小鼠肾脏细胞系的建立.doc

小鼠肾脏细胞系的建立
细胞工程实验方案

设计题目：小鼠肾脏上皮细胞系的建立

设计者：班级 生物1101
姓名 马聪冲
学号 20113087

指导教师：陈晓明

日 期： 2013年11月11日

西南科技大学

生命科学及工程学院

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目 录

一、基本原理
（一） 基本概念
二、准备工作
（一） 实验所需试剂及材料
（二） 实验所需的器材及设备
（三） 基本用液的配置
（四） 器材清洗、干燥及消毒
三、实验步骤
（一）取材
（二）原代培养
（三）传代培养
（四）细胞纯化
（五）细胞系的建立
（六）细胞冷冻保存
（七）冻存细胞的复苏
四、注意事项

小鼠肾脏上皮细胞系的建立
一 基本原理
动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。这个实验方案就是选取小鼠肾脏上皮利用动物细胞培养技术建立细胞系。
二 准备工作
1. 实验所需的试剂及材料
健康小鼠、火柴、酒精灯、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、EDTA、稀盐酸、蒸馏水、20%新洁尔灭、70%乙醇、D-Hanks液、甲醛、高锰酸钾、甘油、滤纸、0.22滤膜、台盼蓝、培养基成分（见表）
2. 实验所需器材及设备
培养皿、镊子、手术刀、手术剪刀、小烧杯、吸管、三角瓶、棉球、细胞计数板、滤器、毛刷、超净工作台、紫外灯、液氮、冻存管、溶液瓶、量筒、毛帕、脸盆、一次性手套
3. 基本用液的配置
RPMI-1640培养基的制备及消毒
序号
化合物名称
含量 (mg/L)
序号
化合物名称
含量 (mg/L)
1
L-精氨酸
290.00
21
硝酸钙
100.00
2
L-门冬酰胺
50.00
22
无水硫酸镁
48.84
3
L-门冬氨酸
20.00
23
无水磷酸二氢钠
676.13
4
L-胱氨酸二盐酸盐
65.15
24
氯化钾
400.00
5
L-谷氨酸
20.00
25
氯化钠
6000.00
6
甘氨酸
10.00
26
葡萄糖
2000.00
7
L-组氨酸
15.00
27
还原谷胱甘肽
1.00
8
L-羟脯氨酸
20.00
28
酚红
5.00
9
L-异亮氨酸
50.00
29
L-谷氨酰胺
300.00
10
L-亮氨酸
50.00
30
生物素
0.20
11
L-赖氨酸盐酸盐
40.00
31
D-泛酸钙
0.25
12
L-甲硫氨酸
15.00
32
叶酸
1.00
13
L-苯丙氨酸
15.00
33
i-肌醇
35.00
14
L-脯氨酸
20.00
34
烟酰胺
1.00
15
L-丝氨酸
30.00
35
氯化胆碱
3.00
16
L-苏氨酸
20.00
36
盐酸吡哆醇
1.00
17
L-色氨酸
5.00
37
核黄素
0.20
18
L-酪氨酸
23.19
38
盐酸硫胺素
1.00
19
L-缬氨酸
20.00
39
维生素 B 12
0.005
20
对氨基苯甲酸
1.00

常用的培养基灭菌方法有化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤灭菌。因为化学药剂及培养基的一些成分作用，所以不采用；因为紫外线的穿透能力弱，所以仅用于表面消毒和空气的消毒。所以本次实验采用湿热灭菌
D-Hanks液的配制：
1）溶解定容：将药品（NaCl：4.0g，KCl：0.2g，Na2HPO4·12H2O：0.06g，KH2PO4：0.3g， NaHCO3：0.15g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至500ml，摇匀即成新配制的D-Hanks溶液。
2）移入溶液瓶内待消毒：将D-Hanks倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
0.02%EDTA溶液的配置：
EDTA0.20g、Nacl8.00g、KCl0.20g、葡萄糖2.00g、0.5%酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。
胰蛋白溶液:
1） 用少量的D-Hanks液把胰蛋白酶粉末调成糊状
2）补足D-Hanks液，震荡摇匀，置4℃冰箱内过夜
3）次日，等胰蛋白酶溶解后用滤纸过滤
4）滤纸再经过0.22滤膜除菌
5）分装小瓶放到冰箱内低温保存
6）使用时，用NaHCO3调节至PH7.0左右
0.4%台盼蓝母液：
称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。
4. 器械清洗、干燥及消毒
（1）常用的器械消毒方法大概分为两类，一类是物理灭菌，主要包括湿热灭菌、过滤灭菌、干热灭菌和紫外线灭菌。还有化学方法主要包括熏蒸消毒和药剂喷雾消毒。这次试验，我采用以下消毒方式。
1） 高压蒸汽灭菌：也称湿热灭菌，适用于对一般培养基、玻璃器皿、布类、橡胶制品、金属器械等的灭菌。高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。一般在103-137kPa压力下，15-30分钟，所有微生物包括芽孢在内都可被杀死。灭菌后需要及时烘干。
2） 紫外线灭菌：细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线波长为200-300nm,其中，以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线穿透物质的能力很弱，所以只适用于空气中和物体表面的灭菌。实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射20到30分钟灭菌，关闭紫外灯并打开无菌操作台风机运转10分钟，然后用70%乙醇擦拭无菌操作台台面及四周，并开始实验。
3） 无菌操作室的灭菌，一般用甲醛和高锰酸钾熏蒸法定期熏蒸消毒，在实验室用甲醛和高锰酸钾封闭消毒期间，不宜进入消毒空间。消毒后通风换气，等气味散尽后再出入。使用前用20%新洁尔灭对接种室内墙壁、地板及设备擦拭，用70%乙醇喷雾，用紫外线灭菌20分钟。照射期间关闭接种室的门窗。
（2）、玻璃器皿的洗消：
1）自来水刷洗，除去灰尘。
2）烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3）刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4）泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5）烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
6）高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7）高压消毒后烘干
（3）、橡胶和塑料：
橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：
1） 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2） 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
3） 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4） 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。

三．实验步骤
1. 取材
1） 将小鼠引颈杀死。
2） 将小鼠尾巴提在手上，身体全部浸入酒精30秒到一分钟，时间不能过长，以免酒精进入小鼠体内。
3） 用酒精灯火焰消毒后的手术剪刀在小鼠胸腔部位附近环行剪开皮肤。
4） 将小鼠翻转剥皮。
5） 开腹
6） 定位肾脏的位置，轻轻的用镊子夹出，取材
2.原代培养
原代培养一共有两种培养方法，分别是组织块培养法和分散细胞培养法。组织块培养法又包括薄层培养法和翻转干涸法。分散细胞培养法包括机械分散法和消化分散法。这两种方法相比，组织块法操作简单，不易污染，适合真皮细胞、骨骼肌细胞、牙髓细胞等的培养，但是由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞，而且所需时间较长。分散细胞培养法适用于大量细胞的培养，细胞的产量高，但是步骤繁琐，容易污染。
这里，我们采用分散细胞培养法的方法来进行培养。（能在短时间得到结果）
1） 先将材料切成2-3mm2的小块
2） 加D-Hanks液清洗干净，沉淀，去掉上清液
3） 加入胰蛋白酶4℃消化（6-24h）
4） 清洗干净沉去上清
5） 加新消化液37℃消化（20—30min）
6） 清洗干净沉去上清
7） 加营养液并吹打
8） 计数
9） 接种培养
3.传代培养
传代培养具体包括贴壁的细胞消化法传代和悬浮细胞的传代。这里我们采用第一种方法。
1） 先吸除培养液
2） 用PBS洗涤细胞一到二次
3） 根据细胞贴壁的牢固程度，可分别选用0.08%、0.025%、0.25%浓度的胰蛋白酶-EDTA溶液，用其量为1mL/25cm2 ,2mL/75cm2 ,37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察。当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉消化液。
4） 加入适量含新鲜血清的培养液终止胰蛋白酶作用，离心后再吸掉上清液。
5） 轻拍培养瓶使细胞自己脱落，加入适量的新鲜培养液，用吸管吸打数次以分散细胞团块，混合均匀后，按合适的比例稀释后转入新的培养瓶培养。
4.细胞纯化
细胞纯化主要可分为自然纯化和人工纯化。
（1） 自然纯化 利用某一细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，最后留下生长优势细胞，去除其他细胞，达到细胞纯化的目的
（2） 人工纯化 利用人为手段对某一细胞生长创造有利的环境条件，抑制其他细胞的生长，而达到纯化细胞的目的。包含酶消化法、机械刮除法、反复贴壁法、克隆法、流式细胞仪技等其他方法。
由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，这里采用酶消化法。通常是成纤维细胞先脱壁。
1） 先用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞，然后再换新的混合液继续消化，之后在倒置显微镜下 观察并不时摇动培养瓶，等到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化。
2） 把消化液吸入离心管中，离心去上清，然后移入另一个培养瓶中，加培养液置温箱中培养。再向原瓶内补加新的培养液继续培养。经过反复处理，可把成纤维细胞除净。
5.细胞系的建立
1） 细胞形态观察：主要包括细胞的形态、核质比例、染色质、核仁大小和多少以及微丝微管的排列状态。
2） 细胞生长曲线的测定：细胞生长曲线的测定有细胞计数法、四挫盐比色实验和CCK-8试剂盒检测法这三种方法。这里采用MTT来进行测量。基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。然后用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接放映活细胞数量。
3） 细胞分裂指数:分列指数是指细胞群体中分裂细胞所占的百分比。一般要观察和计算1000个细胞中的细胞分裂相数。获得分裂相数后可以绘制细胞分裂指数曲线。
4） 细胞接种存活率：当细胞被制成分散的悬液后，接种到底物上能贴壁并能存活生长的细胞百分数值称为接种存活率，用以表示细胞群的活力。细胞接种存活率=（贴壁存活细胞数/接种细胞数）×100%
5） 细胞周期：选择对数生长期细胞，用消化法制成细胞悬液，使细胞成为单个细胞，不能成团。然后根据流式细胞仪的检测步骤进行操作。最后计算出细胞周期。
6） 细胞活力的检测：细胞损伤或死亡时，某些染料可穿破透变性的细胞膜，及解体的DNA结合而着色。借此鉴别死细胞及活细胞。
7） 细胞种属的鉴定：可以用荧光抗体染色鉴别、同工酶谱系鉴别。然后进行染色体分析，人主要组织相溶性抗原，和核酸技术来鉴定和培养细胞中等位基因的多态性。
6.细胞冷冻保存
细胞在-70℃以下时，酶活性降低，代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键在于通过-20-0℃阶段的冷冻过程。在此范围内，易造成细胞的严重损伤。如果不加任何保护剂，细胞内外的水分很快会形成冰晶，导致细胞内电解质浓度增高，pH改变，部分蛋白质变性从而造成细胞死亡。一般添加两大类保护剂：一种是渗透性保护剂，如甘、二甲基亚砜、葡萄糖等，第二种是非渗透性保护剂如乳糖、蔗糖、麦芽糖等。主要过程是将对数期细胞以等体积20%培养液重悬，并分装于冷冻管中，封口，然后降温至4℃30min，冰盒10min，液氮罐气相2h，最后投入液氮中保存。
7.冻存细胞的复苏
由于冻存细胞比较脆弱，要轻柔操作，融化要快速，解冻后直接加入完全生长培养基。这里采用直接铺板法。取出冻存细胞，37℃水浴中快速融化，移入完全生长培养基，进行活细胞计数，细胞接种密度为3×105个/mL。培养12到24小时，更换新鲜的培养基，以去除冻存剂。
四．注意事项
1） .配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2） 安装过滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
3） 配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。
4） 在引颈杀死小鼠的时候，要注意手的位置及方法，以免被老鼠咬到。如果被咬，要及时报告给老师，以尽快的进行疫苗注射。
5） 在用手术剪刀等锋利器具时要注意，以免被割伤。
6） 在对实验室及实验器具进行消毒的时候，要小心使用有腐蚀性的液体，必要时带上手套。
7） 在细胞培养的时候，要注意所加试剂的用量等，以免损伤细胞。