犊牛大肠杆菌分离鉴定与药敏试验.pdf

农业工程技术综合版 2023 年 7 月刊4040科 研 试 验犊牛大肠杆菌分离鉴定与药敏试验党 媛（青海省西宁市湟源县畜牧兽医站，青海 湟源 812100）摘要:为了进一步明确犊牛腹泻的具体致病原，并掌握大肠杆菌分离鉴定和药敏试验操作方法，该研究从某发病养殖场中采集死亡犊牛脏器组织和病变组织进行了大肠杆菌分离鉴定与药敏试验。根据试验结果可以判定致病原为大肠杆菌，此次分离菌株具有致病性，对多种抗生素低敏，仅个别抗生素呈高敏。今后开展犊牛腹泻疾病诊治中需进行有效病原分离鉴定，筛选出敏感抗生素，以确保治疗效果。关键词:犊牛；大肠杆菌病；分离鉴定；药敏试验；致病性；染色镜检；菌落党 媛.犊牛大肠杆菌分离鉴定与药敏试验 J.农业工程技术，2023，43(19):40 41.犊牛出生后机体免疫力较弱，肠胃消化功能不完善，加上不良饲养管理和应激刺激等，会为致病性大肠杆菌侵袭提供有利条件。在犊牛出生后前 2 周内易感染大肠杆菌，感染后可能出现严重腹泻和败血症，死亡率高达 30%以上。为掌握犊牛大肠杆菌病分离鉴定方法，明确分离所得大肠杆菌的耐药性，从某发病养殖场采集病变组织进行了大肠杆菌分离鉴定与药敏试验。1 试验材料与方法1.1 试验材料试验材料为青海省湟源县某养殖场死亡犊牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结组织。大肠杆菌分离鉴定中涉及的试剂培养基和仪器主要有营养肉汤、普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、SS 琼脂培养基、高压灭菌蒸汽锅、革兰氏染色剂、恒温培养箱、载玻片、药敏片、普通光学显微镜、无菌超净工作台。1.2 试验方法1.2.1 细菌分离鉴定。将采集到的病料粉碎后添加到营养肉汤中，置于恒温箱内 37持续培养 48 h。从营养肉汤中取少量沉淀物，划线接种到营养肉汤、普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、SS 琼脂培养基上，置于恒温箱内 37持续培养 48 h。小心挑取分离得到的致病菌，菌落用革兰氏染色剂充分染色后观察菌落形态。将分离菌落制成悬浊液注射到小白鼠体内，观察其致病性。1.2.2 药敏试验。从麦康凯琼脂培养基上分离得到纯化的细菌，将其涂布在琼脂平板上，贴上药敏纸片 37培养 24 h 观察抑菌圈大小。2 结果与分析2.1 肉汤培养结果大肠杆菌在肉汤培养基中生长时通常会形成悬浮物，使培养液变浑浊，肉眼观察发现试验营养肉汤培养基透明无色或淡黄色，没有任何可见沉淀或结块。大肠杆菌代谢过程产生的气体积聚通常会出现气泡，本次肉汤表面有少量气泡。某些大肠杆菌菌株可以产生硫化物，营养肉汤培养基中观察到黑色沉淀1。综合判断可能有大肠杆菌存在，但需要注意的是这些特征并不是绝对判定标准，还需进一步采取其他检测手段确认是否存在大肠杆菌，如进行生化试验。2.2 菌落形态普通营养琼脂培养基上菌落生长良好，灰白色，光滑，圆形或稍扁平，直径 2 4 mm。麦康凯琼脂培养基上生长出淡黄色、淡粉色、红色菌落，光滑，圆形或稍扁平，直径 2 4 mm。伊红美蓝琼脂培养基上菌落也能生长，但由于该培养基含有某些抑菌剂，菌落呈蓝色、紫色，直径 2 4 mm。SS 琼脂培养基是常用于分离肠道杆菌科细菌的培养基，大肠杆菌在该培养基上也能够生长，菌落淡黄色，光滑，圆形或稍扁平，直径 2 4 mm2 3。2.3 染色镜检大肠杆菌的菌落形态和染色结果判定是常见微生物鉴定方法，大肠杆菌菌落形状通常为圆形或不规则形，菌落边缘整齐光滑，但也可能呈不规则边缘。普通营养琼脂培养基上大肠杆菌菌落颜色通常为乳白色或淡黄色，麦康凯琼脂培养基上菌落呈粉红色或淡红色。大肠杆菌革兰染色中会显现出革兰阴性特征，即显微镜下呈粉红色至红色。大肠杆菌细胞壁相对较薄，由外层膜、细胞壁和细胞膜组成。革兰氏染色时，先用紫色革兰染色剂染色，然后用碘酒定色，再用酒精洗去多余染料，最后用红色染料（如苏木素）染色。显微镜下观察，大肠杆菌呈红色或粉红色2.4 致病性将分离得到的菌落制作成悬浊液注射到小白鼠体内，同时设置对照组注射生理盐水，注射剂量均为 0.2 mL，注射 18 h 后试验组小白鼠全部死亡，表现出严重肝周炎，可以判定分离的大肠杆菌具有致病性。2.5 药敏试验大肠杆菌药敏试验是用来测试大肠杆菌对不同抗生素的敏感性的试验。大肠杆菌药敏试验通常采用纸片扩散法（Kirby-Bauer 法）或微量稀释法（MIC 法）。纸片扩散法是将含有不同抗生素的纸片放置在培养基上，通过观察菌落周围的抑制圈大小来判断菌株对抗生素的敏感性，抑制圈直径大表示菌株对该抗生素敏感；抑制圈小则表示菌株对该抗生素耐药。本次研究选择头孢他定、头孢哌酮、红霉素、强力霉素、氨苄西林、环丙沙星、DOI:10.16815/ki.11-5436/s.2023.19.022农业工程技术综合版 2023 年 7 月刊4141科 研 试 验抗生素种类抑菌圈直径（mm）结果判定头孢他定22高敏头孢哌酮15中敏红霉素7低敏强力霉素8低敏氨苄西林4低敏头孢拉定4低敏米诺环素23高敏复方新诺明6低敏四环素5低敏多西环素6低敏头孢曲松24高敏头孢呋辛18中敏头孢唑啉23高敏3 王 娜，戴伶俐，乌云塔娜，等.内蒙古锡林郭勒盟犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性试验 J.畜牧与饲料科学，2021，42(6):106 111.头孢拉定、米诺环素、复方新诺明、四环素、多西环素、头孢曲松钠、头孢呋辛，头孢唑啉等 14 种抗生素进行药敏试验。试验结果详见表 1，可知高敏抗生素种类相对较少，大多数抗生素呈低敏或中敏。3 结论本次试验表明，从发病养殖场中所采集的病料中含有大肠杆菌，并且分离得到的大肠杆菌具有致病性。此外，本次分离的大肠杆菌对大多数抗生素都产生了耐药性药物，呈低敏或重敏；仅个别抗生素对大肠杆菌具有高敏反应。在今后开展犊牛大肠杆菌病防控中，要严格开展病原分离鉴定，明确病原种类，筛选出敏感抗生素进行针对性治疗，才能在短时间内控制病情。参考文献1 郭永恒.犊牛腹泻性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验 J.中国牛业科学，2020，46(6):15 16.2 安洪勇，夏 欢，张 雪，等.犊牛腹泻大肠杆菌的分离及鉴定J.上海畜牧兽医通讯，2019(4):47 49.（上接第 39 页）3 结论与讨论试验结果表明，应用秸秆复合化饲料后，肉牛肌肉内 UFA含量有所增加，但不明显。同时，增加秸秆复合化饲料占比后会改变肉牛脂肪酸不饱和度，原因是秸秆复合化饲料内存在亚麻酸，肉牛通过交换棕榈烯酸与硬脂酸的方式，对肉牛肌肉脂肪酸不饱和度进行调节。结果显示，试验组 A 肉牛的 -亚麻酸明显比试验组 C、对照组低，试验组 B 肉牛花生四烯酸明显比其他组肉牛低，各组 UFA 差异性不明显。综合可知，秸秆复合化饲料喂养肉牛能够明显增加肉牛肌肉 IMF 含量，但相比玉米青贮饲养，对肉牛肌肉 SFA、MUFA、UFA、PUFA含量的影响并不明显，而花生四烯酸、-亚麻酸等部分n-6 PUFAs变化较大。因此饲养肉牛时，加入不同比例秸秆复合化饲料，对肉牛肌肉脂肪酸含量与脂肪沉积影响并不显著，秸秆复合化饲料对肉牛养殖并无不良影响，可在肉牛喂养中被广泛使用。参考文献1 俸祥仁，刘 伟，银慧慧，等.肉牛用蔗梢、秸秆与木薯渣复合发酵饲料技术示范与推广 EB/OL.广西壮族自治区，广西南宁强微农牧科技有限公司，2020.https:/ 岳 丽，王 卉，山其米克，等.复合菌种固态发酵法提高甜高粱秸秆饲料品质的研究 J.饲料工业，2019，40(5):34 39.表 1 肉牛肌肉 IMF 与脂肪酸含量表 1 药敏试验结果脂肪酸试验组 A试验组 B试验组 C对照组SFA（%）49.652.5345.240.1345.874.3247.460.75IMF（%）2.170.122.340.112.390.072.260.18MUFA（%）35.374.6842.473.4543.815.3740.171.49UFA（%）49.262.6553.831.8753.284.7751.820.70PUFA（%）13.882.0511.371.769.480.9811.661.47n-3 PUFAs（%）2.070.771.680.621.690.571.570.55n-6 PUFAs（%）10.180.688.681.037.240.719.340.52n-6:n-35.321.495.612.184.611.526.482.13PUFA:SFA0.290.070.220.030.190.020.230.02SFA:UFA1.020.120.850.060.860.140.930.02MUFA:PUFA2.630.683.840.884.690.933.490.48MUFA:SFA0.290.050.220.030.190.020.230.02