顶空-气相色谱法测定阿糖胞苷原料药中基因毒杂质氯甲烷和氯乙烷.pdf

，评价技术与方法 作者简介 杨海洋，男，硕士，研究方向：药物分析。：通讯作者 林妮妮，女，博士，研究方向：药物分析、痕量杂质检测。：顶空 气相色谱法测定阿糖胞苷原料药中基因毒杂质氯甲烷和氯乙烷杨海洋，王策，林妮妮（北京新领先医药科技发展有限公司，北京 ）摘要 目的：建立一种准确测定阿糖胞苷原料药中基因毒杂质氯甲烷和氯乙烷含量的气相色谱方法。方法：采用顶空气相色谱法，以氢火焰离子化检测器（）为检测器，毛细管柱为色谱柱，二甲基甲酰胺（）为溶剂。检测器温度为 ，进样口温度为 ，柱温为程序升温。顶空平衡温度为 ，顶空平衡时间为 。结果：氯甲烷和氯乙烷分别在 和 范围内呈现良好的线性，相关系数 分别为 和 ；检测限浓度分别为 和 ；低、中、高 个浓度的加标回收率分别介于 、间；重复性试验的相对标准偏差分别为 和 。氯甲烷和氯乙烷的系统适用性、专属性和进样精密度均良好。结论：本方法操作简单，灵敏度高，成本较低，在阿糖胞苷原料药中的氯甲烷和氯乙烷的质量控制具有重要的现实意义，对于盐酸盐类原料药中氯甲烷、氯乙烷的质量控制具有重要参考价值。关键词 顶空 气相色谱；阿糖胞苷；基因毒杂质；盐酸盐原料药；氯甲烷；氯乙烷 中图分类号 文献标志码 文章编号 （），（，）：（）：（），（），：，、（，），：，；阿糖胞苷（）为嘧啶类抗代谢药物，属于盐酸盐类原料药，其作用机理是通过抑制细胞 的合成干扰细胞增殖，是目前治疗急性髓细胞白血病最常用药物之一 ，。在其生产、提取、纯化过程中会使用甲醇、乙醇作为溶剂，当工艺中使用盐酸时，盐酸会和甲醇、乙醇发生亲核取代反应，生成氯甲烷和氯乙烷，故原料药中可能有氯甲烷和氯乙烷的残留。年第 卷第 期氯甲烷与氯乙烷是盐酸盐类原料药中常见的需要 控 制 的 杂 质，属 于 卤 代 烷 烃，具 有 基 因 毒性 。基因毒性杂质是一种有着重大安全风险的杂质，即使在较低浓度下，也可能诱导基因突变和染色体损伤，甚至导致癌症并危及生命。为此，各国相关机构对基因毒性杂质的研究愈加重视，并相继出台相关指导原则 ，中国药典 年版（四部）中也新增 遗传毒性杂质控制指导原则 ，。目前关于阿糖胞苷的含量测定和有关物质研究已有较多文献报道 ，但未见阿糖胞苷原料药中氯甲烷与氯乙烷检测的相关报道。本文参考 指导原则 ，根据毒理学关注阈值（），制定氯甲烷和氯乙烷的限度分别为 和 ；采用顶空 气相色谱法，建立测定阿糖胞苷原料药中氯甲烷和氯乙烷的检测方法，该方法操作简单，灵敏度高，成本较低，在其质量控制方面具有重要的现实意义，为盐酸盐类原料药中氯甲烷、氯乙烷的检测提供技术参考。材料与方法 仪器与试剂 型气相色谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；型气相色谱仪 岛津（中国）有限公司；型电子分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有 限 公 司；阿 糖 胞 苷 原 料 药（批 号：、）由新领先医药科技有限公司提供；氯甲烷（批号 ，纯度 ）购自萨恩化学技术（上海）有限公司；氯乙烷（批号 ，纯度 ）购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；，二甲基甲酰胺（批号 ，色谱纯）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。溶液配制单一贮备母液：精密称取氯甲烷、氯乙烷各适量，分别用 ，二甲基甲酰胺溶解并定量稀释，制成每 各约含 氯甲烷和 氯乙烷的溶液。贮备液：精密量取单一贮备母液各 ，置 量瓶中，定容稀释至刻度，摇匀，即得。对照品溶液：精密量取贮备液 ，置 量瓶中，定容稀释至刻度，摇匀，即得。供试品溶液：精密称取本品约 ，置顶空瓶中，精密加入 ，二甲基甲酰胺 ，密封。色谱条件使用 （）毛细管色谱柱；载气流量为 ；分流比为 ；进样口温度为 ；检测器为氢火焰离子化检测器（）；检测器温度为 ；升温程序：初始柱温，维持 ，以 速率升温至 ，维持 ；进样方式为顶空进样；顶空平衡温度为 ，顶空平衡时间为 。结果与分析 系统适用性和专属性试验精密量取空白溶液 ，置顶空瓶中，密封，连同“”项下对照品溶液、供试品溶液，照“”项下色谱条件进样并记录色谱图（图 ）。由图 可知，空白溶液、供试品均不干扰氯甲烷、氯乙烷的检测；各待测物的理论板数均不低于 ，拖尾因子均接近 ，说明本法检测各待测物的系统适用性和专属性均良好。：对照品溶液（：氯甲烷；：氯乙烷）；：空白溶液；：供试品溶液图 专属性考察气相色谱图 ，评价技术与方法 灵敏度试验精密量取上述单一贮备母液各适量，逐级稀释，照“”项下色谱条件进样分析，分别以信噪比（）约 和 作为定量限溶液和检测限溶液。结果：氯甲烷、氯乙烷定量限浓度分别为 、，检测限浓度分别为 、。线性试验以定量限溶液为 号线性溶液，精密量取上述贮备液 、和 ，分别置于 量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得 号线性溶液。精密量取各线性溶液 ，分别置顶空瓶中，密封，照“”项下色谱条件测定，并记录峰面积。以对照品浓度为 ，以峰面积为 ，进行线性回归，氯甲烷的线性方程为 ，相关系数 ；氯乙烷的线性方程为 ，相关系数 ，说明本法检测氯甲烷在 浓度范围内，线性关系良好，氯乙烷在 浓度范围内，线性关系良好。进样精密度试验精密量取上述对照品溶液 ，置顶空瓶中，密封，平行配制 份。照“”项下色谱条件连续进样，并记录色谱图。结果显示，氯甲烷和氯乙烷保留时间的 分别为 （）和 （），峰面积的 分别为 （）和 （），表明本方法具有良好的进样精密度。回收率试验精密量取上述贮备液 、和 ，分别置 量瓶中，用 ，二甲基甲酰胺溶解并稀释至刻度，摇匀，制成低浓度、中浓度和高浓度的溶液。精密称取样品约 ，共份，分别置顶空瓶中，每份为 组，分别精密加入低、中、高浓度溶液 ，密封。照“”项下色谱条件进样，记录色谱图。结果如表 所示，按外标法以峰面积计算，氯甲烷和氯乙烷的平均回收率分别为 （，）和 （，），表明本方法检测本品中氯甲烷、氯乙烷准确性良好。表 氯甲烷、氯乙烷回收率结果（）待测物称样量（）测得（）回收率（）平均回收率（）（）氯甲烷 氯乙烷 重复性试验取 份供试品，每份约 ，精密称定，分别置顶空瓶中，精密加入上述中浓度的溶液 ，摇匀使溶解，密封。照“”项下色谱条件连续进样，记录色谱图。与“”项下中浓度回收率试验结果一同计算重复性。结果显示，氯甲烷和氯乙烷测定结果的 分别为 （）、（），表明本法具有良好的重复性。样品测定取 批（批、批、批）原料药，按照“”项中的方法配制供试品溶液，进样测定。按外标法以峰面积计算样品中各待测物的检出 年第 卷第 期量，结果 批样品中氯甲烷和氯乙烷均未检出。讨论与结论 溶剂的选择考虑到二甲基亚砜在酸性条件下，顶空加热至 以上易分解为甲硫醚、二甲基二硫醚和甲硫醇，可能引入杂质峰干扰测定。在建立盐酸盐类原料药的顶空 气相色谱检测方法时，应避免使用二甲基亚砜做溶剂，可选用水、，二甲基甲酰胺等做溶剂。由于氯甲烷、氯乙烷微溶于水，故本研究采用 ，二甲基甲酰胺作为溶剂。不同色谱柱、仪器考察本实验采用两个不同厂家的色谱柱 （）毛 细 管 柱、（）毛细管柱进行测定，结果该方法能很好地分离氯甲烷和氯乙烷（理论塔板数均大于 ，拖尾因子均接近 ），且空白、供试品溶液均不干扰各待测物检测；样品中各待测物均无检出。更换岛津公司的气相色谱仪（型号，）测定，结果各待测物系统适用性良好，检测不受干扰且供试品中未检出，表明此方法具有良好的色谱柱耐用性和仪器耐用性。顶空平衡温度、时间考察顶空平衡温度和时间都会影响顶空瓶内样品在进样时的气液平衡状态 ，进而可能影响待测物的检测灵敏度和样品的检出情况。一般提高顶空平衡温度或延长顶空平衡时间，可提高待测物的检测灵敏度。本实验考察了在不同顶空温度（、）平衡 后进样对各待测成分响应的影响，结果发现：提高顶空平衡温度可增大氯甲烷和氯乙烷的响应。综合考虑待测物的灵敏度、仪器性能参数、节约能源等因素，最终选择 作为顶空平衡温度。此外，本实验以 为平衡温度，考察了平衡 、后进样对各待测成分响应的影响，最终选择顶空平衡时间为 。结论成盐可以改善药物分子的理化性质和稳定性，是提高其成药性的有效手段之一。在美国 上市的药物中，候选药物以盐型上市约占总上市药物数量的 以上。盐酸是与碱性药物成盐时使用频率最高的酸之一，所有碱性药物盐中约 是盐酸盐。甲醇、乙醇是生产、提取、纯化过程常用的溶剂。因此，氯甲烷和氯乙烷是原料药中常见的需要控制的杂质之一。本研究采用顶空 气相色谱技术，建立了测定阿糖胞苷原料药中氯甲烷和氯乙烷的检测方法，并对其方法学参数进行验证。结果表明，此方法系统适用性、专属性、灵敏度、线性、精密度、准确性、重复性、耐用性均良好，可用于准确检测阿糖胞苷原料药中氯甲烷和氯乙烷的残留量。目前有采用气相色谱法检测药品中氯甲烷和氯乙烷的报道 ，但未见阿糖胞苷中相关检测报道。本方法采用顶空 气相色谱技术建立氯甲烷和氯乙烷的检测方法，具有操作简单、成本低的特点，较气相色谱质谱联用法 更能满足实际检样需求；在满足检测灵敏度的同时，适当增大分流比，以降低大批量检样时仪器的维护成本。总之，本法操作简单、灵敏度高，检测成本较低，在阿糖胞苷原料药的质量控制方面具有非常重要的现实意义，对于盐酸盐类原料药中氯甲烷、氯乙烷的质量控制具有重要的参考价值。参考文献 刁连君 大剂量阿糖胞苷治疗成人急性髓系白血病疗效及不良反应分析 山西大同大学学报（自然科学版），（）：王继芳，魏秀丽 氟达拉滨联合阿糖胞苷治疗急性髓系白血病疗效观察 新乡医学院学报，（）：（）（）（）：（）：，（），（）：文海若，闫明，王亚楠，等 药物杂质遗传毒性评价策略与监管研究 中国药事，（）：徐昕怡，许华玉，尚悦，等 中国药典 年版第四部通用技术要求增修订概况 中国药品标准，（）：国家药典委员会 中华人民共和国药典 年版（四部）年版，北京：中国医药科技出版社，：海丽萍，杨东菁，王志远，等 法同时测定盐酸阿糖胞苷原料药的含量和有关物质 中国药房，（）：梁蔚阳 高效液相色谱法测定阿糖胞苷注射液中有关物质的含量 药物生物技术，（）：朱震海，蔡嵘，宣栋睴 顶空温度和平衡时间对顶空气相色谱法测定水中卤代烃结果的影响 中国卫生检验杂志，（）：朱峰，黄静，王勇军，等 气相色谱法测定盐酸贝西沙星中氯乙烷残留量 常州大学学报，（）：朱静，吴臖，戴冬艳 顶空 气相色谱法测定盐酸西替利嗪中氯甲烷和氯乙烷 山东化工，（）：郑梅，郑枫，柳文媛 法测定盐酸右美托咪定中氯甲烷和氯乙烷的残留量 中南药学，（）：（收稿日期：）