基因工程之核酸操作的基本技术培训课件.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章,核酸操作基本技术,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第1页,3.1 碱抽提法提取DNA,碱变性抽提法又称碱抽提法或碱裂解法，是一个用最广泛制备质粒DNA方法，是当今分子生物学研究中常规方法。碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性差异而到达分离目标。在pH值到达12.6碱性条件下，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状两条互补链不会完全分离。当以pH4.8 NaAc高盐缓冲液调整其Ph至中性时，变性质粒又恢复原来构型，保留在溶液中，而染色体不能复性,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第2页,而形成缠连网状结构。经过离心，染色体与不稳定大分子、蛋白质复合物等一起沉淀下来而被除去。,碱变性抽提质粒，除了菌体培养、质粒扩增和搜集菌体外，其提取过程大致分为三个步骤：（,）从染色体中分离质粒。（）去除质粒中。（）深入纯化质粒，去除蛋白质等杂质。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第3页,3.1.1 碱抽提法所用各类试剂生化作用,（）溶菌液中溶菌酶是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁主要化学成份肽聚糖中，糖苷键，因而含有溶菌作用。,（）NaOH-SDS液：核酸在pH.溶液中是稳定，但当pH 或pH时，就会引发双链之间氢键解离而变性。是离子型表面活性剂，它能够溶解细胞膜上脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第4页,细胞中核蛋白，还能与蛋白质结合成为,R,+,蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。不过能抑制核糖核酸酶作用，所以在以后提取过程中，必须把它去除洁净，预防它影响Raase活性。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第5页,（）ac水溶液呈碱性，为了调整pH至4.8，必须加入大量冰醋酸。目标是把pH12.6抽提液调整至中性，使变性质粒能够复性，并能稳定存在。而高盐mol/LNaAc有利于变性大分子染色体、以及蛋白复合物凝聚而沉淀之。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第6页,（）乙醇：溶液是以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去周围水分子，失水而易于聚合。普通试验中，是加倍体积无水乙醇与相聚合，其乙醇最终含量占左右。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第7页,（）缓冲液：在基因操作试验中，选择缓冲液主要标准是考虑稳定性及缓冲液成份不产生干扰作用。采取Tris-HCL缓冲系统，因为缓冲液是Tris H,+,/Tris,不存在金属离子干扰作用，故在提取或保留时，大都采取Tris-HCL系统，而缓冲液中更能稳定活性。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第8页,（）酚氯仿：酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质密度比水密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第9页,（）异戊醇：在抽提时，为了混合均匀，必须猛烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止分子相互间充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能降低抽提过程中泡沫产生。普通采取氯仿与异戊醇之比为：。也可采取酚、氯仿与异戊醇之比为：。同时异戊醇有利于分相，使离心后上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第10页,（）饱和酚：因为酚与水有一定互溶，苯酚用水饱和目标是使其抽提过程中，不致吸收样品中含有水分，降低损失。用ris调整pH为是因为在此条件下比较稳定。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第11页,质粒DNA小规模提取碱裂解法,1）接种一单菌落于3ml含70l/ml AmpLB液体培养基中。200转/分37振荡培养过夜（约810h）。1rpm离心1min搜集细菌。,2）用STE重悬细菌沉淀，1rpm离心5min，弃上清。,3）将细菌沉淀重悬于100l冰预冷溶液I中，加入200l新配制溶液II，温和转动使之混匀，冰浴2min。,4）加入150l溶液III，将管倒置摇荡1min，冰浴5min。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第12页,质粒DNA提取溶液,：50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0），高压灭菌，4保留。,质粒DNA提取溶液,：0.2M NaOH，1%SDS，现配现用。,质粒DNA提取溶液,：5M 乙酸钾溶液60ml，冰乙酸11.5ml，灭菌水28.5ml。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第13页,5）1rpm离心8min，小心取上清于离心管中。加等体积酚：氯仿抽提一次。,6）取上清液加入1/5体积5M乙酸胺，再加入2倍体积无水乙醇，1rpm离,心5min，弃上清，加入70乙醇沉淀。,7）离心弃上清，真空抽干，去除痕量乙醇。,8）加入50l TE并加入1l RNase放入37水浴1h。,9）0.7%琼脂糖电泳检测其含量。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第14页,3.1.2 碱抽提法抽提DNA过程中应注意问题,（1）染色体DNA、蛋白质与RNA是否去除洁净，是否取得一定得率质粒DNA。,（2）所用器皿必须严格清洗，各种试剂配制是否准确，有需高压高温灭菌。,（3）加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖摇动4-5次，注意观察水相与乙醇之间 没有分层现象之后，才能够放入冰箱中沉淀DNA。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第15页,3.2 DNA提取其它方法,2.2.1 质粒DNA分离纯化,2.2.1.1微量提取质粒,小规模制备质粒特点是能够一次制备各种质粒，速度快、省时间、步骤简化、纯度好，能够用于酶切、连接，甚至多纯化几次还可作双链序列分析模板等常规基因工程操作之用。主要有以下方法：,有煮沸法、孔微量滴定板法、碱变性和和法、单链质粒小量制备法、不需要苯酚抽提质粒小量制备和用商品化试剂盒制备质粒等。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第16页,3.2.1 质粒大量制备,在制作酶谱、测定序列、制备探针等试验中需要高纯度、高浓度质粒，为此需要大量提取质粒。大量提取质粒普通需深入纯化，惯用柱层析法和氯化铯梯度离心法。抽提方法主要有：煮沸裂解法、裂解法、Triton裂解法和Wizard大量纯化系统等。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第17页,质粒DNA大量制备,1）接种含有目标片段单菌落于100ml液体LB培养基中，37培养过夜。4000rpm，,4离心10min，搜集菌体。,2）将细菌沉淀用20ml冰预冷STE溶液重悬，按上述方法重新离心，去上清，倒置，,用吸水纸吸干残留液，加入冰预冷溶液 2ml，将细菌沉淀重悬。,3）加200l新配制溶菌酶溶液(10mg/ml溶于10mM TrisCl，pH8.0)，混匀。,4）加入4ml新配制溶液，迟缓颠倒数次，充分混匀内容物，于室温放置5-10min。,5）加2ml用冰预冷溶液，将离心管颠倒数次，冰浴15min。1rpm，4离心,20min。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第18页,6）将上清转移至另一离心管中，加0.6倍体积异丙醇，充分混匀，于室温放置10min。,10000rpm，室温离心15min，回收质粒沉淀。7）去除上清，用70%乙醇洗沉淀一次，稍抽干，溶于1ml TE中。,8）加入5l RNase A（5mg/ml），37消化1hr。,9）转移至小离心管，用等体积苯酚，苯酚氯仿，氯仿，各抽提一次。,10）加入1/5体积10M NH,4,AC，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置30min。1rpm，室温离心10min。,11）弃上清，70%乙醇洗沉淀两次，真空抽干，溶于适量TE中，储存于-20。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第19页,3.2.2 质粒纯化,、聚乙二醇沉淀法纯化质粒,、氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环,、从质粒制品中去除,（）经过mol/L NaCl进行离心,（）经过Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B进行层析,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第20页,3.2.3 基因组或其它抽提,2.2.2.1细菌基因组制备,以微量制备法为例：,、ml细菌培养液生长至对数生长久。取1.5ml转入小离心管中离心min.,2、用567ul缓冲液重新悬浮沉淀，加入30ul 和 3ul20mg/ml 蛋白酶，混合。在下保温h。,、加入100ulmol/L NaCl，完全混合，再加入80ulCTAB-NaCl溶液，混合。在65 下保温10min。(CTAB,十六烷基三甲基溴化铵,),基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第21页,、加入等体积酚氯仿异戊醇，混合。离心min，将上清液转移至一新离心管中。,、按上述步骤重复抽提。将上清液转移至一新离心管中。,、加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合直至沉淀。用70%乙醇洗一下沉淀。离心min，弃去上清液后真空干燥。用100ul缓冲液重新悬浮。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第22页,3.2.4 哺乳动物细胞基因组抽提,哺乳动物基因组DNA通常先用SDS等裂解,再用苯酚抽提进行分离。用这类方法产生DNA长度（100-150kb）适合用于Southern分析和用,噬菌体构建基因组文库。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第23页,1、哺乳动物组织细胞DNA提取,组织样保留在70%乙醇中，20冻存。提取时组织样需研碎，乙醇挥发掉，提取方法同质粒提取法。,2、哺乳动物血液基因组DNA提取,（1）取750ul冻存血加入等量PBS，混合均匀,（2）1rpm离心5分钟，弃上清,（3）加入450ul DNA提取buffer,重悬沉淀,（4）加入Rnase至终浓度20ug/ml，37温育1小时,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第24页,(5)加入蛋白酶K至终浓度100ug/ml,混匀，55水浴消化过夜,(6)加入等体积ris饱合酚，温和摇动10分钟，1rpm离心分钟,(7)将上层水相转移至另一洁净离心管,(8)再加入等体积酚：氯仿和氯仿，各抽提一次,(9)上层水相用1/5体积乙酸钠和倍体积无水乙醇沉淀,(10)1rpm离心10分钟，搜集沉淀，70乙醇洗沉淀,(11)真空抽干，用适量TE（pH8.0）溶解,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第25页,2.2.5 从植物中分离基因组DNA,从植物中分离高产量和高质量DNA不是一件轻易事。因为细胞壁及植物特有细胞内物质，需要用较特殊处理方法。,1、用CTAB抽提植物DNA,（1）将组织放入离心管中，加入5倍体积抽提缓冲液，再加入一些洗过灭菌海沙于-20冷冻。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第26页,（2）用杵将组织压软，置组织于液氮中磨碎。,（3）短暂振荡，于65温浴5min。,（4）加1倍体积氯仿-异戊醇混合物，轻轻颠倒几次使之混匀。离心5min,将上层水相转移到另一管中。,（5）加1倍体积溴化乙锭液，1倍体积苯酚和1倍体积氯仿，轻轻混匀。离心取上清。溴化乙锭可帮助除去多糖。大多数植物组织可省去这一步。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第27页,（6）加1/10体积3mol/L醋酸钠和1倍体积异丙醇，于-20放置30min或过夜，沉淀DNA。,（7）以1r/min离心10min，倒掉上清。,（8）加0.5ml冷70%乙醇，重悬沉淀，离心2min。,（9）真空或37放置10min，干燥DNA。,（10）适量TE溶解DNA。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第28页,3.3 DNA定量和纯度测定,对于基因操作中载体DNA和外源目标DNA片段，必须对其浓度、纯度、构型、相对分子量大小等基本情况进行了解。有时DNA中含有酚类和多糖类物质会影响酶切和PCR效果，尤其DNA浓度是一个非常关键原因。,3.3.1 紫外光谱分析法,紫外光谱分析法原理基于DNA（RNA）分子在260nm处有特异紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA浓度成正比。该法特点是准确、简便，但所需仪器较昂贵。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第29页,因为测定OD,260,时，难以排除RNA、染色体DNA、以及解链增色效应原因，所以测得数据往往比实际浓度偏高。,衡量所提取DNA纯度可用OD,260,与 OD,280,比值。OD,260/,O D,280,对DNA而言其值大约为1.8，高于1.8则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。,在260 nm读数用于计算样品中核酸浓度,OD值为1相当于大约50ug/ml双链DNA、40ug/ml单链DNA或RNA以及大约20ug/ml单链寡核苷酸。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第30页,EB荧光分析法,EB（溴化乙锭），一个荧光染料，它能插入DNA或RNA碱基对平面之间而结合于其上。一旦EB结合在DNA分子上，它能在紫外光激发下产生桔黄色荧光。这种方法优点是简便易行、经济，而且与凝胶电泳相结合能够分析DNA样品是否完整等，缺点是准确性较低。,基因工程之核酸操作的基本技术培训课件,第31页,