微生物限度检查法专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1微生物程度检验法概述,2我国药品微生物程度标准发展情况,3我国药品微生物程度检验方法发展情况,4微生物程度检验法所需材料,5微生物程度检验试验用物品准备,6无菌室技术要求,7细菌、霉菌与酵母菌检验方法,供试品抽样、保留及检验量,试验操作前准备,供试液制备,对照用菌液制备,微生物限度检查法专家讲座,第1页,菌数测定阴性对照试验,细菌、霉菌（酵母菌）检验程序,供试液稀释（10倍递增稀释法）,注平皿,倾注培养基,培养,菌落计数,菌数汇报规则,注意事项,8.细菌、霉菌（酵母菌）其它检验方法,管稀释法（试管法、MPN法）滤膜法 计数板法,仪器法 平板涂布法,微生物限度检查法专家讲座,第2页,表面涂抹平板法 滤膜培养法酵母菌镜检计数法,9.大肠杆菌检验法,概述、原理 检验程序 增菌培养 分离培养 纯培养、革兰染色、镜检,生化试验（IMViC）,试验中注意事项,10沙门菌检验法,11铜绿假单胞菌检验法,12金黄色葡萄球菌检验法,13破伤风梭菌检验法,14活螨检验法,15结果判断,微生物限度检查法专家讲座,第3页,1微生物程度检验法意义 药品是防病治病、关系用药者生命健康特殊商品，必须确保其质量，用药安全与有效。微生物污染药品引发药源性疾病屡见不鲜，在国内外都有报道。为确保药品质量，必须对微生物污染进行必要控制和检验。其意义在于：,已经有许多实例表明，药品污染微生物不但危及病人用药安全，而且也直接影响药品有效性，所以药品卫生质量是药品质量不可分割部分。,反应药品生产工艺科学性、合理性及质量管理水平。经过检验，凡工艺条件、生产管理水平、生产人员素质差，不注意文明生产单位和企业，其生产药品，染菌必定严重，不合格率无疑就高。微生物程度检验是提供药品卫生质量情况主要依据，因而确保销售与使用过程中药品有效性与安全性，是促进与提升生产单位全方面质量管理水平与提升药品质量主要依据。,微生物程度检验法概述,微生物限度检查法专家讲座,第4页,2微生物程度检验范围,依据药品使用要求，可划分为两大类：,要求灭菌药品：包含注射剂和输液剂，及用于体腔、严重烧伤、溃疡、出血及眼科用药等制剂。,非要求灭菌药品：包含惯用口服制剂与普通外用制剂。对这一部分制剂普通不要求绝对无菌，允许一定限量微生物存在，但同时要求不得有可疑致病细菌存在。因为致病菌范围很广，各国药典都要求了几个常见致病菌或指标菌作为控制菌。,在非要求灭菌制剂中，对每克或每毫升药品按剂型或品种不一样要求：,染菌量检验：包含细菌数、霉菌数及酵母菌数测定，以检验这几类微生物对药品污染程度。,控制菌检验：包含大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌检验等。,微生物限度检查法专家讲座,第5页,3药品微生物程度检验抽样量与检验量,药品微生物程度检验中困难，最根本原因在于检验对象本身特殊性。,药品微生物程度检验对象特征：,不确定性：药品受外来微生物污染，这种污染是可无可有；在有中又可多可少；其种类能够多样。污染情况可依生产、设备、原材料、管理、剂型等条件而定，非药品本身所固有。所以微生物程度检验对象是不确定。药品所要求检验项目，除无菌检验、热原检验含有上述性质，其它项均无此特征。这一点往往被忽略。污染对药品而言是一个意外事件。污染批号中不合格品是一个随机变量。,分布不均匀性：不均匀性是不确定性另一个表现形式，在一个批号内产品有被污染，有不被污染，分布不匀；在被污染部分中有数量极多，有较少，种类上能够复杂或较单一。这种不均匀性源于污染源复杂性；原辅料 污染、工艺污染、空间污染,微生物限度检查法专家讲座,第6页,和操作人员污染等等组成污染量多少差异，形成不均态。再者，微生物含有簇团性；簇团大小、紧密程度是可遗传，簇团分散性差异极大，该特点无疑强化了不均匀性。,活体特征：药典中以活微生物作为检验对象也是独特特征。,因为以上特殊性，抽样对微生物程度检测值将产生很大影响。当药品无污染时，抽样将不影响检验，当批产品存在污染品时，抽样样本是随机变量，抽样影响以下：,抽样方法：不一样抽样方法对批产品总体代表性是不一样，测定值也是有差异。如抽取可疑样品与随机抽样，其检出率与数字显然前者大于后者。,抽样量：抽样量多少，对样本代表性极为主要，如含10不合格率批产品，从中抽取2件数为样本进行控制菌检验时，有81机率判定为合格品，而抽取30件数时，会有96机率判定为不合格品。,微生物限度检查法专家讲座,第7页,以上表明抽样方法、抽样数量、抽样次数均影响测定结果。以控制菌检验为例，决定染菌检出是否必须具备两个条件：（A）样品是否是含染菌样品；（B）检验操作正确无误，其中（A）是前提条件。,中国药典关于抽验方法与抽样数量要求：供试品为随机抽样，普通抽样量为检验用量（两个以上最小包装单位）3倍量。对异常供试品应针对性抽样，对外观可疑污染或对有争议复验样品应抽取能够污染和有争议复验原样品。对异常供试品应针对性抽样，对外观可疑污染或对有争议复验样品应抽取能够污染和有争议复验原样品。,凡能从药品、瓶（外盖内侧及瓶口周围）外观看出发霉、生虫以及变质药品无须再继续检验，应直接判为不合格。不能以有时外观有上述情况而检验内容为合格，来判定该药品合格，因为瓶口染菌，对服用者是不安全，如自瓶口直接服药时，所染菌随之进入人体，同时发觉瓶口一旦染菌，瓶内药液最终要受到污染。,检验量与抽样量是两种不一样范围量，后者指从全批产品,微生物限度检查法专家讲座,第8页,（或抽样全过程）抽取单位包装，前者是指检验用量，普通抽样量大于检验量。检验量只是抽样量各包装混合样品一部分。,中国药典要求检验量为每次最少应分取两瓶（盒）以上样品共10克或10毫升，中药蜜丸最少应分取4丸以上共10克。,当前我国以1克或1毫升、膜剂以10cm,2,作为汇报单位；英美药典及欧洲药典也是以1克或1毫升作为限量，但控制菌有是以10克或10毫升作为限量，比我国限量要求严格。,总之，抽样量和检验量大小对检验结果影响较大（尽管当前抽样方案还存在不科学，漏检率高）。因为药品微生物检验是破坏性检验，检验1瓶（盒）会破坏1瓶（盒），检验量愈大，则破坏性愈大，尤其对珍贵药品，生产单位、经营单位损失也就越大。所以，怎样确定适宜既能满足抽样检验基本要求，又能使生产、经营者可接收抽样方案，是当前需要处理问题。但当前要求必须遵照，不能随意变动，尤其不能降低（除对珍贵、微量包装药品可酌情降低检验量除外）。,微生物限度检查法专家讲座,第9页,微生物程度检验方法发展情况,11980年我国药品微生物程度检验工作正式发行药品卫生检验方法。,21984年出版第二版药品卫生检验方法。,31990.中检所出版第三版，主要对原方法中各地反应意见较多问题进行了改写；增加了部分检验方法和供试液制备方法；为了同国内外检验方法相协调，对一些内容作了对应更改，另外，还参考国家标准编写格式作了编排。,41990年版药典第二增补本收载了微生物程度检验法。这也是我国首次在药典上收载此方法。,51995年版药典也收载了此检验法，少数剂型收载了程度要求。（20个化学药品要求程度）。,微生物限度检查法专家讲座,第10页,6、药典一、二部同时收载了检验法和程度标准。首次把,微生物程度检验法和程度标准同时公布。,微生物限度检查法专家讲座,第11页,微生物程度标准发展情况,11972年开展此项工作,21978年颁布我国第一个“药品卫生标准”,31986年颁布修改后“药品卫生标准”，1987年12月1日起供内部执行,41989年下达“药品卫生标准补充要求和说明”,51990年版药典第二增补本收载了20个化学药品种微生物程度标准要求，与国际通例一致,61995年版药典少数几个剂型（滴眼剂等）收载了微生物程度。要求按微生物程度检验法检验不得有菌生长,7药典按剂型、中西药分类要求微生物程度，还对几个生化药品在各论中项下作了详细要求,微生物限度检查法专家讲座,第12页,实,验,所,用,培,养,基,营养琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基,酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）胆盐乳糖培养基（BL）,4甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基（MUG）,乳糖培养基 5乳糖培养基,蛋白胨水培养基 磷酸盐葡萄糖胨水培养基,枸橼酸盐培养基 曙红亚甲蓝琼脂（EMB）,麦康凯琼脂（MacC）营养肉汤,微生物限度检查法专家讲座,第13页,微生物程度检验惯用检验设备及器材,恒温培养箱 3035 361,霉菌培养箱 2528,恒温水浴箱 451,净化工作台 生物显微镜 1500X,体视显微镜或放大镜 电冰箱,电热干燥箱 250300,高压蒸汽消毒器,电子天平或药品天平 感量0.1g,匀浆仪或研钵,锥形瓶 100ml，250ml，500ml，1000ml,微生物限度检查法专家讲座,第14页,直形吸管 1ml，10ml,量杯 10ml,试管 18x180mm，13x200mm，30 x200mm,试管筒 培养皿 9cm,培养皿筒 陶瓦盖 12cm,量筒 100ml，500ml，1000ml,滤器及微孔滤膜 孔径0.450.02um,注射器 1ml，5ml，10ml，30ml,载玻片及盖玻片,接种针及接种环,试管架,微生物限度检查法专家讲座,第15页,乙醇灯 康氏振荡器,离心机 5004000min 紫外灯 365nm,玻璃或搪瓷消毒缸 （带盖）,大、小橡皮乳头,乙醇棉球或碘伏棉球,灭菌剪刀、镊子、钢锥,灭菌称样纸,灭菌不锈钢药匙,火柴、记号笔（玻璃铅笔）,白瓷盘、洗手盆,试验统计纸,微生物限度检查法专家讲座,第16页,细菌、霉菌与酵母菌检验方法（平皿菌落计数法,）,（一）供试品抽样、保留及检验量,1,供试品应随机抽样。普通抽样量（2个以上最小包装单位）为检验量3倍量。,2对异常供试品应针对性抽样。抽样时，凡发觉有异常或可疑样品，应选取有疑问样品，但机械损伤、显著破裂包装不得作为样品。,凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）、外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质药品，可直接判为不合格，无需在抽样检验。不能以外观有上述情况而检验内容物合格，来判断该药品合格。,3供试品收检后应及时检验，若有困难，应存放在该品种要求储存条件下（普通为阴凉干燥处），勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保留条件不妥引发致死、损伤或繁殖。,微生物限度检查法专家讲座,第17页,4供试品在检验之前，应保持原包装状态，禁止开启，包装已开启样品不得作为供试品。,5供试品取样必须在净化条件下无菌操作，严防再污染。（原料药、装量大药）,6有剂型检验量均需取自2个以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，除需取自2个以上包装外，还应取4丸、片以上样品）。,7固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10克。,8液体制剂检验量为10毫升。,9膜剂除另有要求外，中药膜剂检验量为3050cm,2,，化学膜剂及生化药膜剂检验量为 100cm,2,。,10珍贵或微量包装供试品检验量能够酌减，除另有要求外，口服固体制剂不低于3克，液体制剂采取原液者不得少于6毫升，采取供试液者不得少于3毫升，外用药品不得少于5克 6,微生物限度检查法专家讲座,第18页,（二）试验操作前准备,1 将供试品及全部已灭菌平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、研钵、吸管（1ml 10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，防止操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸、布）取掉。,另外还有增菌液、培养基（营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基，保持在45左右水浴中）、MUG培养基试管等.湿热灭菌物品,称量纸、手术镊子、剪子等 .干热灭菌物品,2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气净化装置，并使其工作不少于30分钟。,3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1 苯扎溴铵溶液或其它消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩。,微生物限度检查法专家讲座,第19页,4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等开口处周围，待干后用灭菌手术镊或剪将供试品启封。,（三）供试液制备（1：10供试液）,按供试品理化特征与生物学特征采取适宜方法制备供试液。不得改变污染微生物数量和种类。,1液体供试品 取供试品10ml，加入到稀释剂90ml中，混匀，作为供试,液。（有书上讲取10 ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，摇匀）。,油剂可加适量聚山梨酯80；,微生物限度检查法专家讲座,第20页,气雾剂、喷雾剂供试品 将供试品置冰室内2hr后，取出，用灭菌钢锥小心钻孔，使抛射剂迟缓释放，然后用灭菌注射器加入稀释剂，混匀后吸收相当于10g或10ml供试品，再稀释成1：10供试液。,USPXXIV要求是抛射剂导出后，吸收10ml或取10g供试品，加稀释液使成100ml。,合剂（系指含蜂蜜或王浆者）与滴眼剂可用供试品作为供试液。（滴眼剂不得检出霉菌和酵母菌）。含蜂蜜、王浆制剂2固体、半固体或粘稠供试品,称取供试品10g，置装有0.9无菌氯化钠100ml匀浆杯中，用匀浆仪（30005000r 24min），或其它适宜方法（振荡器或研钵研磨等方法分散混匀，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超出45。,微生物限度检查法专家讲座,第21页,3非水溶性供试品,软膏剂、乳化剂 称取供试品5g(5ml)，加入含已灭菌熔化并保温45左右司盘80 50g、单硬脂酸甘油酯 3g、聚山梨酯80 10g混合物烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45左右0.9无菌氯化钠溶液约80ml，（实际测可能是85ml），边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（1：20）。,油剂 取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯80 58ml，摇匀，再加入稀释剂至100ml。,栓剂 称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45左右水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯80 58ml，振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml），摇匀,微生物限度检查法专家讲座,第22页,茶剂 取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇30秒，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30分钟）。,胶丸剂 （如鱼肝油丸等）同胶囊剂,胶剂 （如阿胶）取胶剂若干，捣碎，称取10g，再用研钵研细，转入250ml锥形瓶内，加入稀释剂100ml，置451水浴中，振摇使溶，即为1：10供试液。,胶丸剂 （如鱼肝油丸等）同胶囊剂,胶剂 （如阿胶）取胶剂若干，捣碎，称取10g，再用研钵研细，转入250ml锥形瓶内，加入稀释剂100ml，置451水浴中，振摇使溶，即为1：10供试液。,微生物限度检查法专家讲座,第23页,4含抑菌成份供试品 （仅限检验控制菌时用）,凡含防腐剂或抑菌成份且影响检验（供试品按常规检验法，加入要求量对照菌，不能检出时）供试品，可依据供试品性质，控制菌特征及检验条件等按以下方法之一或两种以上方法联合应用处理后，依法检验。同时做阳性和阴性对照。,药典要求：供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，依法检验。,实际操作中：先把供试液离心（500r/min 5min）这么菌体在上层，吸收上清液过滤，把滤膜直接贴在培养基上培养即可，详细吸收上清液10ml还是100ml按品种要求自己定。取10ml过滤测出来是个克，取100ml过滤测出来是个10克。（程度检验）,稀释法：将供试品种入较大量培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用浓度（使该供试液稀释至阳性对照菌能生长浓度）。此法用作控制菌检验和程度检验。,本法适合用于抑菌作用不强中药、化学药品检验。,微生物限度检查法专家讲座,第24页,离心沉淀集菌法：取要求量供试液于无菌刻度离心管中，离心（每分钟3000转）30分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原要求供试液。如有不溶性药渣，可先离心（每分钟500转）5分钟，取全部上层液，再行集菌处理。,本法适合用于一些抑菌作用不强中、西药品，如蜜丸、水丸、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂及液体制剂。,应用本法需严防操作污染，并注意上层液或上清液和底部残渣分离，防止沉渣混入其中。,薄膜过滤法：取要求量供试液，置稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径小于0.45um0.02um微孔滤膜过滤器中，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50100ml，取出滤膜备检。冲洗时每次最好不少于100ml，能够将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中，能够用加入滤器中供试品量来控制检验量，也能够把滤膜取出来剪成24片，使每片相当于供试品1g或1ml，放入增菌培养基中，作控制菌检验。,微生物限度检查法专家讲座,第25页,本法适合用于水溶性抑菌成份中、西药品和滴眼剂等制剂“灭活”处理。安放滤膜时，注意滤膜与滤器应密合，预防滤膜破损、漏液。本法所用滤膜孔径0.45um0.02um。,（钝化）中和法：凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂供试品，可用对应试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。,磺胺类药品中和法 取要求量含磺胺类供试品，于100ml增菌液中加入含1对氨基苯甲酸约15ml（以前讲加入0.5ml）。,本法用于含磺胺较少制剂，如：三黄软膏、消炎眼药水、斑马眼药水等。应用本法可因供试品不一样，对氨基苯甲酸用量可适当调整。,含砷、汞等重金属药品中和法，取要求量供试品，加入硫乙醇酸盐培养基100ml中，作增菌培养。,微生物限度检查法专家讲座,第26页,本法适合用于含重金属盐类药品检验，如磺胺嘧啶银软膏等。,含洗必泰等防腐剂供试品中和法，取要求量供试品，加入含适量聚山梨酯80等表面活性剂100ml增菌液中（表面活性剂用量应预试，用量过大有抑菌作用）。,本法适合用于洗必泰含片、洗必泰栓、霉滴栓剂及其它含抑菌成份供试品。应用本法需注意，因为供试品不一样，表面活性剂用量应预试，用量不宜过大，不然本身易产生抑菌作用。,沉降法：（药典上没收载此法）取要求量供试液，自然沉降5分钟，取上层液于100ml增菌液中，作增菌培养。本法用于单一成份固体制剂如磺胺嘧啶片。,取要求量供试液，自然沉降5分钟，吸收上层液于（含1对氨基苯甲酸1ml）100ml增菌液中，作增菌培养。本法适合用于复方磺胺制剂，如复方磺胺嘧啶片、复方新诺明片等,微生物限度检查法专家讲座,第27页,以上两法适合用于难溶于水抗菌制剂。如磺胺类药,应用沉降法时，供试品应充分研细，并与稀释剂充分摇匀，使污染菌分散于液相中；沉降时间不宜超出5分钟，以防菌细胞下沉；取上清液时，防止吸入药渣。,（四）对照用阳性菌液,控制菌检验均应作对应已知菌阳性对照试验。对照菌株为大肠杆菌CMCC(B)44 102、沙门菌CMCC(B)50 094、铜绿假单胞菌、CMCC(B)10104及金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003,制备：取对应菌株营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养1820小时后，稀释至1：10,6,。对照菌加入量为50100个。,CMCC医学微生物菌种保藏管理中心。国内药品微生物检验所用菌种主要是CMCC(B)、CMCC(F)菌号，B(bacteria)代表细菌，F(fungi)代表真菌。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供这些干燥菌种。,微生物限度检查法专家讲座,第28页,（五）平皿菌落计数法,取均匀供试液，深入稀释成1：10,2,1：10,3,等适宜稀释级。分别取连续三级10倍稀释供试品液各1ml，置直径约9mm平皿中，再注入约45培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级应作23个平皿。,营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下，前者同时点记霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点记细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。含蜂蜜、王浆制剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基分别测定霉菌、酵母菌菌落数，合并计数。含糖液体及半固体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。,（六）菌数测定阴性对照试验,取供试验用稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用培养基制备平板，培养，检验，不得长菌。,（七）检验程序,微生物限度检查法专家讲座,第29页,细菌、霉菌（酵母菌）检验程序,微生物限度检查法专家讲座,第30页,微生物限度检查法专家讲座,第31页,微生物限度检查法专家讲座,第32页,微生物限度检查法专家讲座,第33页,（八）供试液稀释（10倍递增稀释法）,取23支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂。另取1支1ml灭菌吸管吸收1：10均匀供试液1ml，加入装有9ml灭菌稀释剂试管中混匀，即得1：100供试液。依这类推，依据供试品污染程度，可稀释至1：10,3,、1：10,4,等适宜稀释级（最少共三级）。普通取1：10 1：10,2,1：10,3,三级稀释液检验。每递增一个稀释级，必须另换一支吸管。在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，重复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，再沿第2支稀释管内壁靠近液面（勿接触液面）迟缓地吹出全部供试液（吸管内应无粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。,微生物限度检查法专家讲座,第34页,（九）注平皿,在进行10倍递增稀释同时，以该稀释级吸管，吸收各级稀释液各1ml至每个平皿中，每一稀释剂注23个平皿。（此时，普通为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，预防反流到吸管尖端部。同时做阴性对照（待各级稀释液注皿完成后，用一支1ml吸管吸收稀释剂各1ml，分别注入4个平皿中。其中两个作细菌阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照）。,（十）倾注培养基,将预先配制好培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数普通用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另加用YPD琼脂）溶化，冷至约45时，,微生物限度检查法专家讲座,第35页,倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿，使试液与培养基混匀，（注意，混匀时切勿将培养基溅到平皿边及皿盖上），置操作台上待凝。,（十一）培养,细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养48h，霉菌、酵母菌计数平板于2528培养箱中培养72h。,（十二）菌落计数,1细菌培养时间为48小时，分别在二十四小时及48小时点记菌落数，普通以48小时菌落数为准，霉菌、酵母菌培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点记菌落数，普通以72小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，此平板不宜计数。点计后，计算各稀释级平均菌落数，按菌数汇报规则汇报菌数。,微生物限度检查法专家讲座,第36页,2普通将平皿置菌落计数器或从平皿后面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小琼脂层内和平皿边缘生长菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等区分。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。如仍难区分，可延长培养时间47天，细菌菌落常会生长增大而加以区分。,3供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点记在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除方法须按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。,4供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，（尤其是1：10级别）培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落用肉眼相区分有形物。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级供试液多增加注皿,微生物限度检查法专家讲座,第37页,（12个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。或用0.001TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其它有形物区分开来。0.001%TTC肉汤琼脂培养基（0.001%2、3、5氯化三苯四氮唑琼脂），在每1000ml营养琼脂内加入灭菌1TTC溶液1ml混匀后倾注平皿，预防菌落蔓延。,有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长菌落不易识别和点计，为预防这种情况，也可用0.001TTC营养琼脂注皿，经培养后生长菌落为红色，衬以白色背景上易于点计。,5若平板上有2个或2个以上菌落重合，肉眼可区分时仍以2个菌落或2,个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无显著界限，一条链作为一个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不一样可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延较大片状菌落或花斑样菌落，普通不宜作为计数用。,微生物限度检查法专家讲座,第38页,附表：细菌、霉菌、酵母菌形态特征比较（营养琼脂及玫瑰红钠琼脂平板）,微生物限度检查法专家讲座,第39页,6如同一稀释级2个平板菌落数超出1倍以上，不应计数，菌落蔓延成片不应计数。,7当2个平板菌落数均在15（含15）以下时，按菌落计数Poisson分布菌数95%可信限计。二个平板最大差值分别在04，17，29，310，412，514，615，以上各数分别为菌落平均值1、2、3、4、5、6、7上限及下限，超出以上程度，视为操作误差，不得作为计数依据。,每个稀释级使用3个平板时，平板菌落数均在10个以下情况。03，15，27，39，410，512，613，714。,8对有疑议供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。,（十三）菌数汇报规则,1细菌数选取平均菌落数在30300（国外近年有选取25250趋向）之间稀释级，霉菌、酵母菌选取平均菌落数在30100之间稀释级作为汇报菌,微生物限度检查法专家讲座,第40页,数计算依据。,如只有1个稀释级平均菌落数在30300（30100）之间，则将该稀释级菌落数乘以稀释倍数汇报。,2如有2个相邻稀释级平均菌落数在30300（30100）之间时，则按比值计算。当比值2时，则以2个稀释级均值汇报。当比值2时，则以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数汇报。,比值（高稀释级平均菌落数稀释倍数）（低稀释级平均菌落数稀释倍数）,3如有3个稀释级平均菌落数均在30300（30100）之间时，则以后2个稀释级计算级间比值汇报。,4如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，则按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数汇报；如各稀释级平均菌落数均在30以下，普通则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数汇报。,微生物限度检查法专家讲座,第41页,5如各稀释级平均菌落数均不在30300（30100）之间，则以最靠近30或300（100）稀释级平均菌落数乘以稀释倍数汇报。,6如各稀释剂平板均无菌落生长或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则汇报菌数为小于10个g或ml。,如供试品原液平板均未生长霉菌及酵母菌，则汇报未检出霉菌及酵母菌ml。,7当各稀释级平均菌落数均小于30时，如高稀释级平均菌落数大于或等于低稀释级平均菌落数时，应以培养基稀释法重新测定，按测定结果汇报菌数。,培养基稀释法：取低稀释级供试液（原液或1：10供试液）3份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或0.2ml)，每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。,5个或5个以上平板点计菌落数之和，即为每1ml菌落数，共得3组数据。以3份低稀释级供试液菌落数平均值乘以稀释倍数汇报。,微生物限度检查法专家讲座,第42页,8结果汇报,菌落数在100以内时，按实有数汇报。,菌落数大于100时，取两位有效数字汇报，第三位按数值修约规则处理。,复试 供试品细菌数、霉菌数及酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果平均值汇报。,微生物限度检查法专家讲座,第43页,（十四）注意事项,1供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时，不能接触可能污染任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。,2从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在1小时内完成，防止因为时间过长造成菌细胞繁殖或死亡。,3供试液稀释及注皿应取均匀供试液，以免造成试验误差。,4为防止细菌菌落蔓延生长，宜采取以下方法处理：,开盖干燥 换陶瓦盖 加TTC(0.001%),5在净化工作台上操作时，应防止双手往返出入工作台；在无菌室操作时，应防止操作者往返出入无菌室。,微生物限度检查法专家讲座,第44页,细菌、霉菌及酵母菌其它检验方法,（一）,细菌计数其它测定方法,细菌计数除平板菌落计数法外，还有其它方法，大致上可分两大类：,1活菌计数包含试管稀释法、滤膜法、毛细血管法等,前者是液体培养法，后二者是固体培养法。其特点都是检测含有繁殖能力细菌数。,2总菌数计数法是以细菌（或其它菌类）形态特征检测细菌总数，包含无生殖能力菌细胞在内。,试管稀释法（试管法、MPN法）,微生物限度检查法专家讲座,第45页,滤膜法 （BP、JP已收载此法）,计数板法 （采取血球计数板或其它计数板进行细菌计数）,仪器法 （应用仪器测定菌数是当代菌数检测技术一个发展动向。细菌细胞则属不导电粒子，可被计数）,平板涂布法,（二）,霉菌、酵母菌数测定其它方法,1表面涂抹平板法 本法适合用于污染比较严重供试品,2滤膜培养法,3酵母菌镜检计数法 血球计数板或其它计数板进行酵母菌计数,微生物限度检查法专家讲座,第46页,大,肠,杆,菌,检,查,法,大肠杆菌即大肠埃希菌(Escherichia coli)，为肠杆菌科埃希菌属模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发觉有非脱羧埃希菌等四个种（有资料说五种）。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到了人和温血动物粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠杆菌外还有致病性大肠杆菌，可引发婴幼儿、成人暴发性腹泻。为确保人体健康，口服药品必须检验大肠杆菌。,用4甲基伞形酮葡糖苷酸(4MethylumbelliferylDglucuronide，即MUG)和靛基质（Indole）试验检验大肠杆菌是一项新技术，专一性强，试验证实94大肠埃希菌MUG阳性，且在大肠埃希菌属中，除E.coli以外，其它5种,微生物限度检查法专家讲座,第47页,大肠埃希杆菌MUG皆为阴性。其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌种分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可汇报结果，如MUG、Indole试验不一致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验判别。,原理：利用目标菌限定酶作用低物水解产物，产生颜色或荧光反应作为指标系统来判定目标菌。试验证实96大肠杆菌含葡糖苷酸酶（glucuronidase,GUD），约10沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，因为荧光反应敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG判定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等检测。单一MUG判别大肠杆菌其漏检率达6，这不符合药典检验方法准确度要求，鉴于98大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG靛基质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理论上可使大肠杆菌检出率达99。,微生物限度检查法专家讲座,第48页,（一）大肠杆菌检验程序 （见下页图表）,供试液制备方法：,1液体供试品,2固体、半固体或粘稠液体供试品,3非水溶性供试品,4含抑菌成份供试品（稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过 滤法、中和法、沉降法）,（二）增菌培养,取胆盐乳糖（BL）培养基3份，每份各100ml，2份分别加入要求量供试液，其中1份加入对照菌50100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量稀释剂作阴性对照。37培养18二十四小时（必要时可延长至48小时）。阴性对照应无菌生长。,微生物限度检查法专家讲座,第49页,摇匀上述胆盐乳糖增菌液，以灭菌吸管吸收供试品胆盐乳糖增菌液、供试品阳性对照增菌液、阴性对照培养液各0.2ml，分别加入5mlMUG蛋白胨培养基管，37培养，分别于5小时、二十四小时，取未接种MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外灯下观察。阳性对照管展现荧光，MUG阳性，供试液MUG管展现荧光，MUG阳性；无荧光，MUG阴性。然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。,（三）分离培养,如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，将上述供试品BL,微生物限度检查法专家讲座,第50页,大,肠,杆,菌,检,验,程,序,图,示,微生物限度检查法专家讲座,第51页,增菌液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18二十四小时。当阴性对照呈阴性，阳性对照平板呈经典菌落生长时，如上述供试液培养物分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。,假如有菌落生长，应挑选23个可疑菌落作靛基质试验（I）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生成试验（VP）、枸橼酸盐利用试验（C）及革兰染色，镜检。按表中要求判断结果：（见下页）,微生物限度检查法专家讲座,第52页,大肠杆菌菌落形态特征,培 养 基 菌 落 形 态,曙红亚甲蓝琼脂（EMB）,经典菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。非经典菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无显著暗色中心，无金属光泽。,麦康凯琼脂,经典菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。非经典菌落呈微红色，或菌落中心呈红色。,微生物限度检查法专家讲座,第53页,（四）纯培养 （复壮）,如生长菌落与（大肠杆菌菌落形态特征表）所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落表面中心，沾取培养物，应挑选23个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18二十四小时，作以下检验。,如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于EMB琼脂平板，培养18二十四小时，在挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检验。,（五）革兰染色、镜检,1以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落营养琼脂斜面培养物少许，轻轻研开，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再经过火焰23次（载玻片不烫手为宜）固定。,微生物限度检查法专家讲座,第54页,2滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗 3滴加碘液，媒染1分钟，水洗，以滤纸吸干余水 4滴加95乙醇，脱色2030秒，水洗。或将95乙醇滴满整个涂片，马上倾去，再用乙醇滴满涂片脱色10秒，水洗、吸干,5滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检,染色结果：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。大肠杆菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。,注意事项：,1玻片必须洁净，涂片菌量宜少，菌量不可浓，不然，菌细胞成堆或连成片。看不清单个菌体形态。染色反应难于判断，菌细胞形态难于观察。,2待检菌菌龄以16二十四小时为宜。革兰阳性菌易受菌龄影响，老化细胞易呈阴性。,3脱色是本法关键步骤，脱色时间不足菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染成阴性。,微生物限度检查法专家讲座,第55页,（六）生化试验,1靛基质试验（I）取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养2448小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98大肠杆菌I试验为阳性。普通二十四小时即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1ml或2ml培养液进行检验，如靛基质试验是阴性，余下蛋白胨水培养物再培养二十四小时，作靛基质试验。,2甲基红试验(M)取可疑菌落或斜面培养物，接种磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48小时2小时，于管内加入甲基红指示液23滴（约每1ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，马上观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。,微生物限度检查法专家讲座,第56页,3乙酰甲基甲醇生成试验(VP)取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48小时2小时，于每2ml培养液中加入萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40KOH溶液0.4ml，充分振摇，在4小时（通常在30min）内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。,4枸橼酸盐利用试验(C)取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，普通培养4