调控配位不饱和位点增强锆基金属有机框架纳米酶的蛋白水解酶活性及应用.pdf

基金项目：湖南省教育厅研究项目（编号：）；湖南省自然科学基金（编号：，）；泰 山 产业领军人才项目（编号：）作者简介：许珂宇，女，长沙理工大学在读硕士研究生。通信作者：许宙（），男，长沙理工大学副教授，博士。：收稿日期：改回日期：犇 犗 犐：犼 狊 狆 犼 狓 文章编号 （）调控配位不饱和位点增强锆基金属有机框架纳米酶的蛋白水解酶活性及应用 ：许珂宇犡犝犓 犲 狔 狌夏利伟犡 犐 犃犔 犻 狑 犲 犻邢克宇犡 犐 犖犌犓 犲 狔 狌程云辉，犆犎犈犖犌犢 狌 狀 犺 狌 犻，许宙犡犝犣 犺 狅 狌（长沙理工大学食品与生物工程学院，湖南 长沙 ；齐鲁工业大学食品科学与工程学院，山东 济南 ）（犛 犮 犺 狅 狅 犾 狅 犳犉 狅 狅 犱犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲犪 狀 犱犅 犻 狅 犲 狀 犵 犻 狀 犲 犲 狉 犻 狀 犵，犆 犺 犪 狀 犵 狊 犺 犪犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔狅 犳犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲牔 犜 犲 犮 犺 狀 狅 犾 狅 犵 狔，犆 犺 犪 狀 犵 狊 犺 犪，犎 狌 狀 犪 狀 ，犆 犺 犻 狀 犪；犛 犮 犺 狅 狅 犾 狅 犳犉 狅 狅 犱犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲犪 狀 犱犈 狀 犵 犻 狀 犲 犲 狉 犻 狀 犵，犙 犻 犾 狌犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔狅 犳犜 犲 犮 犺 狀 狅 犾 狅 犵 狔，犑 犻 狀 犪 狀，犛 犺 犪 狀 犱 狅 狀 犵 ，犆 犺 犻 狀 犪）摘要：目的：开发高效稳定的蛋白水解酶纳米酶，研究配位不饱和位点与肽键水解活性的关系。方法：制备种不同配位（配位）不饱和位点的锆基金属有机框架纳米酶（纳米酶）调控蛋白水解酶活性。以双甘肽（）水解率为指标，评估种 纳米酶的蛋白水解酶活性。随后，使用性能最优的蛋白水解酶纳米酶水解大豆蛋白、鱼糜蛋白和酪蛋白，利用 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离水解产物，通过考马斯亮蓝对分离的条带染色，考察人工蛋白酶对种蛋白的水解效率。结果：在种不同配位不饱和位点 纳米酶中，配位 纳米酶的蛋白水解酶活性最高，水解率为 。与非催化水解相比，水解反应速率提高了 倍。蛋白水解酶纳米酶可水解食品工业中种常见的蛋白质，对鱼糜蛋白的水解效率最高。结论：通过调控 纳米酶的配位不饱和位点可以增强蛋白水解酶活性。关键词：金属有机框架；配位不饱和位点；蛋白水解酶；水解；肽键犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋：犗 犫 犼 犲 犮 狋 犻 狏 犲：犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊：（）（，）（），犚 犲 狊 狌 犾 狋 狊：，（），犆 狅 狀 犮 犾 狌 狊 犻 狅 狀：犓 犲 狔 狑 狅 狉 犱 狊：；微生物蛋白酶是食品工业中的主要酶类之一，占整个酶类市场的。然而，微生物生产蛋白酶仍存 第 卷第期 总第 期 年月在许多问题，如菌种培育操作复杂、环境要求严格、纯化过程繁琐、生产成本高昂等。此外，在贮藏和应用过程中，值和温度条件更是严重限制了微生物蛋白酶在工业中的发展。由于纳米酶不具有蛋白质结构，所以各种环境因素（如 值和温度）对纳米酶的催化活性中心造成的破坏性较小。因此，纳米酶具有高选择性、稳定性和潜在可回收性，可以降低食品工业中酶催化的经济成本。蛋白水解酶纳米酶是一种具有蛋白水解酶活性的纳米酶，已 在 寡 肽 和 蛋 白 质 水 解 过 程 中 显 示 出 高 选 择性。然而，这些蛋白水解酶纳米酶的活性相对较低，严重阻碍了蛋白水解酶纳米酶的实际应用。金属有 机框 架（）是 一 种 新 兴的 多 孔 纳 米 材料 ，是由金属离子或金属团簇和多种有机配体通过配位构建的 。因此，通过改变金属团簇和有机配体类型，的结构和性能（如纳米级孔隙率、高表面积、良好的热稳定性和均匀的空腔结构）可以被调整。目前，作为催化剂已被用于肽键的水解 。然而，大多数 中金属离子与有机配体完全配位，这种微观 结 构 阻 碍 了 对 肽 的 吸 附，严 重 影 响 了 的催化性能。有研究 表明，的催化性能可以通过改变缺陷而被提高，而不同的缺陷可以通过调整配位不饱和金属位点（）来实现。最常见的 调控方法是在 合成过程中使用不同的有机配体。研究拟通过简便的水热法制备种具有不同配位不饱和位点的 纳米酶（配位 、配位 和 配 位 ），利 用 扫 描 电 子 显 微 镜（）、动态光散射（）、傅里叶变换红外光谱（）和射线衍射（）来表征 纳米酶的特征。以双甘肽（）水解率为指标，评估种 纳米酶的蛋白水解酶活性，并于食品工业中种常见的蛋白质（大豆蛋白、鱼糜蛋白和酪蛋白）中验证 纳米酶的实际应用能力，以期为食品工业中蛋白水解提供技术支撑。材料与方法材料与仪器材料与试剂四氯化 锆（）、八 水 合 二 氯 氧 化 锆（獉）、对苯二甲酸（）、均苯三甲酸（）、，：，三联苯，四甲酸（）：北京百灵威科技有限公司；大豆分离蛋白、酪蛋白、鱼糜蛋白、犖，犖二乙基甲酰胺（）、苯异硫氰酸酯（）：上海麦克林科技有限公司；犖，犖二甲基甲酰胺（）、无水乙醇、溴化钾、甲醇、甲酸、乙腈、三乙胺、正己烷、醋酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。主要仪器设备管式炉：型，郑州博科仪器公司；电子分析天平：型，上海精密科学仪器有限公司；数显恒温磁力搅拌器：型，天津市泰斯特仪器有限公司；台式高速离心机：型，湖南湘仪离心机仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：型，上海精宏实验设备有限公司；高效液相色谱：型，美国沃特世公司；激光粒度仪：型，英国 公司；扫描电子显微镜：型，日本电子株式会社；傅立 叶 红 外 光 谱 仪：型，美 国 公司；射线衍射仪：型，日本理学公司。方法 纳米酶的合成（）配位 的 制 备：将 和 溶于 和 冰醋酸混合溶液中，置于聚四氟乙烯内胆（）中，加热。冷却，犵离心 。将得到的产物分别用和甲醇洗涤次，后续试验前，于室温下真空活化 配位 。（）配位 的制备：将 和 溶于 和 甲酸混合溶液中，置于聚四氟乙烯内胆（）中，加热。冷却，犵离心 。将得到的产物用和乙醇分别洗涤次，并于 活化 后进行后续试验。（）配位 的制备：将 溶于 和 甲酸混合溶液中，置于聚四氟乙烯内胆（）中，加热，冷却，加入 和 去离子水，超声处理 ，于 加热，犵离心 ，用和丙酮洗涤次，并于 真空干燥。纳米酶的表征使用 测 量 的 ，通 过 观 察 的形貌，使用 分析 的化学结构，通过 获取 的晶体结构信息，并通过高效液相色谱法（）测定 和 含量。纳米酶的蛋白水解酶活性分析（）双甘肽的水解：将 和 ，许珂宇等：调控配位不饱和位点增强锆基金属有机框架纳米酶的蛋白水解酶活性及应用 溶液（）加 入 到 超 纯 水 中，搅 拌。被 水 解 后，混 合 物 于 犵离心 以去除 ，通过 检测水解产物，并通过 产率计算 水解 的催化速率。（）蛋白水解酶活性测定：以双甘肽（）水解率为指标，评估 纳米酶的蛋白水解酶活性。将 样 品 溶 液、三 乙 胺 乙 腈 溶 液 和 乙腈溶 液 混 合，室 温 放 置，向 混 合 物 中 加 入 正己烷，室温静置 ，过滤，滤液用 超纯水稀释。流动相为 乙酸乙酸钠缓冲溶液（）；流动相为乙腈；洗脱流速 ；检测波长 ；柱温 ；上样量。梯度洗脱条件：，、，。（）纳米酶（配位 ）的异质性：将 配 位 和 溶 液（）加入到 水中，于 孵育催化，离心去除 配位 ，并使剩余溶液进一步反应。（）纳米酶（配位 ）的可重复使用性：采用溶剂洗涤法进行再生。真空条件下，将 配位 活化，继续用于催化反应。（）纳米酶（配位 ）对种蛋白质的水解：将大豆蛋白、鱼糜蛋白和酪蛋白分别与 配位 于 孵育。于不同的时间间隔内，采用 分析种蛋白质的分子量和水解产物。分离的条带用 染色。数据分析每组数据次重复，利用 软件处理数据与作图。结果与分析 纳米酶的表征在聚四氟乙烯内胆中，使用不同的有机羧酸作为连接剂，与 团簇配位连接，分别合成了种 纳米酶，即 配位的 纳米酶（图）。由 图和 图可 知，配 位 纳 米 酶 是一种具有光滑表面的规则球体，直径为 ；配位图不同配位数的 结构示意图 纳米酶是一种规则的八面体纳米材料，直径为；配位 纳米酶呈圆形，直径为 ，与文献 的结果一致。因此，种 被成功合成。由图可知，种 显示出典型的连接分子（，苯二甲酸、，苯三羧酸和，：，三联苯，四甲酸）的振动光谱。处吸收峰为 拉伸振动特征峰，反映了羧酸配体与锆金属中心的配位。处吸收峰为芳香族苯环的变形带的特征峰。，处分别为对苯二甲酸酯连接分子的对称和不对称的 伸展振动峰。处 的 宽 波 段 是 由 于拉 伸 振 动 的 重叠。个 在 ，处出现了不同的峰值，可 能 是 个 数 不 同 造成 的。综 上，纳米 酶 具 有 不 同 的 含 量，合 成 的种 纳米酶的 与文献，的相符。在有缺陷的 纳米酶的 图中出现了一个尖锐而薄的衍射峰（），表明在 纳米酶的合成过程中使 用 不 同 的 有 机 配 体 可 以 制 备 具 有 不 同 缺 陷 的 纳 米 酶。因 此，种 具 有 不 同 的 纳米酶被成功制备。纳米酶的蛋白水解酶活性由图（）可知，配位 和 配位 纳米酶的蛋白水解酶活性明显高于 配位 的，图不同配位数的 的水合粒径 基础研究 总第 期 年月图不同配位数的 的 图像 配位 对 双 甘 肽 的 水 解 率 达，而 配 位 和 配 位 的 水 解 率 分 别 为 ，。天然 蛋 白 酶 通 过 裂 解 肽 链 而 水 解 双 甘肽 。因此，的 活 性 中 心 被 认 为 是 。模拟了 在天然锌金属蛋白酶中的作用，更多的 将有助于提高 纳米酶的水解性能。然而，配 位 纳 米 酶 的 催 化 活 性 低 于 配 位 纳米酶的，是因为 配位 纳米酶的小孔尺寸阻碍了双甘肽与 的结合，。综上，配位 纳米酶对双甘肽的催化活性最高。配位 纳米酶水解双甘肽的一阶反应速率常数为 ，在没有 纳米酶存在的情况下，双甘肽的水解恒定速率为 ，表明使用 配位 纳米酶时，双甘肽的水解反应速率增加了 倍，说明 配位 对双甘肽具有较好的水解性能。图不同配位数的 的 图像 图不同配位数的 的 图像 由 图（）可 知，当 从 水 解 体 系 中 去 除 配 位 纳米酶后，双甘肽的水解率几乎不变，表明双甘肽不再被水解。该测试异质性的热过滤试验表明，在双甘肽水解体系中具有催化活性的是 配位 纳米酶。由图（）可知，以 配位 纳米酶含量为横坐标，一 阶 反 应 速 率 常 数 为 纵 坐 标 绘 制 曲 线，并 由 伪 模 型 式（）进 行 拟 合。配 位 纳米酶 对 双 甘 肽 的 水解 反 应 符合 方程。当 配位 纳米酶含量为 时，水解双甘肽的速率常数达到最大为，说明使用 配位 可以实现良好的水解效果。犽 犽 犓，（）式中：犽 一阶反应速率常数；犽 最大反应速率常数；催化剂的浓度，；犓 米氏常数。由图（）可知，在重复使用次后，的转化 ，许珂宇等：调控配位不饱和位点增强锆基金属有机框架纳米酶的蛋白水解酶活性及应用图 纳米酶的蛋白水解酶活性 率未明显下降，说明 配位 的水解活性未受到较大影响，表明 配位 具有较高的稳定性，在实际应用中具有较大的重复利用潜力。纳米酶水解蛋白质由图可知，随着水解时间的延长，种蛋白的条带逐渐变浅，表明 纳米酶可以同时水解种蛋白质，展现出广泛的蛋白酶活性。纳米酶对大豆蛋白和鱼糜蛋白显示出较高的催化活性，对酪蛋白的催化活性较低。如图（）所示，水解过程中没有低分 子 量（）的条带，可能是由于 纳米酶将大豆蛋白的长 肽 水 解 为 短 肽。由 于 短 链 多 肽 容 易 从 凝胶中漏出，所以无法被观察到。由图（）可知，随着水解时间的延长，大豆蛋白的长肽条带逐渐变浅，短肽条带逐渐变深，说明 纳米酶对鱼糜蛋白具有较好的水解效果。由图（）可知，酪蛋白的长肽条带逐渐变浅，短肽条带逐渐变深，但变化不明显，表明 纳米酶可以催化大豆蛋白、鱼糜蛋白和酪蛋白水解，展现出广泛的蛋白酶活性，且对大豆蛋白和鱼糜蛋白显示出较高的催化活性。结论通过调节锆基金属有机框架的配位不饱和金属位点制备了种具有不同蛋白水解酶活性的纳米酶，证明了一种可以调节锆基金属有机框架纳米酶的蛋白水解酶活性的方法。以双甘肽水解率为指标，评估了具有不同配位不饱和金属位点的锆基金属有机框架纳米酶的蛋白水图 配位 水解种蛋白质的 图 基础研究 总第 期 年月解酶活性，其中 配位的锆基金属有机框架纳米酶对双甘肽的蛋白水解酶活性最高，对双甘肽的水解率达，证实了锆基金属有机框架的蛋白酶活性可以通过调整配位不饱和金属位点而被提高，同时具有良好的异质性和可重复利用性。此外，锆基金属有机框架纳米酶可以分别水解种常见的蛋白质（大豆蛋白、鱼糜蛋白和酪蛋白），展现出广泛的蛋白酶活性，表明锆基金属有机框架作为蛋白水解酶纳米酶具有较好的实际应用潜力。研究中蛋白催化水解温度较高，后续需进一步研究锆基金属有机框架纳米酶结构对催化温度的影响机理，以期降低锆基金属有机框架纳米酶高效水解蛋白时的温度。参考文献?赵玉滨?穆秋霞?曲柳青?等?糖基化改性对酪蛋白酶解产物抗氧化活性的影响?食品与机械?（?）?（?）?唐雄?陈茂龙?许宙?等?钆金属有机框架的制备及用于吸附辛硫磷的研究?食品与机械?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（）?（下转第 页），许珂宇等：调控配位不饱和位点增强锆基金属有机框架纳米酶的蛋白水解酶活性及应用?（?）?国家卫生和计划生育委员会?食品安全国家标准食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求?北京?中国标准出版社?国家食品药品监督管理总局?国家卫生和计划生育委员会?食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定?北京?中国标准出版社?（?）?（?）?邵毅?姚春霞?黄柳娟?等?冷鲜鸡肉表面四环素和磺胺耐药菌的菌群多样性分析?农业工程学报?（?）?（?）?黄柳娟?冯博?刘海燕?等?冷鲜鸡肉表面及内部细菌菌群的多样性分析?上海农业学报?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（上接第 页）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?，黄柳娟等：种培养基对鸡肉产品中两类耐药菌培养的影响