分子生物学方法鉴定微生物幻灯片.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物分子生物学鉴定,微生物分类学定义：,按微生物的亲缘关系和进化规律,把它们安排成条理清楚的各种分类单元,或分类群的科学。,1,微生物的鉴定,主要步骤：纯化、测定一系列必要的指标、查找权威性鉴定手册,鉴定方法分四个水平,：,细胞的形态和习性水平：形态特征、运动、酶反应、营养要求及生长条件等,细胞组分水平：细胞壁成分、氨基酸库、脂类、醌类、光合色素等的分析,蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等,基因或,DNA,水平：核酸分子杂交,、（,G+C,）,mol%,、转化和转导、,16SrRNA,寡核苷酸族分分析、,DNA,或,RNA,核苷酸序列分析等,2,类别,分子生物学,菌种鉴定,DNA,碱基比例的测定,16S rDNA,序列分析法,全基因组序列的测定,随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平,核酸分子杂交,3,一、,DNA,的碱基组成,(G+C)mol%,(G+C)mol%=,A+T+G+C,G+C,X100%,1),DNA,碱基比例,的测定,是指,（,G+C,）,mol%,值,，简称,“,GC,比,”,，,表示,DNA,分子中鸟嘌呤和胞嘧啶所占的摩尔百分比值。,AT,间仅形成,2,个,氢键，,GC,间可形成,3,个,氢键。,GC,值根据样品的,T,m,值,计算。,4,通过,核酸,分析鉴定微生物遗传型,生物,GC,比的特点,亲缘关系,相近的,种，其,GC,比,也相近,；反之，,GC,比相近的两个种，它们的亲缘关系则,不一定,都很接近。,GC,比,差距很大的,两个种，其亲缘关系必然,较远,。,GC,比是建立新,分类单元,时的可靠指标,GC,比相差,5%,时，为不同种；,GC,比相差,10%,时，为不同属,。,5,测定,DNA,碱基组成的方法：,由于热变性温度法操作简单、重复性好而最为常用。,基本原理：将,DNA,加热，两条单链逐渐被打开，从而使,DNA,溶液,260nm,紫外吸收明显增加，称,DNA,的增色效应。,G+C,增加，所需温度也较高，当温度高达一定值时，,DNA,完全分离成单链，此后紫外吸收不再增加。,DNA,的热变性过程,(,即增色效应的出现,),是在一个狭窄的温度范围内发生的，紫外吸收增加的中点值所对应的温度称为该,DNA,的热变性温度,(Tm),。在一定条件下，,DNA,的,Tm,值与,DNA,的,G+Cmol%,成正比。,Tm,69.3,0.41,（,G+Cmol,）,6,7,二、核酸分子杂交,DNA-DNA,杂交法,DNA-rRNA,杂交法,rRNA-rRNA,杂交法,杂交同源性,:,60%,同种,70%,同一亚种,20%-60%,同一属,按碱基的互补配对原理，用人工方法对两条,不同来源的,单链核酸进行,复性（退火）,，以构建新的杂合双链核酸的技术,8,核酸的分子杂交,DNA-DNA,杂交,基本原理,：双链,DNA,分子加热可变性，冷却处理时，又可复性。不仅同一菌株的,DNA,单链可以复性结合成双链，来自不同菌株的,DNA,单链，只要二者具有同源互补的碱基序列，它们也会在同源序列之间互补结合形成双链，这就称之为,DNA-DNA,分子杂交。不同微生物之间，,DNA,同源程度越高，其杂交率就越高，若两个菌株,DNA,分子序列完全相同，则应,100%,地杂交结合。,具体测定方法很多，按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂交两大类。在这些方法中，有的需要,用同位素标记,DNA,，有的则用非同位素标记，而,复性速率法,则是通过测定单链,DNA,分子复性结合的速率来计算,DNA,的同源性而不需要对,DNA,分子进行标记。,9,细菌常用固相杂交法：,（参照菌株）,A,菌,B,菌（待测）,DNA DNA,（同位素标记、酶切并解链）,单链 单链（固定于滤膜上，未标记）,最适温度复性杂交,洗涤,测定放射强度,杂交率,（以参照菌株自身复性的放射性值为百分之百,）,60%,同一个种；,70%,同一亚种；,20,60%,同属不同种,对于许多有争议的,种,的界定和建立,新种,起了重要作用,10,11,DNA-rRNA,杂交,rRNA,是,DNA,转录的产物，在生物进化过程中，其碱基序列的变化比基因组要慢得多，保守得多，它甚至保留了古老祖先的一些碱基序列。因此，当两个菌株的,DNA-DNA,杂交率很低或不能杂交时，用,DNA-rRNA,杂交仍可能出现较高的杂交率，因而可以用来进一步比较关系更远的菌株之间的关系，进行属和属以上等级分类单元的分类。,DNA-DNA,杂交和,DNA-rRNA,杂交的原理和方法基本相同，只是在技术细节上有些差异，如,DNA-rRNA,杂交中，用同位素标记的是,rRNA,而不是,DNA,等等。,12,核酸探针,广泛用于微生物鉴定、传染病诊断、流行病调查、食品卫生微生物检测以及分子生物学许多领域。,所谓核酸探针,(probe),是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的一段单链,DNA,或,RNA,分子。因此，一种核苷酸片断能否作为探针用于微生物鉴定，最根本的条件是它的特异性，即它能与所检测的微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交。,根据特异性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的探针只用于某一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至更大类群范围的微生物的检测或鉴定。,例如，从一株淋病奈瑟氏菌,(,Neisseria gonorrhoeae,),隐蔽性质粒制备的,DNA,探针，它具有种的特异性，可用来检测和鉴定这种引起人类性行为传播疾病的细菌。,13,使用核酸探针来鉴定或检测微生物的方法，是将探针与所检测的细菌进行杂交。在细菌鉴定或检测临床标本中的细菌时，常用菌落原位杂交法，大致步骤是：将细菌,点种,于硝酸纤维素膜上进行,培养,；加溶菌剂使细胞,释放出,DNA,分子,；加变性剂使,DNA,离解成,单链,并,固定,于膜上；加入带,标记,的核酸探针进行,杂交,；,洗膜,后进行显色或显影,鉴定,。,用核酸探针来鉴定或检测微生物，具有准确、快速等优点，特别是当用常规方法难于鉴定和检测时，往往更显示其优越性。,14,三、,rRNA,寡核苷酸编目分析,利用,16SrRNA,建立分子进化树的美国科学家,Carl Woese,60,年代末,Woese,开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的核糖体,RNA(rRNA),特征序列，认为,16SrRNA,及其类似的,rRNA,基因序列作为生物系统发育指标最为合适。,15,三、,rRNA,寡核苷酸编目分析,一,种通过分析原核或真核细胞中最稳定的,rRNA,寡核苷酸序列同源性程度，以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的方法。,是,“,三域学说,”,提出的科学根据。,16,选用,rRNA,做生物进化和系统分类的原因,rRNA,普遍存在,易于提取,;,rRNA,重要恒定的生理功能,;,在细胞中含量高，易于提取；,编码,rRNA,的基因在细胞中不像质粒,DNA,那样会转移，而是十分稳定的,；,rRNA,某些核苷酸序列非常保守，历经进化仍能保持原初,相对分子量适中,原核生物,rRNA,：,23S,（,2900,）、,16S,（,1540,）,和,5S,（,120,）真核生物,rRNA,：,28S,（,4000,）、,18S,（,2300,）,和,5.8S,（,160,）,17,核糖体构造和组分模式图,原核生物,小亚基,(,30S),大亚基,(,50S),16S rRNA,21,种,核糖体蛋白,23S rRNA,34,种,核糖体蛋白,5S rRNA,真核生物,小亚基,(,40S),大亚基,(,60S),18S rRNA,33,种,核糖体蛋白,28S rRNA,51,种,核糖体蛋白,5.8S rRNA,18,原理,：,用一种,RNA,水解酶水解,rRNA,后，产生,一系列,长短不一的寡核苷酸片段，电泳分离，放射自显影技术获得指纹图谱，确定不同长度寡核苷酸斑点在电泳谱上的位置，,找出图谱中链长在,6,个核苷酸以上的寡核苷酸片段作序列分析,，获得的结果进行按不同长度进行编目、列表。通过比较、分析、计算，就可知道各菌株间的亲缘关系大小。,若两种或两株微生物的亲缘关系越近，则其产生的寡核苷酸片段的序列也越接近，反之亦然。,rRNA,寡核苷酸,编目分析,19,实验过程：,将事先用,32,P,标记的,被测菌株,rRNA,提纯,，用可专一水解,G,上,3,端磷酸酯键的,T1RNA,酶,进行水解，于是产生一系列以,G,为末端,的长度不一的,寡核苷酸片段,，接着把它们进行双向电泳分离，再用,放射自显影,技术获得,rRNA,寡核苷酸群的,指纹图谱,，然后将图谱中链长在,6,个核苷酸以上的,寡核苷酸作序列分析，把获得的结果按不同长度进行编目、列表。通过比较计算和分析，就可定量地知道各被测菌株间的,亲缘关系,。,rRNA,寡核苷酸,编目分析,20,培养微生物,提取基因组,DNA,rDNA,序列测定,分析比较,微生物之间的系统发育关系,16S rDNA,微生物鉴定流程,PCR,扩增,16S rDNA,片段,21,从样品中分离提取总微生物,DNA,从样品中提取微生物遗传物质,DNA,或,RNA,，这是进行,PCR,扩增,16SrRNA,的前提。,一种方法是直接提取总,DNA,，对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取，另一种选择是提取微生物细胞中的,rRNA,。,RNA,的提取技术相对于,DNA,的提取较为复杂，一般多采用提取细胞总,DNA,，但也可根据情况选择提取,rRNA,。,22,PCR,扩增,16S,rRNA,基因片段,聚合酶链式反应,(PCR),，又称体外基因放大技术，是将,DNA,样本与寡核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷和耐热的,TaqDNA,聚合酶在一种适当的缓冲液中混合，然后进行循环的扩增反应。由于,PCR,技术的产生和发展，现在一般采用,16S rRNA,引物,PCR,扩增总,DNA,中的,rRNA,序列，或通过反转录,PCR,获得,cDNA,序列后再进行分析。采用,PCR,技术的优点在于不仅一次性从混合,DNA,或,RNA,样品中扩增出,16S rRNA,序列，而且方便了后面的克隆和测序。但也同样会出现,PCR,所固有的缺点，尤其是采用,16S rRNA,保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增，可能出现嵌合产物,(Chimeric product),和扩增偏嗜性现象，影响结果的分析。,PCR,扩增步骤如下：（,1,）双链,DNA,（模板）加热变性为单链；,（,2,）引物与模板,DNA,单链结合；,(3),引物延伸（扩增）。,23,通过,16S,rRNA,基因片段分析对微生物进行分类鉴定,16SrRNA,基因片段的分析方法主要包括以下,4,种：,一是将,PCR,扩增后微生物,16SrDNA,序列，提交到,GeneBank,采用,BLAST,程序与已知序列进行相似性分析。,GenBank,将按照与测得序列的相似性高低列出已知,序列名单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类,。与,16S rRNA,数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置,二是通过,16SrRNA,种属特异性的探针与,PCR,产物杂交以获得微生物组成信息。此外,探针也可以直接与样品进行原位杂交检测，通过原位杂交不仅可以测定微生物的形态特征和丰度，而且能够分析它们的空间分布。,三是对,PCR,产物进行,限制性片段长度多态性分析,(PCR,RFLP),，通过观察酶切电泳图谱、数值分析，确定微生物基因的核糖体型，再同核糖体库中的数据进行比较分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系，用以揭示微生物,RFLP,的多样性。,四是对,PCR,扩增产物进行梯度凝胶电泳分析，直接观察其多样性,24,通过,T1RNA,酶的水解，一般可使,rRNA,形成含有,1,20,个核苷酸单位的寡核苷酸片段。如果形象地把只含一个核苷酸的片段称为,“,字母,”,的话，则含两个以上核苷酸的片段就成了,“,单词,”,。将含有,6,个,“,字母,”,以上的所有,“,单词,”,一一测定其核苷酸序列，最后可把它们编成一部,“,词典,”,。于是，两个茵株,rRNA,的相似性就可通过查阅,“,词典,”,来作比较。比较的具体方法是计算它们间的缔合系数（,associatedcoefficient,）或相关系数,SAB,值：,25,上式中，,N,AB,是,A,、,B,两被测菌株所共同具有的,“,单词,”,的,“,字母,”,数，而,N,A,和,N,B,则是两株菌分别具有的,“,单词,”,的,“,字母,”,数。根据,S,AB,值进行数值分析，就可推知它们之间的亲缘关系。,它的作用很大，至今,Woese,及其同事已对,400,多株细菌和放线菌进行过分析，并从其中发现了生命的第三种形式,古细菌，提出了生物界级分类中的,“,三域学说,”,26,三域学说及其发展,1980,（,Woese,）,16sRNA,共同的祖先,古细菌域：产甲烷细菌、极端嗜盐菌、极端嗜酸热菌,真细菌域：除古细菌原界以外的细菌,真核生物域：原生生物、真菌、动物、植物,27,嗜热菌,真细菌原界,紫色细菌,G,+,细菌,绿色非硫细菌,蓝细菌,黄杆菌,极端嗜盐菌,甲烷细菌,极端嗜酸热菌,动物,纤毛虫,真菌,植物,鞭毛虫,微孢虫,原始祖先,RNA?,真核原界,古细菌原界,28,内共生假说,现今一切生物都有一个共同的远祖进化而来。小细胞先分化出细菌和古生菌。古生菌分支上的细胞丧失细胞壁后，先后吞噬了,变形细菌（相当于,G,-,细菌）和蓝细菌，并形成了内共生，从而使两者进化成与宿主细胞难分难解的细胞器,线粒体和叶绿体，于是宿主最终也就发展成了各类真核生物。,29,30,四、微生物基因组全序列的测定,是当前国际生命科学领域中掌握某微生物的,全部遗传信息,的最佳途径。,从,1990,年起，在,人类基因组计划（,HGP,）,强有力的推动下，,微生物全基因组测序,一马当先，进展极快，全球形成,“,争测微生物的基因组,”,的热闹形势。,DNA,是除少数,RNA,病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。,每一种微生物都有其自身独特而稳定的基因组,DNA,序列，不同菌种间基因组序列的差异程度，代表着它们之间亲缘关系的疏密。,对那些与人类健康、生活和生产关系重大的微生物，进行全基因组,DNA,序列测定，是当前生物科学领域中掌握某微生物全部遗传信息的最佳途径，也是微生物现代分类鉴定中更细致和更精确的遗传性状指标,。,31,Thanks!,32,