微生物限度检查操作规程.doc

微生物限度检查操作规程

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操作规程（SOP）
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《中华人民共和国药典》2010年版、《中国药品检验标准操作规范》2010年版
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年 月 日
微生物限度检查操作规程

1. 目的
建立一个微生物限度检查（包括细菌、霉菌、酵母菌）标准工作程序，规范QC微生物限度检查人员的微生物限度检查操作。
2. 范围
适用于本公司的细菌、霉菌、酵母菌的限度检测。
3. 责任者
QC微生物限度检查人员；质量管理部
4. 内容
4.1检测准备
4.1.1 QC人员接到微生物限度检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定微生物限度检查所需的容器具、试液、培养基等的项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行微生物限度检查前的准备工作。
4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。
4.2 供试液的制备
4.2.1 供试液 供试液是指按照供试品的理化特性及生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。
4.2.2 供试液的制备 根据供试品的理化特性及生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。
4.2.2.1 可溶性液体供试品
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微生物限度检查操作规程
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操作规程（SOP）
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编订依据
《中国药典》2010年版、《操作规范》2010年版
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取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。
4.2.2.2 非水溶性液体供试品
油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。
4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品
称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
4.2.2.4 非水溶性供试品
取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。
4.2.2.5肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10 g，加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。
4.2.2.7具抑菌成分供试品
当供试品抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查，一般使用培养基稀释法，取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。取低稀释级供试液（原液或1:10的供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或<0.2ml），每个平皿倾注培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，按每1ml分注的平皿点计菌落数之和计数，即为每1ml的菌落数，共得2组数据，再以2组数的平均数乘以稀释倍数的值报告菌数。
4.2.2.8 供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃，时间为30min。

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微生物限度检查操作规程
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编订依据
《中国药典》2010年版、《GMP》2010年版
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4.2.3 供试液的梯度稀释（10倍递增稀释法）
4.2.3.1 取3或4支灭菌试管，分别加入9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释剂。加稀释剂后，应立即塞上试管塞。
4.2.3.2 另取1支1ml灭菌吸管，右手执管插入1:10（1级）均匀供试液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次，吸液时，先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴及容器内壁，调整液量至1ml刻度，左手执装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管并将塞打开，倾斜，将吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面），缓慢地放出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体），混匀，即为1:100供试液（2级）。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1:103、1:104等适宜稀释级（3~4级）。每递增1稀释级，必须用另一支吸管。
4.3菌落计数
4.3.1 培养基选择及标记
细菌限度检测使用营养琼脂培养基，标记符号为X；霉菌或霉菌和酵母菌限度检测使用玫瑰红钠琼脂培养基，标记符号为M；酵母菌限度检测使用酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基，标记符号为J。
4.3.2 在供试液梯度稀释的同时，以该稀释级吸管吸取该稀释级供试液各1ml至每个事先准备的90mm的灭菌平皿中，或从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管吸供试液各1ml至每个灭菌平皿中，方法是左手执平皿，将皿盖半开，右手执吸管，将1ml供试液慢慢地全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。每一稀释级每种培养基至少注2~3个平皿，一般取适宜的连续2~3个稀释级的供试液进行细菌、霉菌和酵母菌数测定。
4.3.3 阴性对照
待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管同法吸取稀释剂（H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入平皿中，每一种培养基分别注2个平皿作为阴性对照。

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《中国药典》2010年版、《GMP》2010年版
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4.3.4 倾注培养基
4.3.4.1将预先配制好的微生物限度检查的培养基（营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、YPD琼脂培养基）溶化，冷至约45℃时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或逆时针方向快速旋转平皿，使供试液或稀释液及培养基混匀，置操作平台上待凝。
4.3.4.2 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1hr，否则可能导致微生物繁殖或死亡而影响计数结果。
4.3.4.3 为了避免菌落蔓延生长，可将已凝固的琼脂培养基平皿开盖，倒置斜放在操作平台上，开机1~2hr后合盖，放入培养箱培养。
4.3.5 培养
4.3.5.1 一般细菌计数平板倒置于30~35℃培养箱中，培养3天（72hr）。
4.3.5.2 霉菌、酵母菌计数平板倒置于23~28℃培养箱中，培养5天（120hr）。
4.3.6 菌数计数
4.3.6.1 一般将平板置于菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。切勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落及供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡和油滴等的鉴别。必要时用放大镜或低倍显微镜直接观察，或挑取可疑物涂片镜检。
4.3.6.2 供试品稀释液常含有不溶性原料和辅料，培养基注皿后也可能产生沉淀，经过培养后又是形成数量很多的有形物，而且难以及菌落相鉴别，为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿1~2个，注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数时作为对照。
4.3.6.3若平板上有2个或2个以上菌落重叠，则在肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状或片状、云雾状菌落，菌落间无明显界限时，则一条链、片作为一个菌落计数；但若链、片上出现性状及链（片）状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数；若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，其外缘有若干性状相似的单个菌落，则一般不宜作为计数用。

4.3.6.4 若各稀释级2个平板菌落的平均数在15个以上，同稀释级二平板菌落数相差1倍时，该稀释级菌落数不得作为计数依据；当2个平板菌落均数在15（含15）以下时，两个平板菌落数的差值允许范围为0~4、1~7、2~~9、3~~10、4~12、5~~14、6~15、7~17、8~18、9~19、10~20.超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。
4.3.6.5 菌落生长呈蔓延趋势者，细菌、霉菌需逐日作初步点计，在点计霉菌菌落时，应轻轻翻转平板，勿反复翻转，否则会使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差。
4.3.6.6 在3天点计细菌、5天点计霉菌或酵母菌时，如果菌落极小，不易辨计，可延长培养时间至7天，再点计菌落数。
4.3.6.7 含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基点计霉菌数，YPD琼脂培养基点计酵母菌，两者计数值合并报告。
4.3.6.8 在特殊情况下，若营养琼脂培养基上生长的霉菌和酵母菌菌落其数量多于玫瑰红钠琼脂培养基上生长的霉菌和酵母菌菌落，或玫瑰红钠琼脂培养基上生长的细菌数，多于营养琼脂培养基上生长的细菌数，则以菌落数多的培养基中的菌数报告结果。
4.3.7 菌数报告规则
细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm3供试品中所含的菌数。如果各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，则以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
4.4 菌落检定 参照附表执行

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《中国药典》2010年版、《GMP》2010年版
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编订依据
《中国药典》2010年版、《GMP》2010年版
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附表：细菌、霉菌和酵母菌形态特征比较（营养琼脂以及玫瑰红钠琼脂平板）

项目
细菌
霉菌
酵母菌
菌落
大小
差别很大，在同一平板上可出现从针尖大小至大于10mm菌落
一般较大，也有细小的菌落。在同一平板上生长的菌落大小有时不一致
多数直径为1~2mm，在同一平板上生长的菌落大小有时不一致
外观形态
多样，小而突起或大而扁平
多为圆形，有的蔓延生长为无定形
培养基表面生长者多为圆形，内层生长者为圆形、铁饼、纺锤或三角形
色泽
白、灰白或无色，也有淡褐、淡黄以及淡红色。菌落正反面颜色相同
小菌落灰白，大菌落形成孢子后颜色多样。菌落正反面颜色不同
乳白或粉红色多见，在同一平板上色调较同一
透明度
透明或不透明
小菌落半透明有明显折光性，大菌落不透明
透明较差
边缘
整齐或不整齐，有放射线状、树枝状、锯齿状或卷发状。低倍镜下一般见不到边缘
菌丝体构成多呈放射状

整齐，低倍镜下可见球状、卵圆状或假菌丝状，细胞细密排列
气味
一般有臭味
往往有霉味
多带酒香味
及培养基结合
不结合
结合较牢固，不易挑取
不结合，易挑取
生长速度
一般很快
较慢
较快
细胞
形态
球或杆状，细小均一，高倍镜或油镜下可观察形态
菌丝体相互交织，成熟霉菌常有产孢组织及孢子
多数为圆或椭圆形，常有芽体相连
排列
单个、分散或有一定的排列方式
丝状交织
单个分散