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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学基础,第一章 绪 论,第一节 概述,一、分子生物学的基本含义,广义上讲，对蛋白质和核酸等生物大分子结构和功能的研究都属于分子生物学的研究范畴，也就是从分子水平阐述生命的现象和生物学规律。例如，蛋白质的结构、运动和功能，酶的作用机理和动力学，膜蛋白结构与功能和跨膜运输等。从这个角度看，分子生物学几乎已经包括了生物学领域的许多方面。但实际上，随研究的深入，这些内容已逐步发展成了各自独立的学科。因此，目前人们常采用狭义的概念，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质基因或,DNA,的结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。当然也涉及到与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。,第一节 概述,二、分子生物学的主要研究内容,它的研究内容主要有以下几个方面：,1,DNA,的复制、转录和翻译,2基因表达调控的研究,3,DNA,重组技术,4,结构分子生物学,5,基因与基因组以及功能基因组的研究,第二节 分子生物学发展简史,一、分子生物学的建立和发展,1,准备和酝酿阶段,2现代分子生物学的建立和发展阶段,3初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段,第二节 分子生物学发展简史,二、分子生物学与其它学科的关系,1,分子生物学与生物化学,分子生物学是从分子水平研究生命现象。生物化学是从分子水平研究生命化学现象。在研究方向上，分子生物学主要是研究蛋白质、核酸和其它生物大分子的结构与功能，以及它们之间的相互作用，着重解决细胞中信息传递和代谢调节的问题。而生物化学主要研究大、小分子在生命活动中的代谢过程，即重点是分子的代谢转化。,从学科范畴上讲，分子生物学包括生物化学；从研究的基本内容讲，遗传信息从,DNA,到蛋白质的过程，其许多内容又属于生物化学的范畴。,第二节 分子生物学发展简史,2,分子生物学与细胞生物学,细胞生物学是在细胞、细胞超微结构和分子水平等不同层次上，以研究细胞结构、功能及生命活动为主的基础学科。分子生物学是细胞生物学的主要发展方向，也就是说，在分子水平上探索细胞的基本生命规律，把细胞看成是物质、能量、信息过程的结合，而且着重研究细胞中的遗传物质的结构、功能以及遗传信息的传递和调节等过程。,3,遗传学与分子生物学,遗传学是分子生物学发展以来受影响最大的学科。孟德尔著名的皱皮豌豆和圆粒豌豆子代分离实验以及由此得到的遗传规律，纷纷在近,20,年内得到分子水平上的解释。越来越多的遗传学原理正在被分子水平的实验所证实或摈弃，许多遗传病已经得到控制或矫正，许多经典遗传学无法解决的问题和无法破译的奥秘，也相继被攻克，分子遗传学已成为人类了解、阐明和改造自然界的重要武器。,第二节 分子生物学发展简史,4,生物分类学与分子生物学,分类和进化研究是生物学中最古老的领域，它们同样由于分子生物学的渗透而获得了新生。过去研究分类和进化，主要依靠生物体的形态，并辅以生理特征，来探讨生物间亲缘关系的远近。现在，反映不同生命活动中更为本质的核酸、蛋白质序列间的比较，已被大量用于分类和进化的研究。由于核酸技术的进步，科学家已经可能从已灭绝的化石里提取极为微量的,DNA,分子，并进行深入的研究，以此确证这些生物在进化树上的地位。,5,发育生物学与分子生物学,分子生物学还对发育生物学研究产生了巨大的影响。人们早就知道，个体生长发育所需的全部信息都是储存在,DNA,序列中的，如果受精卵中的遗传信息不能按照一定的时空顺序表达，个体发育规律就会被打乱，高度有序的生物世界就不复存在。大量分子水平的实验证明，同源转换区(,homeobox),及同源转换结构域(,homeolomain),在个体发育过程中发挥了举足轻重的作用。专家估计，这个领域的研究将为发育生物学带来一场革命。,第二节 分子生物学发展简史,三、分子生物学的现状与展望,1,功能基因组学,2,蛋白质组学,3,生物信息学,分子生物学基础,第二章,DNA,的结构、复制和修复,第一节,染色体,一、染色体概述,染色体在不同的细胞周期有不同的形态表现。在细胞大部分时间的分裂间期表现为染色质,(,chromatin),。,染色质是细胞核内可以被碱性染料着色的一类非定形物质。它以双链,DNA,为骨架，与组蛋白,(,hilston),、,非组蛋白,(,non-histon),以及少量的各种,RNA,等共同组成丝状结构。在染色质中，,DNA,和组蛋白的组成非常稳定，非组蛋白和,RNA,随细胞生理状态不同而有变化。在细胞分裂期，染色质纤丝经多级螺旋化形成一种有固定形态的复杂的立体结构的染色体。,染色体只在细胞分裂期，人们才能在光学显微镜下观察到这些结构。它们存在于细胞核，呈棒状的可染色结构，故称为染色体。细胞分裂时，每条染色体都复制生成一条与母链完全一样的链，形成同源染色体对。,作为遗传物质，染色体具有以下特征：,分子结构相对稳定；,能够自我复制，使亲代、子代之间保持连续性；,能够指导蛋白质的合成；,能够产生可遗传的变异。,第一节,染色体,二、原核生物的染色体,1,细菌染色体形态结构,大肠杆菌染色体长为,1 333,m,，,而要装入长约,2,m,宽,1,m,的细胞中，为此,DNA,必定以折叠或螺旋状态存在。有实验证明：在,DNA,分子进行折叠或螺旋过程中还依赖于,RNA,分子的作用。如,300,m,的环状,DNA,（,图,2-1,A,），,通过,RNA,分子的连接作用将,DNA,片段结合起来形成环（,loop,），,从而导致,DNA,长度缩小成为,25,m,（,图,2-1,B,），,在活体大肠杆菌染色体上约有,50,多个这样的环。接着每个环内,DNA,进一步螺旋，使,DNA,长度进一步缩短为,1.5,m,，,而形成更高级结构的染色体（图,2-1,C,）。,因此，细菌的染色体不是一条裸露的,DNA,链，而是以高度的组装形式存在，同时这种组装不仅为了适应细菌细胞的狭小空间，而且还要有利于染色体功能的实现，便于染色体复制和基因表达。,第一节,染色体,图2-1 大肠杆菌（,E.coli,）,染色体的基本结构,第一节,染色体,2,原核生物,DNA,基因组的组织结构特点,（,1,）结构简练,原核,DNA,分子的绝大部分是用来编码蛋白质的，只有非常小的一部分不转录，这与真核,DNA,的冗余现象不同。,（,2,）基因种类和数量较少,原核细胞中染色体一般只有一条双链,DNA,分子，且大都带有单拷贝基因，且多以重叠基因的形式存在，只有很少数基因（如,rRNA,基因）是以多拷贝形式存在的；整个染色体,DNA,几乎全部由功能基因与调控序列所组成；几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。,（,3,）以操纵子为转录单元,原核生物,DNA,序列中功能相关的,RNA,和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或几个特定部位，形成功能单位或转录单元，它们可被一起转录为含多个,mRNA,的分子，叫多顺反子,mRNA,。,X,174,及,G,4,基因组中就含有数个多顺反子。功能相关的基因串联在一起转录产生一条多顺反子,mRNA,链，然后再翻译成各种蛋白质。,第一节,染色体,三、真核生物染色体的组成,1,染色体蛋白质,（,1,）组蛋白,组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，富含带正电荷的,Arg,和,Lys,等碱性氨基酸，等电点一般在,pH l0.0,以上，属碱性蛋白质，可以和酸性的,DNA,非特异性紧密结合，而且一般不要求特殊的核苷酸序列，通常用,0.25,mol/L HCL,或,H,2,SO,4,从染色质中分离得到。真核生物染色体的组蛋白有,5,种，即,H,1,、,H,3,、,H,2A,、,H,2B,和,H,4,。,组蛋白中，,H,3,，,H,4,，,H,2A,，,H,2B,，,其,N,端氨基酸都是碱性氨基酸，碱性,N,端借静电引力与,DNA,起作用，组蛋白之间借此相互聚合，,C,端是疏水端；而,H,1,则相反，,C,端是碱性氨基酸，,N,端是疏水端，而且,H,1,具有,4,5,种分子类型，所以在遗传上,H,1,保守性最少。,组蛋白可进行各种修饰。由于组蛋白,N,端赖氨酸的乙酰化，改变了赖氨酸所负载的电荷，从而影响了与,DNA,的结合，有利于转录的进行，而组蛋白的磷酸化主要在组蛋白,N,端丝氨酸残基上进行。现一般认为组蛋白磷酸化可减弱组蛋白与核酸的结合，从而降低组蛋白对,DNA,模板活力的抑制，从而利于转录进行。而甲基化组蛋白。,第一节,染色体,（,2,）非组蛋白,与染色体组蛋白不同与染色体组蛋白不同，非组蛋白是指染色体上与特异,DNA,序列相结合的蛋白质，所以又称序列特异性,DNA,结合蛋白,(,sequence,specificDNA,binding proteins),。,一般来说，非组蛋白所含酸性氨基酸的量超过碱性氨基酸的量，所以带负电荷。,非组蛋白和组蛋白不同，它具有种属和组织特异性，而且在活动的染色质中比不活动的染色质中含量要高。非组蛋白在整个细胞周期中都进行合成，而不像组蛋白仅在,S,期和,DNA,复制同步进行。,非组蛋白的功能：能帮助,DNA,分子折叠，以形成不同的结构域，从而有利于,DNA,的复制和基因的转录；协助启动,DNA,复制；特异性地控制基因转录，调节基因表达。非组蛋白和组蛋白一样可以被磷酸化，这被认为是基因表达和调控的重要环节。,第一节,染色体,2,染色质和核小体,（,1,）核小体结构的主要实验证据,用温和的方法破坏细胞核，将染色质铺展在电镜铜网上，通过电镜观察，未经处理的染色质自然结构为,30,nm,的纤丝，经盐溶液处理后解聚的染色质呈现一系列核小体相互连接的串珠状结构，念珠的直径为,10,nm,；,用微球菌核酸酶,(,micrococcal nuclease),消化染色质，经过蔗糖梯度离心及琼脂糖凝胶电泳分析发现，如果完全酶解，切下的片段都是,200,bp,的单体；如果部分酶解，则得到的片段是以,200,bp,为单位的单体、二体,(400,bp),、,三体,(600,bp),等等。蔗糖梯度离心得到的不同组分，在波长,260,nm,的吸收峰的大小和电镜下所见到的单体、二体、三体的核小体完全一致；应用,X,射线衍射、中子散射及电镜三维重建技术，研究染色质结晶颗粒，发现颗粒是直径为,11,nm,、,高,6.0,nm,的扁圆柱体，具有二分对称性,(,dyad symmetry),，,核心组蛋白的构成是两个,H,3,分子和两个,H,4,分子先形成四聚体，然后再与两个由,H,2A,和,H,2B,构成的异二聚体,(,heterodimer),结合成八聚体。,第一节,染色体,（,2,）核小体结构要点,每个核小体单位包括,200,bp,左右的,DNA,、,一个组蛋白八聚体以及一个分子的组蛋白,H,1,；,组蛋白八聚体构成核小体的核心结构，分子量,100,kD,，,由,H,2A,、,H,2B,、,H,3,和,H,4,各两个分子所组成；,DNA,分子以左手方向盘绕八聚体两圈，每圈,83,bp,，,共,166,bp,。,用微球菌核酸酶水解，可得到不含组蛋白,H,1,的,146,bp,的,DNA,片段,(1.75,圈,),。一个分子的组蛋白,H,1,与,DNA,结合，锁住核小体,DNA,的进出口，从而稳定了核小体的结构；两个相邻核小体之间以连接,DNA(1inkerDNA),相连，长度为,0,80,bp,不等（图,2-2,）。,第一节,染色体,A,B,图,2-2,核小体单体的存在及核心颗粒的形成,A,：,为核小体结构示意图；,B,：,为核小体单元的产生,第二节,DNA,的组成和结构,一、,DNA,的组成,1,碱基,核酸中的碱基分两类：嘧啶碱和嘌呤碱。嘧啶碱是母体化合物嘧啶的衍生物。核酸中常见的嘧啶碱有三类：胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。其中胞嘧啶为,DNA,和,RNA,两类核酸所共有。胸腺嘧啶只存在于,DNA,中，但是,tRNA,中也有少量存在；尿嘧啶只存在于,RNA,中。植物,DNA,中含有一定量的,5,甲基胞嘧啶。在一些大肠杆菌噬菌体,DNA,中，,5,羟甲基胞嘧啶代替了胞嘧啶。嘌呤碱有两类：腺嘌呤及鸟嘌呤。嘌呤碱是由母体化合物嘌呤衍生而来的。除了,5,种基本的碱基外，核酸中还有一些含量甚少的稀有碱基。稀有碱基种类极多，大多数都是甲基化的碱基。,tRNA,中含有较多的稀有碱基，可高达,10,。目前已知稀有碱基和核苷达近百种。图,2-3,A,是存在于,DNA,和,RNA,分子中的,5,种含氮碱基的结构式。,第二节,DNA,的组成和结构,2,核苷,核苷是一种糖苷，由戊糖和碱基缩合而成。糖与碱基之间以糖苷键相连接。糖的第一位碳原于（,C,1,）,与嘧啶碱的第一位氮原子,(,N,1,),或与嘌呤碱的第九位氮原子（,N,9,）,相连接。所以，糖与碱基间的连键是,N,C,键，一般称之为,N,糖苷键；核苷中的,D,核糖及,D2,脱氧核糖均为呋喃型环状结构。糖环中的,C,1,是不对称碳原子，所以有,及,两种构型。但核酸分子中的糖苷键均为,糖苷键。应用,X,射线衍射法已证明，核苷中的碱基与糖环平面互相垂直。,根据核苷中所含戊糖（图,2-3,B,）,的不同，将核苷分成两大类：核糖核苷和脱氧核糖核苷。对核苷进行命名时，必须先冠以碱基的名称，例如腺嘌呤核苷、腺嘌呤脱氧核苷等。,RNA,中含有某些修饰和异构化的核苷。核糖也能被修饰，主要是甲基化修饰。,tRNA,和,rRNA,中还含少量假尿嘧啶核苷,，,在它的结构中，核糖不是与尿嘧啶的第一位氮（,N,1,），,而是与第五位碳（,C,5,）,相连接。细胞内有特异的异构化酶催化尿嘧啶核苷转变为假尿嘧啶核苷。,第二节,DNA,的组成和结构,3,核苷酸,核苷的磷酸酯叫做核苷酸，分为,(,核糖,),核苷酸,(,ribo)nucleotide,和脱氧,(,核糖,),核苷酸,deoxy(ribo)nucleotide,两大类，分别构成,DNA,和,RNA,的基本结构单位。所有的核苷酸都可在其,5,位置连接一个以上的磷酸基团；从戊糖开始的第一、二、三个磷酸残基依次称为,、,、,。,和,及,和,之间的键是高能键，为许多细胞活动提供能量来源。核苷三磷酸缩写为,NTP,，,核苷二磷酸缩写为,NDP,。,5,核苷三磷酸是核酸合成的前体。,细胞内还有各种游离的核苷酸和核苷酸衍生物，它们都具有重要的生理功能。因此，对于核酸和蛋白质系统，核苷酸相当于氨基酸，碱基相当于氨基酸的功能基。下面列举几种核苷酸的结构式（图,2-3,C,）。,核糖核苷的糖环上有,3,个自由羟基，能形成,3,种不同的核苷酸。,(,图,2-3,C),脱氧核苷的糖环上只有,2,个自由羟基，所以只能形成两种核苷酸。生物体内游离存在核苷酸多是,5-,核苷酸。用碱水解,RNA,时，可得到,2-,与,3-,核糖核苷酸的混合物。,第二节,DNA,的组成和结构,图,2-3,碱基、戊糖和核苷酸的结构,A,：,碱基；,B,：,戊糖；,C,：,核苷酸,第二节,DNA,的组成和结构,二、,DNA,的一级结构,DNA,由数量庞大的,4,种脱氧核苷酸通过,3,，,5,磷酸二酯键连接而成，,DNA,的一级结构就是这些脱氧核苷酸在分子中的排列顺序（序列）。就是,DNA,分子内碱基的排列顺序。它以密码子的方式蕴藏着遗传信息，以碱基序列的方式蕴藏着对遗传信息的调控。,DNA,分子中碱基序列似乎是不规则的，实际上是高度有序的。任何一段,DNA,序列都可以反映出功能特异性和它的个体的、种族的特征。一级结构决定了,DNA,的二级结构、折叠成的空间结构。这些高级结构又决定和影响着一级结构的信息功能，即基因的启动和关闭。因此，研究,DNA,的一级结构对阐明遗传物质结构、功能以及它的表达、调控都是极其重要的。,DNA,几乎是所有生物遗传信息的携带者。它是信息分子，携带以下两类不同的遗传信息。一类是负责编码蛋白质氨基酸序列的信息。在这一类信息中，,DNA,的一级结构与蛋白质一级结构之间基本上存在共线性关系。,第二节,DNA,的组成和结构,另一类一级结构信息与基因的表达有关，负责基因活性的选择性表达和调控。这一部分,DNA,的一级结构参与调控基因的转录、翻译、,DNA,的复制、细胞的分化等功能，决定细胞周期的不同时期和个体发育的不同阶段、不同器官、不同组织以及不同外界环境下，基因是开启还是关闭，开启量是多少等等。这一类,DNA,一级结构有两种情况：它本身负责编码某些调控蛋白，这些蛋白质负责调控相应的基因；一些,DNA,一级结构区段负责基因表达的调控位点，即决定基因开启或关闭的元件。一般由调控蛋白与调控元件相互作用来有效地控制基因。后者成为调控蛋白作用的靶位点。,DNA,分子中有各种特异性元件，如与复制有关的各种位点都有它们特异性的一级结构。,DNA,分子总的,A+T,与,G+C,含量相等，但在某些区域,A+T,的含量大大增高。由于,A,T,碱基对有,2,个氢键，而,G,C,之间有,3,个氢键，在很多有重要调节功能的,DNA,区域都富含有,A,T,，,如启动子区域等，有利于双链的解开，某些蛋白质与解链部位的相互结合。,第二节,DNA,的组成和结构,三、,DNA,的二级结构,DNA,的二级结构指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。,1,双螺旋结构模型的依据,X,射线衍射数据说明,DNA,含有两条或两条以上具有螺旋结构的多核苷酸链，而且沿纤维长轴有,0.34,nm,和,3.4,nm,两个重要的周期性变化。,choqoe,等应用层柝法对多种生物。,DNA,的碱基组成进行了分析，发现中的腺嘌呤数目与胸腺嘧啶的数目相等，胞嘧啶,(,包括,5,甲基胞嘧啶,),的数目和鸟嘌呤的数目相等。后来又有人证明腺嘌呤和胸腺嘧啶间可以生成两个氢键；而胞嘧啶和鸟嘌呤之间可以允许生成,3,个氢键。用电位漓定法证明,DNA,的磷酸基可以滴定，而嘌呤和嘧啶的可解离基团则不能漓定，说明它们是由氢键连接起来的。,第二节,DNA,的组成和结构,由此得出,DNA,双螺旋模型的要点：,主链：,DNA,主链由脱氧核糖和磷酸相互间隔连接而成，从,3,，,5,磷酸二酯键的方向来看，双螺旋中,2,条多聚脱氧核苷酸链是反向平行的。,2,条主链处于螺旋的外侧，碱基处于螺旋的内侧，且主链是亲水性的。,2,条主链形成右手螺旋，有共同的螺旋轴，螺旋的直径是,2,nm,。,碱基配对特征：由于受几何形状限制，只有,A,和,T,配对，,G,和,C,配对，其形状才能正适合双螺旋的大小，安置在双螺旋内，不会使螺旋有任何畸变或丧失对称性。这两种碱基对还有另一个特征，就是处于一个平面具有二次旋转对称性，即一个碱基对旋转,180,并不影响双螺旋对称性。这意味着,A,T,、,T,A,、,G,C,和,C,G,四种碱基对形式都允许处在这种几何形状中，即双螺旋结构只限定配对方式，并不限定碱基的排列顺序。,第二节,DNA,的组成和结构,碱基：碱基环是一个共轭环，碱基对构成的平面与螺旋轴近似垂直，螺旋轴穿过碱基平面，相邻碱基对沿螺旋转,36,角，上升,0.34,nm,。,因此，每,10,对碱基绕轴旋转一圈组成一节螺旋，螺距,3.4,nm,。,大沟和小沟：沿螺旋轴方向观察，可以看到配对的碱基并没有充满螺旋的空间。由于碱基对与糖环的连接都是在碱基对的同侧，故这种不对称的连接导致双螺旋表面形成,2,个凹下去的沟，一个宽一个窄，分别称为大沟和小沟。糖一磷酸骨架构成大沟和小沟的两壁，碱基对边就是沟底，而螺旋轴通过碱基对中央。因此，大、小两沟的深度差不多，亦即从螺旋圆柱面至碱基对边之间的横向距离大致相等。双螺旋表面的沟对,DNA,与蛋白质的相互识别和结合都是很重要的。因为只有在沟内才能接触到碱基的顺序，而在双螺旋的表面则是脱氧核糖和磷酸的重复结构，似乎并无信息可言。当然，大沟和小沟之间存在着明显的差别。大沟的空间可容纳其它分子,“,阅读,”,沟内的碱基顺序信息，并可使其氮、氧原子与蛋白质的氨基酸侧链形成氢键而结合。而小沟没有足够大的空间与蛋白质分子识别和结合，但是在,B-DNA,的小沟内可观察到水合结构。（图,2-4,）是,DNA,双螺旋模型,第二节,DNA,的组成和结构,图,2-4,DNA,双螺旋模型,第二节,DNA,的组成和结构,2,DNA,双螺旋的种类,（,1,）右手螺旋的多重构象,表,2-1,不同螺旋形式,DNA,分子主要参数比较,第二节,DNA,的组成和结构,（,2,）左手螺旋,在,DNA,单链中存在嘌呤与嘧啶交替排列的顺序,CGCGCG,或,CACACA,时，则会出现左手双螺旋结构。在主链中各个磷酸根呈锯齿状排列，犹如,“,之,”,字形一样，因此叫做,Z,型构象,(,采用,Zigzag,第一个字母,),。,Z,型结构是所有,DNA,结构每圈螺旋碱基对最多的，因而有最少扭曲结构。比如，真核细胞中常出现胞嘧啶第,5,位碳原于的甲基化，形成局部疏水区，这一区域伸入,B,DNA,的大沟中，使,B,DNA,不稳定而转变为,Z,DNA,。,抗体可以区分,Z,型,DNA,和,B,型,DNA,。,这些抗体与果蝇染色体的特殊区域以及其它生物体的细胞核结合。在果蝇中，结合的区域比染色体有更为展开的结构,说明,Z,DNA,的存在是一种自然现象。,可以看出，,DNA,构象的多变性，或者说,DNA,二级结构的多态性，是在不同条件和具有特殊序列结构时才呈现出来的，说明,DNA,是一个可变的动态分子，以多变的构象实现内涵丰富的生物学功能。,第二节,DNA,的组成和结构,四、,DNA,的高级结构,DNA,的高级结构是指,DNA,双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构是,DNA,高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类，它们在特殊情况下可以相互转变，如：,DNA,分子的这种变化可以用一个数学公式来表示：,L=T+W,其中，其中为连接数，是指环形,DNA,分子两条链间交叉的次数。只要不发生链的断裂，,L,是个常量。,T,为双螺旋的盘绕数,(,twisting number),，,W,为超螺旋数,(,writhing number),，,它们是变量。,第三节,DNA,的复制,一、,DNA,的半保留复制机理,二、,DNA,复制的起点、方向和速度,DNA,在复制时，首先在一定位置解开双链，这个复制起点呈现叉子的形式，称为复制叉。一般把生物体能独立进行复制的单位称为复制子。实验证明，复制在起始阶段进行控制，一旦复制开始，就连续进行下去，直到整个复制子完成复制。每个复制子由一个复制起点控制。,原核生物的复制起始点通常在它染色体的一个特定位点，并且只有一个起始点，因此，原核生物的染色体只有一个复制子。真核生物染色体的多个位点可以起始复制，有多个复制起始点，因此是多复制子（表,2-2,）。且多个复制子不是同时起作用，而是在特定时间，只有一部分复制子（不超过,15%,）在进行复制过程。,关于,DNA,复制的方向和速度，最为普遍的就是双向等速进行（图,2-5,）。某些环状,DNA,偶尔从一个复制起始点形成一个复制叉，单向复制。而腺病毒则从两个起始点相向进行复制。,第三节,DNA,的复制,表,2-2,部分生物复制子的比较,第三节,DNA,的复制,图,2-5,放射性实验证明,DNA,的复制是从固定的起始点双向等速进行的,第三节,DNA,的复制,三、,DNA,复制的几种主要方式,1,线性,DNA,双链的复制,复制叉生长方向有单一起点的单向,(,如腺病毒,),及双向,(,如噬菌体,),，和多个起始点的双向几种，,DNA,双向复制时复制叉处呈,“,眼,”,型。线性,DNA,复制中,RNA,引物被切除后，留下,5,端部分单链,DNA,，,不能为,DNA,聚合酶所作用，使子链短于母链。,T4,和,T7,噬菌体,DNA,通过其末端的简并性,使不同链的,3,端因互补而结合，其缺口被聚合酶作用填满，再经,DNA,连接酶作用生成二联体。这个过程可重复进行直到生成原长,20,多倍的多联体，并由噬菌体,DNA,编码的核酸酶特异切割形成单位长度的,DNA,分子。,290,噬菌体和腺病毒基因组的末端含反向重复序列，复制时，,5,端首先与末端蛋白共价结合，开始互补链的合成。当另一条链完全被置换后，两端通过发卡结构相连，形成一个大部分序列互补的单链环形,DNA,分子，复制从其内部的起始位点开始按前导链方式双向进行，经过环形结构到达分子的另一部分，经双链结构交错切割后生成完整的子链病毒。除了环形部分发生重排之外，所生成的新,DNA,分子带有母链的全部遗传信息。,第三节,DNA,的复制,2,环状,DNA,双链的复制,（,1,）,型复制,型（图,2-6,）复制可以是双向或单向的，大多为等速双向，少数为不等速双向复制。两个共价封闭的互相盘绕的,DNA,双链在拓扑异构酶作用下从起始点（,ori,）,开始形成,DNA,切口和封闭，,DNA,的一条或两条主链骨架有暂时的切断，是,DNA,超旋或解旋，有利于复制叉向前移动。前导链,DNA,开始复制前，复制原点的核酸序列被转录生成短,RNA,链，作为起始,DNA,复制的引物。,（,2,）滚动环复制,它是很多病毒、细菌因子以及真核生,物中基因放大的基础。如：,X,174,，,T,4,噬菌体等的,DNA,都以如图2-7所示,第三节,DNA,的复制,图,2-6,DNA,复制的,型结构,第三节,DNA,的复制,（,3,）,D,型复制,线粒体和叶绿体具有双链环状,DNA,，,在电镜中观察到，线粒体,DNA,的复制叉曾呈现出,D,形。在复制开始时，双链环状,DNA,在特定,ori,位点出现一个复制泡,(,replicative bubble),，,双链解链。复制泡的亲代分子中以（,）链作为模板，合成一条新链，并且将亲代分子的（,+,）链置换出来，新链与它的模板形成部分双链。这样，在线粒体,DNA,的复制过程中，出现一条单链和一条双链组成的三元泡结构，称为置换环,(,displacement loop),或,D,环。（图,2-8,）。,第三节,DNA,的复制,图,2-7,环状,DNA,可以通过滚环式复制产生多单元,DNA,第三节,DNA,的复制,图,2-8,D,型复制的模型,第四节 原核生物和真核生物,DNA,的复制特点,一、原核生物,DNA,的复制特点,1,DNA,双螺旋的解旋,DNA,双螺旋分子具有紧密缠绕的结构，编码碱基位于分子的内部，因此在复制时，母本,DNA,的两条链应至少分开一部分，才能使,DNA,复制酶系统,“,阅读,”,模板链的碱基顺序。使,DNA,双螺旋解旋并使两条链保持分开的状态是个极其复杂的过程，现在已找到一些酶和蛋白质，它们或者能使,DNA,双链变得易于解开，或者可以使超螺旋分子松弛。,2,冈崎片段与半不连续复制,按照,Watson-Crick,假说，,DNA,的两条链的方向相反，所以复制时，如新生,DNA,的一条链从,5,向,3,端合成，则另一条链必须从,3,端向,5,端延伸。可是，迄今发现的,DNA,聚合酶都只能催化,DNA,链从,5,端向,3,端延长。,第四节 原核生物和真核生物,DNA,的复制特点,图,2-9,DNA,的半不连续复制,第四节 原核生物和真核生物,DNA,的复制特点,3,DNA,复制的引发与终止,在细胞提取物中合成冈崎片段时，不仅需要,dATP,、,dGTP,、,dCTP,和,dTTP,四种前体，还需要一个与模板,DNA,的碱基顺序互补的,RNA,短片段当作引物。有许多实验结果能证明,RNA,引物的存在。在多瘤病毒的体外系统中合成的冈崎片段是一个,5,端约,10,核苷酸长的，以,3,三磷酸为结尾的,RNA,。,这是一个强有力的证据。,第四节 原核生物和真核生物,DNA,的复制特点,图,2-10,大肠杆菌染色体,DNA,双向复制示意图,第四节 原核生物和真核生物,DNA,的复制特点,4,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，它有3,5,核酸外切酶活性，这种活性和聚合酶活性紧密结合在一起，既可合成,DNA,链，又能降解,DNA,，,保证了,DNA,复制的准确性。另外，它还有5,3,核酸外切酶的功能，可作用于双链,DNA,，,又可水解5,末端或距5,末端几个核苷酸处的磷酸二酯键，因而该酶被认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起着重要的作用。它也可用以除去冈崎片段5,端,RNA,引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来。,DNA,聚合酶具有5,3,方向聚合酶活性，但酶活性很低。若以每分钟酶促核苷酸掺入,DNA,的效率计算，只有,DNA,聚合酶的5，故也不是复制中主要的酶。其3,5,核酸外切酶活性可起校正作用。目前认为,DNA,聚合酶的生理功能主要是起修复,DNA,的作用。,DNA,聚合酶包含有7种不同的亚单位和9个亚基，其生物活性形式为二聚体。它有5,3,方向聚合酶活性，也有3,5,核酸外切酶活性。它的活力较强，为,DNA,聚合酶的15倍，,DNA,聚合酶的300倍。它能在引物的3,OH,上以每分钟约5万个核苷酸的速率延长新生的,DNA,链，是大肠杆菌,DNA,复制中链延长反应的主导聚合酶。表,2-3,介绍了上述,DNA,聚合酶的性质。,第四节 原核生物和真核生物,DNA,的复制特点,第四节 原核生物和真核生物,DNA,的复制特点,二、真核生物,DNA,的复制特点,1,真核细胞的每条染色体含有多个复制起始点。复制子的大小变化很大，约,5-300,kbp,。,复制可以在几个复制起始点上同时进行，复制起始点不是一成不变的。在发育过程中，活化的细胞有更多的复制起始点。例如，果蝇在胚胎发育早期，其最大染色体上有,6000,个复制叉，大约每,10,kbp,就有一个。,2,真核生物染色体在全部复制完成之前，各个复制起始点不能开始新一轮的复制。而原核生物中，复制起始点上可以连续开始新的复制事件，表现为一个复制子内套叠有多个复制叉。,3,真核生物,DNA,的复制子被称为自主复制序列（,ARS,），,长约,150,bp,左右，含有几个复制起始必须的保守区。并且其复制起始需起点识别复合物（,ORC,）,参与，并需,ATP,。,真核生物复制叉的移动速度大约只有,50,bp/s,，,还不到大肠杆菌的,1/20,。因此，人类,DNA,中每隔,3,x10,4,3x10,5,就有一个复制起始位点。,第四节 原核生物和真核生物,DNA,的复制特点,4,真核生物有多种,DNA,聚合酶，分别为在真核细胞中主要有,5,种,DNA,聚合酶，分别称为,DNA,聚合酶,、,、,、,和,，,真核细胞的,DNA,聚合酶和细菌,DNA,聚合酶基本性质相同，均以,dNTP,为底物，需,Mg,2+,激活，聚合时必须有模板链和具有,3,OH,末端的引物链，链的延伸方向为,5,3,。但真核细胞的,DNA,聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性，推测一定有另外的酶在,DNA,复制中起校对作用。,DNA,聚合酶,的功能主要是引物合成。,DNA,聚合酶,活性水平稳定，可能主要在,DNA,损伤的修复中起作用。,DNA,聚合酶,是主要负责,DNA,复制的酶，参与先导链和滞后链的合成。而,DNA,聚合酶,的主要功能可能是在去掉,RNA,引物后把缺口补全。,5端粒的复制 线性染色体的末端,DNA,称为端粒，端粒的功能主要是稳定染色体末端结构，防止染色体之间的末端连接。复制由一种特殊的酶-端粒酶所催化。真核生物线性染色体在复制后，不能原核生物那样填补5,末端的空缺，从而会使5,末端序列因此缩短。而端粒酶可以外加重复单位到5,末端上，维持端粒一定的长度。,第四节 原核生物和真核生物,DNA,的复制特点,三、,DNA,复制的调控,1,大肠杆菌染色体,DNA,的复制调控,染色体的复制与细胞分裂一般是同步的，但复制与细胞分裂不直接偶联。复制起始不依赖于细胞分裂，而复制的终止则能引发细胞分裂。在一定生长速度范围内，细胞与染色体的质量之比相对恒定，这是由活化物、阻遏物和去阻遏物及它们的相互作用所制约的。复制的功能单位，即复制子，由起始物位点和复制起点两部分组成。起始物位点编码复制调节蛋白质，复制起点与调节蛋白质相互作用并启动复制。起始物位点突变使复制停止并导致细胞死亡。,2,ColE1,质粒,DNA,的复制调控,ColE1,是一个6646,bp,的小质粒，在宿主细胞内拷贝数为2030。,ColE1 DNA,复制不依赖于其本身编码的蛋白质，而完全依靠宿主,DNA,聚合酶。质粒,DNA,编码两个负调控因子,Rop,蛋白和反义,RNA(RNA,1,)，,它们控制了起始,DNA,复制所必需的引物合成。,第四节 原核生物和真核生物,DNA,的复制特点,3,真核细胞,DNA,的复制调控,真核细胞的生活周期可分为,4,个时期：,G,1,、,S,、,G,2,和,M,期。,G,1,是复制预备期，,S,为复制期，,G,2,为有丝分裂准备期，,M,为有丝分裂期。,DNA,复制只发生在,S,期。,真核细胞中,DNA,复制有,3,个水平的调控：,（,1,）细胞生活周期水平调控,也称为限制点调控，即决定细胞停留在,G,1,期还是进入,S,期。许多外部因素和细胞因子参与限制点调控。促细胞分裂剂、致癌剂、外科切除等都可诱发细胞由,G,1,期进入,S,期。一些细胞质因子如四磷酸二腺苷和聚,ADP,核糖也可诱导,DNA,的复制。,（,2,）染色体水平调控,决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在,S,期起始复制，这种有序复制的机理还不清楚,.,（,3,）复制子水平调控,决定复制的起始与否。这种调控从单细胞生物到高等生物是高度保守的。此外，真核生物复制起始还包括转录话化、复制起始复合物的合成和引物合成等阶段，许多参与复制起始蛋白的功能与原核生物中相类似。酵母染色体复制只发生于,S,期,各个复制子按专一的时间顺序活化，在,S,期的不同阶段起始复制。,第五节,DNA,的损伤与修复,一、,DNA,的损伤来源,1,DNA,分子的自发性损伤,（,1,）互变异构,DNA,分子中的,4,种碱基自发地使氢原子改变位置，产生互变异构体，进一步使碱基配对的方式发生改变，这样在复制后的子链上就可能出现错误。例如：腺嘌呤的互变异构体,A,可以与,C,配对，胸腺嘧啶的互变异构体,T,与,G,配对，当,DNA,复制时，如果模板链上存在这些互变异构体，在子链上就可能发生错误，形成损伤。,（,2,）脱氨试剂及自发脱嘌呤和脱嘧啶,包括羟胺，是一种体外诱变剂；亚硫酸盐，主要改变,DNA,分子单链区的,CU,，,亚硝酸盐主要使,CU,，,也使,A,和,G,脱去氨基，但特异性较差，可引起体内外的广泛诱变。,（,3,）活性氧引起的诱变,活性氧为氧分子电子数大于,O,2,的,O,2,。,8,oxoG(GA),是一种氧化碱基,(7,，,8,、二氢,8,氧代鸟嘌呤,),，可与,C,、,A,配对，而,DNA,聚合酶,、的校正活性不能校正其错配，造成,GC,TA,的颠换，这种损伤可以积累。,H,2,0,2,是细胞呼吸的副产物，非常活跃，造成,DNA,氧化损伤时，产生胸腺嘧啶乙二醇、胸苷乙二醇和羟甲基尿嘧啶等，此类损伤一般能被修复。,第五节,DNA,的损伤与修复,2,物理因素引起的,DNA,损伤,紫外线（,UV,）,照射引起的,DNA,损伤主要是形成嘧啶二聚体，,DNA,分子最易于吸收的波长在,260,nm,左右，当受到大剂量的,UV,照射后，一条链上相邻的两个嘧啶核苷酸共价结合，形成环丁烷嘧啶二聚体。形成二聚体的反应可逆较长的波长（,280,nm,）,有利于二聚体的形成，较短波长（,240,nm,）,利于其解聚。二聚体的生成位置和频率与侧翼的碱基序列有一定关系。当人的皮肤暴露在阳光下，每小时由于,UV,照射产生嘧啶二聚体的频率为,5,x10,4,细胞。由于,UV,穿透力有限，故对人的伤害主要是皮肤。紫外线照射影响微生物的存活。,电离辐射对,DNA,的损伤有直接效应和间接效应两种途径。前者指辐射对,DNA,分子直接聚积能量，引起理化性质改变；后者指电离辐射对,DNA,存在的环境中其他成分(主要是水)沉积能量，引起,DNA,分子的变化。,第五节,DNA,的损伤与修复,3,化学因素引起的,DNA,损伤,（1）烷化剂对,DNA,的损伤 烷化