炎症动物免疫重复试验方案.doc

2010/11/15:
炎症动物免疫试验方案
（天津科技大学 食品与生物技术实验室）

一 目的
从类黄酮和异黄酮针对黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2)双酶抑制剂通过计算机虚拟筛选出的九种天然产物在小鼠体内中免疫保护效果的研究，为制定炎症通风的临床研究方案和药物提供实验依据。

二 材料
㈠ 从类黄酮和异黄酮筛选出的九种天然产物：
Luteolin, Apigenin, Scutellarein, Quercetin, Myricetin, Genistein, Isoquercitrin, Rutin, Hyperoside. XO及COX-2是痛风治疗过程中的两个重要靶点，筛选XO和COX-2双重抑制剂可以从多靶点的途径有效的控制炎症相关疾病如痛风的发生和发展。另外，XO以及COX-2也是各种癌症及其他重要疾病的重要靶点，本试验室已从天然产物采用计算机辅助筛选XO及COX-2的双重抑制剂，得到的天然产物黄酮为九种：Luteolin, Apigenin, Scutellarein, Quercetin, Myricetin, Genistein, Isoquercitrin, Rutin, Hyperoside.
由于淋巴细胞是人体最主要的免疫细胞，由该细胞介导的这种炎症反应在各种风湿、痛风等疾病，尤其是类痛风炎症病理过程中起着主导作用，这类免疫性炎症模型对研究抗炎抗痛风药物具有重要价值。因此在细胞水平上建立T淋巴细胞模型--这类免疫性炎症模型对研究抗炎抗痛风药物具有重要价值。

㈡ 动物：
1．小鼠品系及特点
BALB/C小鼠，雄性，15只体重(20±2)g 。
该品系为白化小鼠,对致癌因子敏感;自发高血压症;一般无互相侵袭匀性,较容易群养,对放射线极度敏感等品系特征,故已越来越广泛地被用于肿瘤、生翟、免疫等方面的研究和单克隆抗体制作等新技术。
2．饲养条件（包括动物房及饲料等）
饲养条件：清洁级动物房，温度21－23℃，相对湿度44－65％。自由饮水，饮食。
㈢ 试剂：
1．COX-2、RPMI1640培养基（GIBCO BRL）；胎牛血清（Fetal Calf Serum）（兰州民海生物工程有限公司）；Concanavalin A（Con A）、IL-1（美国Sigma），台盼蓝（TryDan blue）（美国Sigma）；Cycloheximide（CHX），MTT，DMSO （Dimethyl Sulphoxide），T淋巴细胞分离液(China,Dakewe)， DMSO。药品：XO, xanthine, allopurinol, myricetin, and isoquercitin (Sigma); Apigenin, quercetin, luteolin, scutellarein, and rutin (Nanjing Tcm Institute of Chinese Materia Medica); Hyperoside (National Institute.)
2. 流式分析： FITC anti-mouse CD-4; PE anti-mouse COX-2
3. 仪器：二氧化碳细胞培养箱，灭菌锅，制冰机，倒置显微镜，Nikon出品；Spectrum MAXl90酶标仪（美国MD公司），细胞培养板（美国COSTAR公司），微量加样器（10mL，200mL和l000pL）（德国Eppendoff），无菌实验台；台式离心机；电子天平，Millex微孔滤膜（0.22μm）（爱尔兰Carrighwohill公司）。
4. 耗材：解剖剪，镊子，15/50ml离心管，移液器，加样槽，Tip头，1/10ml吸管。
5筛选产物对急性痛风炎小鼠前列腺组织中环氧化酶-2(COX-2) mRNA表达的影响： RNA 提取试剂盒，引物）为：?
三 设计思路与实验设计
㈠ 设计思路：
通过使用虚拟筛选出来的天然产物，重点研究：（1）细胞水平反映的是药物对细胞的整体作用。（2）动物水平反映的天然产物使用时间后的免疫保护效果差异。

㈡ 实验设计：
1． 分子水平：
方法：使用试剂盒COX Fluorescent inhibitor screening assay kit (cayman.)
本实验室已做。
2． 细胞水平
2.1试剂: RPMI1640培养基; FBS; 双抗；
MTT溶液的配制：MTT溶于PBS(0．01 mol·r，pH7。4)配成5mg／mL贮备液，溶解后用0．22pm的微孔滤膜除菌。4℃避光保存。两周有效。
刺激剂：Concanaval in A （Con A）/IL-1；
台盼蓝储液配制：称取4．Og台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，之后加双蒸水至lOOmL，4℃保存。使用时用PBS稀释成0．4％的浓度。
2.2实验流程: 利用T 淋巴细胞模型进行筛选评价
A． 解剖正常小鼠，分离脾脏
B． 从脾脏里分离PBMC [注意无菌操作]
C． 分别用IL-1,Con A刺激分成两组
D． MTT检测吸收值
E． 流式仪分析CD4+/COX-2：通过血常规技术结合流式分析可得到CD4细胞的绝对计数和COX-2的表达量。

2.3实验方法:
2.3.1 工作液的制备:
培养基:10%FBS的1640+1%双抗+1%谷氨酰胺
样品制备：
2.3.2淋巴细胞悬液的制备
A. 断颈处死小鼠，浸入 75%的乙醇中浸泡 1-2 分钟。
B. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。
C. 在 35mm培养皿中放入 4-5mL EZ-Sep™ Mouse 1X 淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。 （每研磨一只脾脏花费的时间最好控制在 5 分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）
D. 把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约 200uL 的1640 培养基。
2.3.3细胞活性的计数
取一定浓度的细胞，于倒置显微镜下加入少量台盼蓝进行染色测定，镜下观察活细胞数。
2.3.4细胞测定的方法
分别加入一定浓度的100uL细胞悬液和10uL的待测药物于96孔细胞培养板中，混匀后放入5％CO2、37。C培养箱孵育60min，再加入10uL的Con A(终浓度为10ug／mL)，继续培养一定时间。培养结束后，每孔加入不同量的MTT染色液，反应不同时间后去上清，加入150uL的DMSO，震荡溶解并在酶标仪上检测(最佳测定条件进行考察)。

A最大吸收波长的考察 B 加入Con A后反应时间的考察 C刺激指数(Stimulation Index，SI)的测定 D MTT加入量的考察 E加入MTT后反应时间的考察

A 无菌制备细胞悬液，取100 uL的细胞悬液，最后所得溶液充分溶解后用酶标仪在400～750nm波长范围内依次扫描，测定最大吸收波长。

B按上法制备细胞悬液，分别考察加入10 uL的Con A和IL-1 (终浓度为10ug／mL)后0、24、48、72、和96h的A值。测定在多少h的时候具有最大的吸收值。
time
0
24
48
72
96
Con A

IL -1

The absorbance at different time after adding Con A\ IL -1

C 文献报道胞密度为6×10-9 /L时，具有最大的刺激指数。
D MTT加入量的考察：按上述方法制备细胞悬液，然后分别加入5，10，15，20，25和30uL的MTT(5mg/mL，即相当于每孔加入25，50，75，100，125和150ul的MTT)，测定
MTT（ug）
25
50
75
100
125
150
A Value

The effect of different quantity MTT on the absorbrance

E 加入MTT后反应时间的考察: 于上述方法培养的淋巴细胞，加入Con A、IL-1后反应 B项检测结果的时间后加入MTT液后，在反应的l、2、4、6和8小时时，分别进行测定，检测在多长时间具有最大的吸收值
Time
1
2
4
6
8
10
Con A
(A Value )

IL-1
(A Value )

The absorbance at different time after MTT was added to cultured splenocytes

2.4. 实验布局
分组
IL-1
Con A
对照allopurinol

--

Luteolin,~ Hyperoside

AA

相关技术：
分离PBMC：
一脾脏
实验器材
1. EZ-Sep™ Mouse 1X 淋巴细胞分离液
2. 无菌 35mm 培养皿
3. 200 目尼龙网，裁成 90mm*90mm正方形，灭菌
4. 10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌
5. 不同规格镊子、剪刀若干，灭菌
6. 细胞实验常用器材，如离心管，移液管，加样枪，离心机等
实验方法
1. 断颈处死小鼠，浸入 75%的乙醇中浸泡 1-2 分钟。
2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。
3. 参考图一，在 35mm培养皿中放入 4-5mL EZ-Sep™ Mouse 1X 淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离） 。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。 （每研磨一只脾脏花费的时间最好控制在 5 分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发。使得密度与渗透压改变，影响分离效果）
4. 把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约 200uL 的1640 培养基。
注意：
○ 1 离心前在细胞悬液上面加盖一层 1640 培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，200uL 足矣。
○ 2 如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨完一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加 1640 覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。
5. 800g 离心 30分钟。※注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档） 。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在 1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示。
6. 吸出淋巴细胞层， 再加入 10mL 1640 培养基， 250g 离心 10 分钟。 倾倒上清液， 加入 3-5mL Lympho-Spot™
7. 无血清培养基重悬，细胞计数。

二全血
7. EDTA抗凝血分别取100ul全血两管做流式染色、血常规
8. 将所有血转移至15ml离心管，24℃ 1700rpm 10分钟
9. 取血浆每个冻存管加0.3-0.4ml（提RNA 做viral load）
10. 每个15ml离心管加入12ml 1*PBS，充分混匀（血：PBS = 1：4）
11. 将每个50ml离心管加入10ml 分层液
12. 将稀释的血液缓慢加到分层液表面，注意不要破坏液面
13. 24℃ 600克力 30分钟，加速度为4,减速度为0
14. 将分层液上面一层白膜吸出至另一50ml离心管中
15. 加入1*PBS 15ml，充分颠倒混匀
16. 24℃ 1700rpm 10分钟，倒掉上清，打散细胞团，加入1640培养基（含2%胎牛血清）定容至5ml，取50ul 计数
17. 加入1640培养基（含2%胎牛血清）15ml，充分颠倒混匀
18. 24℃ 1700rpm 10分钟，倒掉上清，打散细胞团，补充1640培养基（含20%胎牛血清、1%抗肝和1%IL-2）15ml

流式染色：（EDTA抗凝）：

1. 每管每种抗体各5ul
2. 加入全血或细胞100ul/管，震荡混匀，避光20分钟
3. 震荡同时加入融血素500ul，放置10分钟，直到呈透亮状
4. 震荡同时加入1*PBS 1ml
5. 1500 rpm离心5分钟，倒上清，震荡散开
6. 加入300ul/200ul 固定液，震荡混匀

3动物水平
方法：在细胞水平基础上，晒出来的2种左右天然产物 （需要细胞实验做完以后再进行评价）
F． 小鼠12只，随机分天然产物大剂量组、小剂量组、西药秋水仙碱对照组、中药痛风定片组(O．609／kg·d)7组，空白对照组（2只）、模型组每组各5只。每只每天给药？ml／kg，空自对照组、模型组每日灌胃等体积生理盐水，连续灌胃给药15天。末次给药lh后 造模，静脉注射LPS\Con A ，处死，取血，取脾脏，检测。
G． 每天尾静脉取血
H． 流式测 CD4 ，COX-2 的表