nitrogen (TVB-N),pH,sensory score,and texture characteristics of samples during normaltemperature storage were measured periodically for spoilage potential.The scanning electron microscopy,sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE),and Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)were used todetermine the effect of spoilage bacteria on the protein.The results indicated the bacterial phases of soybean curd sheets 收稿日期：20230112 基金项目：天津市科技支撑计划项目（19YFZCSN00560）。作者简介：闫彦君（1998），女，硕士研究生，研究方向：生物与医药，E-mail：。*通信作者：刘常金（1969），男，博士，副教授，研究方向：农产品保鲜物流与加工，E-mail：。第 44 卷 第 19 期食品工业科技Vol.44 No.192023 年 10 月Science and Technology of Food IndustryOct.2023 changed obviously during storage,and Acinetobacter,Staphylococcus as well as Kurthia became the dominant bacteriaafter 2 days of storage.The selected representative spoilage bacteria were re-inoculated to the samples,one protease-producing Staphylococcus sciuri and the mixed bacteria had the strongest spoilage potential,because the TVB-N andviscosity increased greatly,while the hardness,springiness,and chewiness decreased significantly (P0.05).Scanningelectron microscopy revealed that the surface protein structure of the samples was distorted and many holes appeared.SDS-PAGE result showed that the band of soybean protein 7S subunit faded or disappeared,however,the bands below 25 kDawere deepened obviously and a new band appeared.FTIR showed that the soybean protein-sheet structure decreased,while the-turn structure increased.In conclusion,Staphylococcus sciur is identified as specific spoilage bacteria ofsoybean curd sheets during normal temperature storage,it provides a valuable reference for the spoilage bacteria control andprolong the product shelf-life.Keywords：soybean curd sheets；high-throughput sequencing；dominant spoilage bacteria；spoilage ability；protein structure 豆腐皮是一种廉价的优质蛋白质来源，富含不饱和脂肪酸、卵磷脂、大豆异黄酮和膳食纤维等多种营养物质1，在我国和东南亚人民的日常饮食中发挥着不可替代的作用2。由于豆腐皮生产卫生条件较差，且水分和蛋白含量很高，因此非常容易受到环境微生物的污染而腐败变质34。因此，为了保证食品安全，防止豆制品发生腐败变质是一个重要的研究课题5。尽管豆腐皮的菌群结构由大量微生物组成，但只有少数种类的微生物能导致产品品质发生不良变化，这些微生物被称为特定腐败微生物（SpecificSpoilage Organisms，SSOs）。食品中腐败菌的鉴定主要依赖传统培养分离鉴定，但此方法耗时耗力，且自然界中只有 0.1%3.0%的细菌可以培养6，故该方法对于豆制品腐败菌的研究存在较大的障碍。近年来，多种对于微生物核酸组分及基因序列的研究方法不断兴起，高通量测序技术则是其中的一种，已广泛应用于食品微生物的研究7。江杨阳等8将传统培养和高通量测序两种方法联合使用，更加精准地确定了小龙虾冷藏过程中的腐败菌变化，回接后发现一株气单胞菌的致腐能力最强。但目前将两种方法联合应用到非发酵豆制品的研究还较少。目前体外筛选抑菌药物来抑制 SSOs 的生长已成为筛选有效防腐剂的一种省时的方法9。为了识别细菌群落中的 SSOs，需要将分离的腐败菌回接到产品中，通过感官评定、菌落总数、pH、TVB-N、内源荧光强度和总巯基含量等指标共同确定微生物的腐败潜力1012。有学者研究了气单胞菌、嗜冷假单胞菌和腐败希瓦氏菌对无菌鲢鱼的腐败效果，发现嗜冷假单胞菌表现出最强的蛋白水解活性，导致可溶性肽和 TVB-N 含量的升高13。于淑池等14研究发现，在冷藏卵形鲳鲹的优势腐败菌中，致腐能力最强的是腐败希瓦氏菌。总之，阐明产品不同优势菌的腐败潜能，揭示细菌诱导产品变质的机理，可为体外筛选有效的食品防腐剂提供支撑。目前，关于豆制品的研究主要集中在优势菌的鉴定和保鲜技术开发等方面1517，而豆腐皮常温贮藏过程中微生物群落组成变化及不同优势菌的致腐能力还鲜有报道。基于此，本研究以豆腐皮为研究对象，通过传统 16S rDNA 鉴定结合高通量测序共同分析豆腐皮在常温贮藏过程中的菌群结构变化，通过回接确定豆腐皮的 SSOs，并阐明腐败菌对大豆蛋白的降解机制，为靶向抑制腐败菌的生长提供参考。1材料与方法 1.1材料与仪器豆腐皮购于宜家人超市，用冰袋在 30 min 内运输到实验室，置于 4 冰箱冷藏备用，实验前测得豆腐皮蛋白含量为 25.42%；干酪素、平板计数琼脂、LB 肉汤培养基（Luria-Bertani，LB）、甘油、阿拉伯胶、HCl-Tris 缓冲液（pH6.8、pH8.8）、十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）、30%凝胶储备液、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、考马斯亮蓝 R250天津索罗门生物科技有限公司；乙醇（75%）、硼酸、盐标液（0.01 mol/L）、二硫苏糖醇、甲醇、碳酸钾分析纯，天津市江天化工技术股份有限公司；冰乙酸（99.5%）分析纯，天津四海聚力科技有限公司；过硫酸铵分析纯，凯玛特（天津）化工科技有限公司；DNA 提取试剂盒天津泰进科技有限公司。ZHJH-C1109B 超净工作台上海智城分析仪器制造有限公司；UV-1800 紫外分光光度计上海美谱达仪器有限公司；HPS-25 型生化培养箱、HZQ-F160 全温震荡培养箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；PHSJ-4A pH 计梅特勒-托利多集团；TA-XT plus 质构仪英国 Stable Micro Systems 公司；IS50 傅里叶红外光谱仪美国 Thermo 公司；SU1510 扫描电子显微镜日本日立公司；FD 加热型冷冻干燥机上海欣谕仪器有限公司；TGL-21 型高速冷冻离心机四川蜀科仪器有限公司；XFS-280压力蒸汽灭菌锅浙江新丰医疗器械有限公司；Universal Hood 凝胶成像仪美国 Bio-Rad 公司。1.2实验方法 1.2.1 样品制备将购买的豆腐皮在无菌操作台中切成大小一致的薄片（约 5 cm5 cm），置于无菌袋中在 4 条件下保存备用。1.2.2 16S rDNA 鉴定样品在常温条件下储存两天腐败后，通过涂布 PCA 平板法对典型菌株进行分第 44 卷 第 19 期闫彦君，等：豆腐皮常温贮藏过程中菌相变化及优势菌致腐性分析 141 离和纯化。选择纯化后的单菌落进行革兰氏染色检验和菌种保藏。根据 DNA 提取试剂盒使用说明书提取基因组 DNA，使用细菌通用引物 27F 和 1492R对豆腐皮不同优势菌的 16S rDNA 片段扩增。先通过 1%琼脂糖凝胶电泳检验扩增产物，随后送往苏州金唯智生物技术有限公司测序。将测序结果上传至NCBI 网站（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）的 BLAST中进行比对，并为菌株申请序列号。通常，相似度大于 97%以上的序列被鉴定为相同的菌属。1.2.3 腐败菌产蛋白酶能力测定参考张利等18的方法制备酪素培养基（0.4%干酪素，0.107%Na2HPO47H2O，0.036%KH2PO4，1.7%琼 脂，121 灭 菌20 min），以测定相关菌株产蛋白酶情况。调整菌悬液浓度至 6 lg（CFU/g），将无菌滤纸片贴在酪素培养基表面，取 20 L 菌悬液于滤纸片上，然后置于常温条件下培养 72 h。培养结束后测量菌落直径及蛋白水解圈的直径，不同菌株的产蛋白酶能力通过 HC 的大小来判断，计算公式如下。HC=蛋白水解圈直径(cm)菌落直径(cm)1.2.4 高通量测序将豆腐皮贮藏在常温环境中，分别在第 0、1、2 d 时进行取样。将豆腐皮样品送至苏州金唯智生物技术有限公司，委托其进行基于Illumina MiSeq 测序技术的高通量测定。1.2.5 无菌豆腐皮的制备及接种无菌豆腐皮的制备参考 Li 等19的方法，略作修改。具体如下：将分割好的豆腐皮浸泡在 75%的乙醇中 30 s，然后在无菌蒸馏水中清洗 3 次，沥干水分后放入无菌培养皿中，在超净台中紫外灭菌 30 min。经平板计数培养，得到的无菌豆腐皮的菌落总数小于 2 lg（CFU/g）。挑取从豆腐皮中分离出的单菌落接种于 LB 肉汤中，于 37 培养 12 h 后得到菌液备用。将菌液在 4、9000 r/min 条件下离心 10 min，并用生理盐水重悬菌液，重复离心两次后再次重悬菌液，并调节浓度至 6 lg（CFU/g）。将无菌豆腐皮分别浸泡在不同菌悬液中 30 s 后取出并沥干水分，达到 4 lg（CFU/g）的接种水平。对照为浸泡在无菌生理盐水的样品，将所有接种好的豆腐皮置于无菌均质袋中，并在 25 培养箱中进行贮藏。1.2.6 菌落总数测定参照 GB 4789.2-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定测定豆腐皮菌落总数20。将 5 g 豆腐皮样品置于无菌均质袋中，加入 45 mL 生理盐水并用拍打式均质器拍打 90 s，制成 1:10（g:mL）的样品匀液，取 1 mL 该匀液于 9 mL 生理盐水中，制成 1:100 的样品匀液，并按照上述方法依次制备 10 倍系列稀释样品匀液。取 1 mL 适宜稀释度的样品匀液于培养皿中，倒入平板计数琼脂并摇动混匀，于 37 培养 48 h 后计算菌落总数。1.2.7 TVB-N 测定参照 GB 5009.228-2016食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定中微量扩散法测定样品 TVB-N21。将 10 g 研磨后的豆腐皮分散在 100 mL 蒸馏水中，期间不时摇晃浸渍30 min。混合物经过抽滤之后，收集滤液并冷藏备用，通过扩散皿测定 TVB-N 含量。1.2.8 pH 测定将 10 g 研磨均匀的豆腐皮与 100 mL蒸馏水混合并用拍打式均质器拍打 90 s，过滤后使用 pH 计测量样品的 pH。1.2.9 感官评分参考杨立娜等16对干豆腐的感官评价方法，略有改动。由食品学院的感官评价小组（共 10 人）根据表 1 对样品进行评分，每个成员单独进行，每评价完一个指标用清水漱口。总分=0.2色泽+0.3气味+0.3质地+0.2粘液程度，满分为 10 分。1.2.10 质构特性分析采用质构测定仪，测定样品的硬度、弹性、黏性、胶着性、咀嚼性和回复性。将样品切割成 2 cm2 cm 的小块，每个样品分别取10 块摞叠在一起放在载物台中心进行测定，每组样品测量 3 次。质构测定参数，探头：P100，测前速度：2 mm/s，测中速度：1 mm/s，测后速度：1 mm/s；形变量：35%；停留时间：5 s。1.2.11 微观结构观察将冻干后的样品切成小块，用锤子轻击使其自然断裂，粘样和镀金膜后通过扫描电子显微镜观察样品断面的微观形态结构。1.2.12 SDS-PAGE参照赖晗22的方法并根据试验稍作修改。将豆腐皮冻干后粉碎过 60 目筛，取1 g 粉末溶于 10 mL PBS（0.02 mol/L，pH8.5）磷酸盐缓冲液中，从中吸取 20 L 与上样缓冲液混合，沸水浴 5 min 后冷却至室温，10000 r/min 离心 5 min 制成样液。上述样液各取 10 L、Marker 取 5 L 上样，进行 SDS-PAGE 电泳。电泳时使用 5%的浓缩胶和 10%的分离胶，电压全程 80 V。电泳结束后将胶小心取出，先用考马斯亮蓝 R-250 溶液染色两个小时，再用甲醇-乙酸溶液脱色若干次，最后采用凝胶成像仪对胶进行拍照和分析。表 1 豆腐皮感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of soybean curd sheets项目02.52.655.17.57.610色泽20%深黄色暗黄色黄色稍深淡黄色气味30%严重臭味有异味豆香味较淡，无异味浓郁豆香味质地30%无弹性，质地变软弹性一般，质地变差弹性较好弹性好，质地紧密粘液程度20%黏手，拉丝明显稍有粘液表面微湿无粘液 142 食品工业科技2023 年 10 月 1.2.13 二级结构测定取 1 mg 冻干（过 60 目筛）样品和 150 mg KBr 使用玛瑙研钵研磨均匀后压片，采用傅里叶变换红外光谱对波段 4000600 cm1进行扫描。先使用 OMNIC 软件对图像进行校正并找到酰胺 I 带（17001600 cm1），然后使用 Peakfit V4.12 分析-螺旋、-折叠、-转角和无规卷曲的比例。1.3数据处理评价腐败菌致腐性的实验均重复三次，使用Origin 2018 软件进行作图，利用 SPSS 19.0 软件（IBM SPSS Statistics 23）中的 AVOVA 进行统计分析和方差分析，结果表示为平均值标准差，不同字母表示差异显著（P0.05）。2结果与分析 2.116S rDNA 鉴定及产蛋白酶能力比较 2.1.1 16S rDNA 鉴定从常温条件下贮存 2 d 腐败后的豆腐皮中分离出了 7 株具有典型形态的腐败菌，经革兰氏染色后发现有 6 株革兰氏阳性菌和1 株革兰氏阴性菌，测序后同源比对结果如表 2 所示。结果显示，腐败豆腐皮分离菌株中 NAT-1 与约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）有较高的同源性，NAT-2、NAT-3 和 NAT-7 与 松 鼠 葡 萄 球 菌（Staphylococcus sciuri）有较高的同源性，NAT-4、NAT-5 与库尔特氏杆菌（Kurthia populi）和吉氏库特菌（Kurthia gibsonii）有较高的同源性，NAT-6 与乙酰微小杆菌（Exiguobacterium acetylicum）有较高同源性。与以前的研究相比，本次研究中鉴定的腐败菌略有不同。目前的研究发现，豆制品中腐败菌主要有葡萄球菌、李斯特菌、芽孢杆菌和假单胞菌等2,4,15。据报道，生产及贮藏环境的不同会改变产品中微生物的分布情况23。所以鉴定结果有差异的原因可能是由于原料的生产和贮藏环境不同，导致产品被不同的微生物所污染。2.1.2 产蛋白酶能力比较酪蛋白筛选培养基中的营养物质可以作为菌株生长的能量来源，根据菌株产生的蛋白酶水解圈与菌落直径比值（HC）的大小来判断菌株的腐败能力是一种简单高效的办法24。如表 3 所示，NAT-3 和 NAT-7 的 HC 都大于 3，其他菌株都不产蛋白酶。腐败细菌产生的胞外蛋白酶通常参与腐败过程，导致产品腐败变质，相关研究表明气单胞菌25、沙雷氏菌18和热杀环丝菌26能分泌多种蛋白酶分解环境中的营养物质以获取能量。最近的研究发现，大多数葡萄球菌具有脂肪酶、蛋白酶和肽酶活性27，与本文的研究结果一致。因此，本研究结果表明两株葡萄球菌具有较高的蛋白水解潜力。2.2高通量测序结果采用高通量测序技术进一步确定豆腐皮在常温贮藏期间菌群结构的变化，豆腐皮菌属的相对丰度如图 1 所示。豆腐皮的微生物组成在第 0 d 时相对丰富，优势菌主要有土芽孢杆菌属（Geobacillus sp.78.8%），不动杆菌属（Acinetobacter sp.10%），钩端螺菌属（Leptospirillum sp.2.7%）和棒杆菌属（Coryne-bacterium sp.2.7%）等。土芽孢杆菌是一种革兰氏阳性嗜热细菌，大量产生的原因是豆腐皮的生产过程中经历了高温，不耐热的细菌被杀死2,28。豆腐皮的菌相组成在贮藏过程中发生了较大变化，微生物多样性逐渐降低，不动杆菌属（40.7%）仍为优势菌，葡萄球菌属（Staphylococcus sp.22.1%）和库特氏菌属（Kur-thia sp.21.1%）在两天内迅速增加，成为贮藏 2 d 时的优势菌。有学者对两条不同豆腐工业生产线的细菌污染情况进行了研究，发现葡萄球菌、冷杆菌、大球菌、芽孢杆菌和不动杆菌是各半成品中的优势菌属，这表明部分腐败菌是在生产过程中引入的28。李博等29研究了 37 贮藏时内酯豆腐优势菌群的变化，发现新鲜样品中的优势菌坚强芽孢杆菌在贮藏 1 d 后被屎肠球菌所代替，可以说明不同腐败菌之间对环境的适应能力不同。在本研究中，在新鲜样品中占绝对优势的土芽孢杆菌被葡萄球菌和库特氏菌所取代。不动杆菌在整个贮藏期一直都是优势菌，其对环境的适应性很强，广泛存在于各种食物中，包括蔬菜、饮料和动物原料3031。葡萄球菌是一种常见 表 2 豆腐皮分离菌株 16S rDNA 序列同源性分析Table 2 Homology analysis of 16S rDNA sequence of strains isolated from soybean curd sheets菌株编号碱基长度同源性（%）GenBank相似菌种GenBank登录号NAT-195599.47Acinetobacter johnsoniiOP703584NAT-2952100.00Staphylococcus sciuriOP703585NAT-396199.82Staphylococcus sciurOP703587NAT-490799.78Kurthia populiOP703586NAT-595599.79Kurthia gibsoniiOP703589NAT-698499.90Exiguobacterium acetylicumOP703590NAT-7962100.00Staphylococcus sciuriOP703591 表 3 不同菌株产蛋白酶能力比较Table 3 Comparison of protease-producing ability of each strain菌株NAT-1NAT-2NAT-3NAT-4NAT-5NAT-6NAT-7HC-3.00-3.25第 44 卷 第 19 期闫彦君，等：豆腐皮常温贮藏过程中菌相变化及优势菌致腐性分析 143 的食品污染物，可导致肉类蛋白质的分解。研究发现葡萄球菌是哈尔滨红肠贮藏初期的次要成员，但在货架期结束时成为了最主要的腐败菌32。由于微生物的代谢活动，新鲜的大豆制品是最容易腐烂的食物之一。在本研究中，不动杆菌属、葡萄球菌属和库特氏菌属是豆腐皮的优势菌属。012020406080100贮藏时间(d)相对丰度(%)OthersThermusStreptococcusCorynebacteriumLeptospirillumAerococcusBacillusEmpedobacterExiguobacteriumWeissellaCarnobacteriumEnterococcusPsychrobacterLactococcusChryseobacteriumPseudomonasMacrococcusStaphylococcusKocuriaAcinetobacterGeobacillus图 1 豆腐皮在常温贮藏过程中菌相变化Fig.1 Changes in the bacterial phases of soybean curd sheetsduring storage at normal temperature 上述研究结果表明，传统方法鉴定出的 7 株腐败菌全部在高通量测序中检测到，且大多都是数量较优势的菌属，但豆腐皮中优势菌的实际腐败能力尚未报道。为了控制腐败微生物、提高产品的货架期，确定不同优势菌的致腐能力及腐败机理，故根据分离过程中腐败菌的数量和蛋白酶产生能力，选取优势菌约氏不动杆菌（NAT-1）、吉氏库特菌（NAT-5）、松鼠葡萄球菌（NAT-7）及其混菌进行腐败潜能测定。2.3接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中菌落总数变化豆制品的新鲜度可通过菌落总数指标来判定。根 据 GB/T22106-2008 规 定，当 菌 落 总 数 高 于5.00 lg（CFU/g）时，代表豆腐皮不可食用。由图 2 可见，对照组的菌落总数在贮藏 2 d 内低于 1.00 lg（CFU/g），整个贮藏过程中始终低于 3.00 lg（CFU/g），这表明成功地制备了无菌豆腐皮。不同接种组的初始菌落总数在 4.224.49 lg（CFU/g）之间，适用于腐败能力的比较。接种 NAT-7 样品的菌落总数在贮藏前 2 d 增长较快，在贮藏 2 d 后各组增长减慢并趋于平缓，NAT-1、NAT-5、NAT-7 和 MIX 的菌落总数分别达 到 8.590.44、8.280.29、9.010.28 和 8.900.36 lg（CFU/g）。趋于平缓可能是因为豆腐皮中的营养物质被消耗，微生物代谢产物积累，微生物数量达到稳定25。有研究报道样品中的细菌数量应该达到 6 或 7 lg（CFU/g），以便产生足够的可以检测的代谢产物33。在本研究中，接菌后的豆腐皮贮藏 4 d 可以使腐败特性清晰可见。2.4接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中 TVB-N变化食品贮藏过程中蛋白质的降解主要是由细菌引起的，蛋白降解会产生氨及胺类等碱性挥发性含氮化合物34。它与高蛋白食品的新鲜度密切相关，值越高说明腐败越严重，现已被广泛用于评估 SSOs 的腐败潜力35。由图 3 可知，各组第 0 d 时 TVB-N 值均在5.20 mg/100 g 左右，不同接种组的 TVB-N 水平在贮藏过程中均呈上升趋势。NAT-1 和 NAT-5 组的TVB-N 产 量 较 低，而 接 种 NAT-7 和 MIX 组 的TVB-N 含量在贮藏期间迅速增加，在第 4 d 分别达到了 51.77 mg/100 g 和 26.91 mg/100 g，显著高于对照和其他接种组（P0.05）。刘舒彦等36研究发现，在加州鲈鱼的优势腐败菌中，分解鱼肉蛋白能力最强的是巴氏葡萄球菌，且贮藏 24 h 后 TVB-N 含量达到 160 mg/100 g。还有学者发现嗜冷假单胞菌具有很强的蛋白水解活性，其 TVB-N 产量最高，原因是蛋白质交联被菌体产生的蛋白酶破坏，释放出氨基酸和生物胺13。故 NAT-7 产 TVB-N 能力最强可能归因于其具有较强的蛋白水解活性，混菌样品贮藏第4 d 时的 TVB-N 值仍然很高，说明 NAT-7 在少量存在时也可以导致蛋白质降解生成 TVB-N。6050403020100012345贮藏时间(d)对照NAT-1NAT-5NAT-7MIXTVB-N(mg/100 g)aaaabbcbbcbcdcdcddd图 3 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中 TVB-N 变化Fig.3 Changes of TVB-N in soybean curd sheets inoculatedwith different spoilage bacteria during storage at normaltemperature 2.5接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中 pH 变化 1008162432405菌落总数(lg(CFU/g)贮藏时间(d)对照NAT-1NAT-5NAT-7MIXaaaaaaabababababbccccbbbb图 2 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中的菌落总数变化Fig.2 Changes of total number of colonies in soybean curdsheets inoculated with different spoilage bacteria during storageat normal temperature注：同一贮藏时间字母不同表示差异显著（P0.05），图 3图 5 同。144 食品工业科技2023 年 10 月对照及接种组 pH 的变化如图 4 所示。由图可见，各组的初始 pH 为 7.10，对照组在整个贮藏过程中变化不大。接种 NAT-1、NAT-5、NAT-7 和 MIX的样品 pH 在前 2 d 下降到 6.726.90，然后在贮藏第 4 d 时分别上升到 7.07、6.84、7.38 和 7.22。接种 NAT-7 样品在贮藏第 4 d 时的 pH 显著高于其他组（P0.05）。其他研究人员也报告了类似的趋势37，pH 最初降低可能与一些微生物能利用豆腐皮中的碳水化合物、糖类和其他营养物质产生酸类物质有关，而贮藏后期 pH 升高可能跟微生物的代谢导致蛋白质和氨基酸分解产生碱性物质有关38。值得注意的是，在上文的研究中 NAT-7 在贮藏结束时表现出最高的产 TVB-N 能力，验证了碱性物质的积累使 pH提高。7.67.47.27.06.86.6012345贮藏时间(d)对照NAT-1NAT-5NAT-7MIXpHaaaabbbbbcbcbcccccccdddd图 4 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中 pH 变化Fig.4 Changes of pH in soybean curd sheets inoculated withdifferent spoilage bacteria during storage at normal temperature 2.6接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中感官评分变化腐败微生物可以加速豆制品中蛋白质和氨基酸的降解，代谢产物逐渐积累使豆制品出现色泽、质地变差，散发胺臭味等腐败变质现象，感官评分是评价豆制品品质的重要指标。由图 5 可知，在贮藏期间所有组的感官评分均呈现下降的趋势，接种组的感官评分显著低于对照组（P0.05）。对照组贮藏第4 d 时的感官评分为 7.31，而接种 NAT-7 和 MIX 组在贮藏 4 d 时产品显示出较高的腐败，豆腐皮变得极软且粘手，散发出令人拒绝的胺臭味，得分分别达到1.14 和 2.37。感官评分结果表明，松鼠葡萄球菌的腐败能力最强，可能与其产蛋白酶破坏豆腐皮中的蛋白质有关，与其他学者的研究结果一致36。1086420012345贮藏时间(d)对照NAT-1NAT-5NAT-7MIX感官评分aaaabbbbbbbcbbbccccdd图 5 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中感官评分变化Fig.5 Changes of sensory score in soybean curd sheetsinoculated with different spoilage bacteria during storage atnormal temperature 2.7接种不同腐败菌豆腐皮质构特性变化质构是影响消费者接受大豆产品的一个重要参数。不同处理组在常温贮藏期间质构的变化如表 4所示。结果表明，对照组和接种 NAT-1 的质构特性在贮藏过程中变化不大。而 NAT-7 显著改变了豆腐皮的质构特性（P0.05），硬度、弹性、胶着性、咀嚼性和回复性分别下降了 74.58%、51.61%、89.77%、95.45%和 75.93%，黏性增加了 46450.00%，在感官评价环节豆腐皮变得松散且粘手，此处验证了该变化。接种混菌的样品变化趋势与 NAT-7 一致，但是破坏程度低于 NAT-7。产蛋白酶的 NAT-7 改变了豆腐皮的质构特性，这与两株产蛋白酶的芽孢杆菌能 表 4 接种不同腐败菌豆腐皮常温贮藏过程中质构变化Table 4 Changes of texture in soybean curd sheets inoculated with different spoilage bacteria during storage at normal temperature样品名称贮藏时间（d）硬度（g）黏性（g.sec）弹性胶着性（g）咀嚼性（g）回复性对照01790.0656.81a0.020.01b0.940.01a1574.6735.45a1464.8954.01a0.550.01a21717.81228.21a0.100.05b0.930.01a1534.0231.40a1432.5120.51a0.560.01a41748.0947.26a0.830.06a0.930.01a1572.0524.62a1454.1925.64a0.550.01aNAT-101793.1772.50a0.020.01c0.950.01a1561.5444.15a1456.0961.63a0.550.01a21717.81228.21a0.540.10b0.940.02ab1543.71204.69a1446.27222.50a0.540.01a41711.7872.69a1.100.05a0.910.01c1511.2881.57a1484.6025.30a0.530.01aNAT-501819.6643.29b0.020.02c0.940.02a1563.1551.40b1485.4033.74b0.550.02a21688.34297.67b0.930.12b0.890.05a1518.01253