12基因工程的基本操作程序用.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,基因工程的基本操作程序,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,提取,棉花细胞,(,含,抗虫基因,),苏云金芽孢杆菌,抗虫基因,与运载体,DNA,拼接,导入,普通棉花,(,无抗虫特性,),棉花植株,(,有,抗虫特性,),基因工程的基本操作程序,（,1,）目的基因的获取,（,2,）,（,3,）将目的基因导入受体细胞,（,4,）目的基因的检测与鉴定,基因,表达载体,的构建,一、目的基因的获取,1,、目的基因：主要指的是编码蛋白质的,结构基因,，也可以是一些具有调控作用的因子。,2,、获取方法：,（,1,）从,基因文库,中获取目的基因；,（,2,）利用,PCR,技术扩增目的基因；,（,3,）通过,DNA,合成仪用化学方法直接合成,（一）从基因文库中获取目的基因,1.,什么叫基因文库？,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片断，导入到,受体菌的群体,中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,基因文库,基因组文库,部分基因文库,（,cDNA,文库）,基因组,DNA,文库,cDNA,文库,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA,聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，,RNA,聚合酶沿,DNA,分子移动，并以,DNA,分子的一条链为模板合成,RNA,。,转录完毕后，,RNA,链释放出来，紧接着,RNA,聚合酶也从,DNA,模板链上脱落下来。,不能转录为信使,RNA,，不能,编码蛋白质。,：能转录相应的信使,RNA,，能,编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核,苷酸序列，在该序列中，,最重要的是位于编码区上,游的,RNA,聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,补：真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，,包括位于编码区上游的,RNA,聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_,的,编码区是间隔的、,_,的,相同点,都由能够编码蛋白质的,_ _,和具有调控作用的,_,区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,基因组文库与部分基因文库的关系,基因组文库和部分基因文库的比较,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,基因中启动子,基因中内含子,基因多少,物种间基因交流,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,2.,基因文库的构建方法,（,1,）,鸟枪法,（,2,）,反转录法,（,3,）,根据已知的氨基酸序列合成,DNA,法（人工合成）,注意多用于（,2,）（,3,）（,真核生物,）,多用于原核生物,（,1,）鸟枪法：,供体细胞中的,DNA,许多,DNA,片段,运载体,限制酶,与载体连接,受体细胞,产生特定性状,导入,外源,DNA,扩增,目的基因,分离,(,直接分离法,),以目的基因转录成的,信使,RNA,为模板，再,反转录酶,的催化下反转录成互补的单链,DNA,，然后在,DNA,聚合酶的作用下合成双链,DNA,，即,cDNA,，从而获得所需的基因。,（,2,）,反转录法,（,cDNA,文库的构建方法,）,（,3,）人工合成法：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使,RNA,序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,优点,缺点,鸟枪法,反转录法,根据已知氨基酸合成,DNA,法,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，,mRNA,很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,思考：,如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列；,基因的功能；,基因在染色体上的位置；,基因的转录产物,mRNA,；,基因翻译产物蛋白质等特性。,注意：,基因文库,中不是直接保管相应基因，而是,保存受体菌,，菌中含基因。,1,、构建基因组,DNA,文库时，首先应分离细胞的,A,、染色体,DNA B,、线粒体,DNA,C,、总,mRNA D,、,tRNA,2,、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是,A,、某生物的全套基因就是一个基因文库,B,、将含有某种生物不同的许多,DNA,片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库,C,、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库,D,、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫,cDNA,文库,A,C,（,2,）利用,PCR,技术扩增目的基因,PCR,多聚酶链式反应,是一项生物,体外复制,特定,DNA,片段的核酸合成,技术,。通过此技术，可获取大量的目的基因。,（二）利用,PCR,技术扩增目的基因,模板,DNA,95,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,1,轮结束,第,2,轮开始,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,过程：,变性、退火、延伸三步曲,变性：,加热至,90,95,双链,DNA,解链成为单链,DNA,退火：,冷却至,55,60,部分引物与模板的单链,DNA,的特定互补部位相配对和结合,延伸：,加热至,70,75,以目的基因为模板，合成互补的新,DNA,链,变性,退火,延伸,请回答基因工程方面的有关问题：,(1),利用,PCR,技术扩增目的基因，其原理与细胞内,DNA,复制类似,(,如下图所示,),。图中引物为单链,DNA,片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物,A,的,DNA,片段所占的比例为,_,。在第,_,轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的,DNA,片段。,（,1,）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物,A,的,DNA,片段所占的比例为,。,（,2,）在第,轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的,DNA,片段。,15/16,三,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术。,前提条件：,_,；,其它条件：,_,、,_,、,_,。,原理：,_,方式：以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循,环的次数）,结果：,多聚酶链式反应,已知目的基因的核苷酸序列,特定,DNA,片段,DNA,复制,四种脱氧核苷酸,DNA,引物,DNA,模板,热稳定,DNA,聚合酶,指数,2,n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,体外,过程：,a,、,DNA,变性（,90-95,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,_,断裂，形成,_,b,、退火（,复性,55-65,）：系统温度降低，引 物与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、延伸（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，从,引物的,5,端,3,端延伸，合成与模板互补,的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,思考？,1,个,DNA,分子进行,PCR,扩增,循环,4,次，,理论上至少需要几个引物？,2,（,2,n,-1,）,(n,为循环次数,),（,2,4,-1,）,2=30,1,、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的,DNA,分子片段为,ATGTG,TACAC,，要使其数量增多，可用,PCR,技术进行人工复制，复制时应给予的条件是,双链,DNA,分子为模板,ATGTG,或,TACAC,模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸,DNA,聚合酶 热稳定,DNA,聚合酶引物 温度变化 恒温,A,B,C,D,D,2,、在基因工程中，把选出的目的基因（共,1000,个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是,460,个）放入,DNA,扩增仪中扩增,4,代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是,A.540,个,B.8100,个,C.17280,个,D.7560,个,B,1,、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是,A,、化学合成法,B,、基因组文库法,C,、,cDNA,文库法,D,、聚合酶链反应,2,、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是,从基因文库中获取目的基因 利用,PCR,技术扩增目的基因 反转录法 通过,DNA,合成仪利用化学方法人工合成,A,B,C,D,A,D,3,、目的基因主要是指,_,的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（,1,）从基因文库中获取目的基因，根据基因的,_,序列，基因在,_,上的位置，基因的,_,产物,mRNA,，基因的,_,产物蛋白质等获取目的基因。（,2,）利用,PCR,技术扩增目的基因，该技术是一项在,_,完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的,_,序列，以便于合成,_,。（,3,）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过,_,方法。,编码蛋白质,核苷酸,染色体,转录,表达,体外,核苷酸,引物,人工合成,PCR,技术扩增与,DNA,复制的比较,PCR,技术,DNA,复制,相同点,原理,原料,条件,不同点,解旋方式,场所,酶,结果,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA,在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的,DNA,聚合酶,细胞内的,DNA,聚合酶,大量的,DNA,片段,形成整个,DNA,分子,用一定的,_,切割,质粒，使其出现一个切,口，露出,_,。,用,_,切断目,的基因，使其产生,_,_,。,将切下的目的基因片段插入质粒的,_,处，,再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA,连接酶,1.,过程,:,二 基因,表达,载体构建,核心,质粒,DNA,分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同一种,过程,:,2.,基因表达载体的目的,（,1,）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；,（,2,）使目的基因能够表达和发挥作用。,思考：,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（,P15,）,不可以。,因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，,还需要有其他控制元件,，如启动子、终止子和标记基因等。,必须构建上述元件的,主要理由,是：,（,1,）生物之间进行基因交流，只有使用,受体生物自身基因,的启动子才能比较有利于基因的表达；,（,2,）通过,cDNA,文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（,3,）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（,4,）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子,（,增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置,(,上游或下游,),上都发挥作用。,）,等；,（,5,）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,3.,基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a,、目的基因,b,、启动子,c,、终止子,d,、标记基因,启动子：,位于基因的首端的一段特殊结构的,DNA,片断，它是,RNA,聚合酶识别和结合的部位，有了它才能,驱动基因转录出,mRNA,，最终获得所需要的蛋白质,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的,DNA,片断，,能终止,mRNA,的转录,标记基因,的作用是,为了,鉴别,受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来,思考,2,：,终止子的作用是什么？,终止子是位于基因尾端的一段特殊的,DNA,片断，能终止,mRNA,的转录。,是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,思考,3,：,标记基因有什么作用？,载体,与,表达载体,的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分,DNA,片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。,注意,用到的工具酶：,既用到限制酶切割载体，又用到,DNA,连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。,启动子、终止子,对于目的基因表达必不可少。,目的基因不能单独进入受体细胞，,必需以表达载体的方式携带进去。,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴,细菌或病毒侵染细胞,的途径。,（一）转化：,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,（二）方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,1.,将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,最常用,基因枪法,花粉管通道法,（,1,）农杆菌转化法,特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,Ti,质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的,DNA,上。,转化过程,:,Ti,质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,插入,植物细胞染色,DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,基因枪法又称微弹轰击法，是,利用压缩气体产生的动力,，将包裹在金属颗粒表面的表达载体,DNA,打入受体细胞中,，使目的基因与其整合并表达的方法。,（,2,）基因枪法,适用于,单子叶植物,（,3,）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加,DNA,（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于,被子植物,2.,将目的基因导入动物细胞,（,1,）方法：显微注射法,（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到,受精卵,中）,思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？,（,2,）操作程序,:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,常用法,：,Ca,2+,处理,常用菌,：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca,2+,处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收,DNA,3.,将目的基因导入微生物细胞,思考：为什么要用,Ca,2+,处理受体细胞？,用,Ca,2,处理，增加细菌细胞壁的通透性,受体生物,植物,动物,微生物,受体细胞,导入方法,受精卵,体细胞,受精卵,细胞,/,个体,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注,射技术,用,Ca,2+,处理成感受态细胞,采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）,A.,将毒素蛋白注射到受精卵中,B.,将编码毒素蛋白的,DNA,序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养,C.,将编码毒素蛋白的,DNA,序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵,D.,将编码毒素蛋白的,DNA,序列，注射到棉受精卵中,BC,四、目的基因的检测与鉴定,检测,:,是否插入目的基因,是否转录,是否翻译,鉴定,:,分子水平鉴定,个体生物学水平鉴定,1,、检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,首先取出转基因生物的基因组,DNA,；,（,1,）方法,:,DNA,分子杂交,（,2,）过程,:,将含目的基因的,DNA,片段用放射性同位素等作标记,以此做,探针,；,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体,DNA,中。,（一）检测,基因探针,：,是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。,基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,DNA,分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的,DNA,分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,（二）鉴定（个体生物学水平）,2,、检测目的基因是否转录出了,mRNA,3,、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,:,分 子 杂 交,方法,:,抗原,-,抗体杂交,过程,:,用上述探针和转基因生物的,mRNA,杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,。,提取,（,3,）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原,-,抗体杂交,苏云金杆菌,Bt,毒素蛋白,将,Bt,毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗,Bt,毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,若不能表达，要对抗虫基因再进行,修饰,。,怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？,没有抗虫基因,的棉植株,有抗虫基因的棉植株,棉铃虫,虫没有死,虫被杀死,没有表达,目的基因表达,类型,步骤,检测内容,方法,结果显示,分子检测,第一步,目的基因是否进入受体细胞,DNA,分子杂交,（,DNA,和,DNA,之间）,是否成功显示出杂交带,第二步,目的基因是否转录出,mRNA,分子杂交技术,（,DNA,和,mRNA,之间）,是否成功显示出杂交带,第三步,目的基因是否翻译出蛋白质,抗原,抗体杂交,是否成功显示出杂交带,个体水平鉴定,包括抗虫、抗病的,接种实验,，以确定是否有抗性以及抗性的程度；,基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。,目的基因的表达和检测,提示：,DNA,分子杂交技术首先提取受体细胞中的,DNA,，然后高温解成单链，再与同位素标记的,DNA,探针杂交；,抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。,归纳,:,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,寻根问底：,根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗,?,若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做,?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；,要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的基因，使,T-DNA,转移并插入到染色体,DNA,上。,酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中,4.-,珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的,-,珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,（,1,）从小鼠中克隆出,-,珠蛋白基因的编码序列（,cDNA),。,（,2,）将,cDNA,前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。,（,3,）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明,-,珠蛋白基因已进入其中。,（,4,）培养进入了,-,珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取,-,珠蛋白。,检测是否插入目的基因，,利用,DNA,分子杂交技术,，目的基因,DNA,一条链（作探针）与受体细胞中提取的,DNA,杂交，看是否有杂交带。,检测是否转录出了,mRNA,，,利用,分子杂交技术，,目的基因,DNA,一条链（作探针）与受体细胞中提取的,mRNA,杂交，看是否有杂交带。,检测目的基因是否翻译成蛋白质。,抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。,还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。,提示：,DNA,分子杂交技术首先提取受体细胞中的,DNA,，然后高温解成单链，再与同位素标记的,DNA,探针杂交；,抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。,演讲完毕，谢谢观看！,