酶联免疫分析法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,第,七,章,酶联免疫分析,法,基本要求：,了解免疫分析发展史，掌握抗原、抗体和免疫反应的原理，了解免疫分析法的分类，熟悉酶标记免疫分析法中使用的酶，熟悉,ELISA,的原理，掌握,ELISA,的固相载体、包被与封闭、稀释液、洗涤液、酶反应终止液及,ELISA,法常用酶的底物系统，掌握,ELISA,的酶联方法和试验方法，熟悉,ELISA,反应条件的选择，掌握,ELISA,的定量计算，了解,ELISA,的灵敏度提高途径，熟悉,ELISA,放大系统。了解化学发光分析的原理，熟悉化学发光剂的种类，熟悉化学发光酶联免疫分析常用的标记酶和发光增强剂，熟悉生物发光酶联免疫分析常用的生物发光反应体系。,1,.,第,七,章,酶联免疫分析,法,第一节,酶联免疫分析概述,第二节,光度酶联免疫分析,第三节,发光酶联免疫分析,2,.,第一节,酶联免疫分析概述,一、,免疫分析,1,、免疫分析发展史,免疫分析,（,Immunoassay,，,IA,）是利用,待测物质,（抗原或抗体）与其,相对应物质,（抗体或抗原）之间,专一特异性反应,而建立起来的一种,高选择性,分析方法。,免疫分析主要基于用,抗体,（或抗原）作为选择性化学试剂以分析,测定抗原,（或抗体）及,半抗原,。,宋代,人工痘苗,预防烈性传染病天花,1971,年,第一届国际免疫学会议,将免疫学与微生物学分开发展成一门独立的学科。,3,.,“免疫（,immunity,）”一词源于“,immunitas,”，原意是免除税赋和差役。,研究早期免疫学多集中在,抗体抗感染能力,研究。,20,世纪中期以后，人们逐渐,开始,对各种抗原、微生物的作用进行研究，发展,出,基础免疫学、临床免疫学、免疫学检测、医学免疫学等多个分支。,现代免疫学将“免疫”定义为：,机体,对“自己”和“异己”,识别,、应答过程中所产生的,生物学效应的总和,，正常情况下是,维持内环境稳定,的一种生理性功能。,第一节,酶联免疫分析概述,4,.,2,、抗原、抗体与免疫反应,抗原,是能够引起免疫反应的分子。,免疫原性,（,immunogenicity,）,指,诱导刺激免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞的能力,。,具有免疫原性的物质称为,免疫原,（,immunogen,）,。,免疫反应原性,（,immunoreactivity,）或,抗原性,（,antigenicity,），指能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合，引起免疫反应的性能。,具备上述两种特性的物质为,完全抗原,，仅具有免疫反应性的物质被称为,半抗原,（,hapten,）。,第一节,酶联免疫分析概述,5,.,抗体,是能与抗原发生特异性结合的,免疫球蛋白,。,所有的抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗体,。,例如,无免疫活性的免疫球蛋白,（如,骨髓瘤蛋白,）,就不是抗体，,尽管,其结构与抗体相似。,抗体主要存在于血清内,，但在其他体液及外分泌液中也有存在。,抗原抗体分子,之间存在着结构互补性和亲和性,，,使得抗原与相应抗体之间,极,易发生结合反应，,这种反应,具有,高特异性,（,即专一性,）和,可逆性,。,第一节,酶联免疫分析概述,6,.,抗原、抗体发生如下免疫反应：,Ag+Ab Ag-Ab,该免疫反应遵循可逆生物大分子相互作用的热动力学基本原理，其反应式为,式中：,Ab,为游离的抗体结合位点的浓度；,Ag,为游离的抗原结合位点的浓度；,Ab-Ag,为抗原,-,抗体复合物的浓度；,k,1,为正反应速率常数；,k,2,为负反应速率常数；,K,为,反应平衡常数,（,亲和常数,）,。,第一节,酶联免疫分析概述,7,.,这种抗原,-,抗体反应,既,可发生于体内（,in vivo,），也可发生于体外（,in vitro,）。,抗体主要存在于血清中，在抗原、抗体的检测中多采用血清做试验，所以,体外抗原,-,抗体反应,也称为,血清学反应,（,serologic reaction,）。,基于抗原,-,抗体反应的检测技术主要应用于以下几个方面：,用已知抗原,检测未知抗体,；,用已知抗体,检测未知抗原,；,定性或定量,检测,体内,各种大分子物质,；,用已知抗体,检测,某些药物、激素等各种,半抗原,物质。,第一节,酶联免疫分析概述,8,.,二、,酶标记免疫分析法及常用标记酶,1,、免疫分析法分类,第一节,酶联免疫分析概述,9,.,2,、酶标记免疫分析法中使用的酶,（,1,）酶联免疫分析中使用的酶应,符合下列条件,：,纯度高,、催化反应的转化速率高、,专一性强,；,具有,足够的,偶联用,标记基团,，与抗原、抗体蛋白分子偶联后仍保持较高的催化活性；,使用,稳定性,和保存稳定性,好,；,测定,酶活性的,方法简便,、,灵敏,、,快速,；,待测,体液中不存在,与标记酶相同的酶；,第一节,酶联免疫分析概述,10,.,待测溶液中,应该,无底物,、,反应抑制剂,和其他与酶发生反应的,干扰物质,；,酶的来源、纯化和供应,较方便,，价格,较低廉,；,均相酶免疫测定,法中使用的酶，还要求当抗体与半抗原,-,酶,结合物结合,后，酶活性表现出,抑制或激活,。,第一节,酶联免疫分析概述,11,.,（,2,）,酶的评价指标,通常,用,RZ,和,酶的比活,力评价,标记酶的质量。,RZ,表示酶蛋白中,活性部分,与,非活性部分,最大吸光度的比值。,酶的比活,力,指在特定条件下，每,1mg,酶,或,每,1ml,酶液所具有的酶活性单位数,。,（,3,）,酶联免疫分析中的常用酶,下表,列出了酶联免疫分析中的常用酶。,其中,EC,编号,是,根据国际酶学委员会的规定采用四码编号法确定的每个酶的系统编号。,第一节,酶联免疫分析概述,12,.,酶,来源,EC编号,辣根过氧化物酶,辣根,1.11.1.7,酸性磷酸酶,动植物,3.1.3.2,碱性磷酸酶,牛肠,3.1.3.1,-D-半乳糖苷酶,大肠杆菌,3.2.1.23,葡萄糖氧化酶,曲霉菌,1.1.3.4,脲酶,Jack豆,3.5.1.5,青霉素酶,3.5.2.6,过氧化氢酶,肝,1.11.1.6,葡萄糖淀粉酶,根霉菌,3.2.1.3,碳酸苷酶,牛红细胞,4.2.1.1,乙酰胆碱酶,3.1.1.7,葡萄糖,-6-磷酸脱氢酶,肠系膜明串细菌,1.1.1.49,溶菌酶,鸡卵白,3.2.1.17,苹果酸脱氢酶,猪心线粒体,1.1.1.49,无机焦磷酸酶,大肠杆菌,3.6.1.1,荧光素酶,发光生物,1.3.12.7,丙酮酸激酶,哺乳动物组织,2.7.1.40,酶联免疫分析常用酶,第一节,酶联免疫分析概述,13,.,辣根过氧化物酶,（,horseradish peroxidase,，,HRP,）是,一种,提取,自,辣根中,，相对,分子质量为,44kDa,的,糖蛋白,。,其酶学活性部分包括,脱辅基蛋白,和,血红素基团,，辅基亚铁血红素在,403nm,波长呈现最大光吸收值。,HRP,的纯度以,RZ,值即,A,403nm,/A,275nm,的值来衡量，高纯度,HRP,制剂的,RZ3.0,。,通常以能在,20,、,pH,为,6.0,、,20s,的时间内催化底物,邻苯三酚,产生,1mg,红桔酚,（,purpurogallin,）作为,HRP,酶的,1,个活性单位。,用于标记的,HRP,比活性应,大于,250U/mg,。,第一节,酶联免疫分析概述,14,.,碱性磷酸酶,（,alkaline phosphatase,，,AP,）几乎存在于动物和人体的所有组织中，尤其在肝脏、胎盘、白细胞、肾小管中含量高。,AP,是一种,磷酸酯,的水解酶，它能够催化磷酸单酯、,磷酸核苷,及,6-,磷酸糖类,等的水解，在释放磷酸盐的同时产生有色的或荧光的产物。,碱性磷酸酶的分子质量为,80,100kDa,，最适,pH,为,8.0,10.0,，随酶源和底物的不同而变化。,AP,活性的测定以,对硝基磷酸苯酯,（,PNP,）作为底物。,用作标记的,AP,比活,力,应,大于,1000U/mg,。,第一节,酶联免疫分析概述,15,.,葡萄糖氧化酶,（,glucose oxidase,，,GOD,）,即,-D-,葡萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉产生,。,它催化,O,2,和,-D-,葡萄糖的反应形成,H,2,O,2,和,D-,葡萄糖酸,-,内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。,其反应最适,pH,范围为,4.0,7.0,，,pH5.5,时，反应速率最大。葡萄糖氧化酶对,-D-,葡萄糖的,-,异头碳有,高度专一性,。,葡萄糖氧化酶的比活,力,至少为,20U/mg,。,葡萄糖氧化酶在,4,下可稳定存在,6,12,个月。,第一节,酶联免疫分析概述,16,.,-D-,半乳糖苷酶,（,-D-galactosidase,，,Gal,）,即,乳糖酶（,-lactase,），广泛存在于植物、动物器官、细菌、酵母和真菌中。,当,Gal,催化水解,-D-,半乳糖苷时，若得到的半乳糖残基转移到水分子受体，称为,水解,；若受体是糖或醇时，称为,转半乳糖苷,。,Gal,催化,-D-,半乳糖苷水解反应的最适,pH,为,7.5,，转化效率很高，且比,HRP,易于标记，背景值低，稳定性好。,Gal,比活,力,应不少于,30U/mg,，,5,能保存,1,2,年。,第一节,酶联免疫分析概述,17,.,第二节,酶联免疫吸附分析法,一、,光度酶联免疫分析,1,、酶联免疫吸附分析（,enzyme-linked immunosorbent assay,，,ELISA,）原理,使抗原或抗体,结合,到某种,固相载体表面,；,抗原或抗体与某种酶联结成,酶标抗原,或,抗体,；,在测定时，使,受检标本,和,酶标抗原,或抗体按不同的步骤,与固相抗原,或固相抗体起,反应,；,用,洗涤,的方法使固相载体上形成的,抗原抗体复合物,与其他物质分开，结合在固相载体上的,酶量与,标本中,受检物质的量成,一定的,比例,；,加入酶反应,底物,，底物被酶催化为,有色产物,，产物量,与,标本中,受检物,的,量相关,，用分光光度法进行定量。,18,.,*,A,g,是,酶标志抗原,，,A,g,是,未标志抗原,，,A,b,是特异性抗体，,(F),表示游离型的,*,A,g,，,(B),表示结合型的,*,A,g,-,A,b,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,19,.,2,、,ELISA,的固相载体,良好的,ELISA,板应该是,吸附性能好,，,空白值低,，孔底,透明度高,，各板之间、同一板各孔之间,性能相近,。,最常用的是,聚苯乙烯,。,聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。,ELISA,载体的形式有,小试管,、,小珠,和,微量反应板,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,20,.,3,、固相载体的包被与封闭,（,1,）,包被,（,coating,）指将,抗原,或抗体,连接,到,固相载体,上的过程。,以聚苯乙烯微量反应板为例，通常先将抗原或抗体溶于,pH 9.6,的,碳酸盐缓冲液,（或,pH 7.2,的磷酸盐缓冲液，,pH 7,8,的,Tris-HCl,缓冲液）中，,加满反应孔,，置,4,过夜,，洗涤即可。,包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。,一般蛋白质的包被浓度为,0.1,20g/ml,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,21,.,（,2,）,封闭,（,blocking,）指继包被之后用,高浓度,的,无关蛋白质,溶液,再包被,的过程。,封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥,ELISA,后的步骤中干扰物质的再吸附。,所有的,ELISA,固相载体均需封闭,。,常用封闭剂有,0.05%,0.5%,BSA,；,10%,小牛血清,或,1%,明胶,；,脱脂奶粉,，比较价廉，可高浓度使用（,5%,）。,第二节,酶联免疫吸附分析法,22,.,4,、稀释液、洗涤液和酶反应终止液,（,1,）,稀释液,用于稀释酶标抗体及标本。,常用,中性,PBS,或,Tris-HCl,缓冲液,，其中含有,无关高浓度蛋白,（如,10,动物血清、,1,BSA,（牛血清白蛋白）、,1,明胶等）和,非离子型表面活性剂,（如,0.05,Tween 20,或,TritonX-100,等）。,（,2,）,洗涤液,一般与稀释液相同，常用,PBS,或,Tris-HCl,缓冲液。,四种常用的抗体稀释液和三种常用的洗涤液列于表,7-2,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,23,.,编号,吐温,20/%,组成,稀释液,1,0.05,PBS 0.01mol/L，pH 7.4,2,PBS 0.05mol/L，pH 7.4,3,PBS 0.05mol/L，pH 7.4，含EDTA 10mmol/L,4,PBS 0.05mol/L，pH 6.9，含EDTA 10mmol/L,洗涤液,1,0.1,PBS 0.01mol/L，pH 7.2,2,PBS 0.01mol/L，pH 8.0,3,Tris-HCl缓冲液0.01mol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L,表,7-2,常用的抗体稀释液和洗涤液,第二节,酶联免疫吸附分析法,24,.,（,3,）酶反应终止液,辣根过氧化物酶,（,HRP,）反应终止液为,2mol/L,4mol/L H,2,SO,4,（,HRP,在酸性条件下丧失酶活性）。,很多,ELISA,试剂采用,碱性磷酸酶,（,AP,）作为标记酶,，,用,3mol/L NaOH,终止酶反应后，黄色可稳定一,段,时间。,第二节,酶联免疫吸附分析法,25,.,5,、,ELISA,法常用酶的底物系统,ELISA,法,对底物的要求,：,价廉易得,、,安全,；,显色性,和,稳定性,好,；,底物,本身最好,为,无色,物质,；,终止,酶催化反应后,，,底物,不应再,继续地,自发性变性,；,其最终,产物可溶,、,易于测定,及,光吸收值高,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,26,.,（,1,）,辣根过氧化物酶,的底物系统,常见底物有,邻苯二胺,（,OPD,，产物橙红色，测定波长,492nm,）、,5-,氨基水杨酸,（,5-AS,，产物橙色，测定波长,550nm,）、,3,3,5,5-,四甲基联苯胺,（,TMB,，产物红色，测定波长,450nm,）、,2,2-,连氮,-,二,（,3-,乙基苯并噻唑啉,-6-,磺酸盐,）（,ABTS,）等。,ABTS,的,反应曲线不好,。,OPD,溶液具有,光敏性,，相对来说不稳定，且具有诱变特性,。,TMB,的,背景值低,，溶液,稳定,，,没有诱变,特性。,第二节,酶联免疫吸附分析法,27,.,（,2,）,碱性磷酸酶,的底物系统,常用的底物为,对硝基磷酸苯酯,（,PNP,），水解的产物为黄色的对硝基苯酚，可在,405nm,处检测其吸光度的变化，该底物的转化效率高，线性关系好,。,用,酚酞磷酸酯,为底物，水解生成的酚酞在碱性条件下呈红色，可在,530nm,处光度法测定,。,此外还可以,百里酚酞单磷酸酯,等,为,底物。,第二节,酶联免疫吸附分析法,28,.,（,3,）,-D-,半乳糖苷酶,的底物系统,常见底物有,邻硝基苯,-D-,半乳糖苷,（,ONPG,），其水解的产物邻硝基苯酚在,405nm,处具有最大吸光度值,。,其他的底物有,对硝基苯,-D-,半乳糖苷,（,PNPG,）、,苯基,-D-,半乳糖苷,、,氯酚红,-D-,半乳糖苷,（,CPRG,）、,9-,羟基,-3-,异吩噁唑酮,-D-,半乳糖苷,（,RG,）等。,（,4,）,青霉素酶,（,PNC,）的底物系统,常用底物有,溴麝香草酚蓝,（,BTB,）、,青霉酮酸还原淀粉,-,碘复合物,（,SIC,）、,溴甲酚紫,（,BCP,）和,溴麝香草酚蓝,（,2,1,）等。,第二节,酶联免疫吸附分析法,29,.,二、,ELISA,酶联方法和试验方法,1,、,ELISA,酶联方法,ELISA,酶联方法主要有两种，即,戊二醛交联法,和,过碘酸盐氧化法,。,（,1,）,戊二醛交联法,戊二醛是一种双功能团试剂，它可以,联结具有氨基的酶和蛋白质,。,戊二醛交联法有,一步法,、,两步法,两种。,第二节,酶联免疫吸附分析法,30,.,图,7-2,戊二醛一步法反应原理,一步法,将戊二醛,直接加入,酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。,该法操作,简便,、,有效,，,重复性好,。,缺点是交联反应是,随机,的，酶与酶、抗体与抗体之间有可能交联。,第二节,酶联免疫吸附分析法,31,.,图,7-3,戊二醛二步法反应原理,两步法,先将,酶与戊二醛作用,，,透析,除去多余的戊二醛后，再与,抗体,作用而形成酶标抗体；,或,先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。,两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以,1:1,的比例结合的，,有助于本底的改善,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,32,.,（,2,）过碘酸盐氧化法,本法只适用于,含糖量较高,的酶。,辣根过氧化物酶,（,HRP,）的标记常用此法。,反应时，,过碘酸钠,将,HRP,分子表面的多糖氧化为活泼,的,醛基,，可与蛋白质上的氨基形成,Schiff,氏碱,而结合。,图,7-4,过碘酸盐氧化法,第二节,酶联免疫吸附分析法,33,.,2,、,ELISA,试验方法,ELISA,法中有三个必要试剂：,固相抗原,或抗体；,酶标记抗原,或抗体；,酶反应底物,。,根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。,如,双抗体夹心法,、,间接法,、,竞争法,、,异种动物抗体双夹心法,、,抗酶抗体法,、,竞争性抑制法,、,双夹心法,和,抗原直接包被法,等方法。,第二节,酶联免疫吸附分析法,34,.,（,1,）,双抗体夹心法,双抗体夹心法,（,double antibody sandwich,，,DAS-ELISA,）由,Clark,和,Adams,于,1977,年建立，是最经典的,ELISA,检测法,。,该法的,灵敏度高,，,特异性强,，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求,技术性强,，,成本较高,。,该法,只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析,，而不能用于半抗原等小分子的测定。,第二节,酶联免疫吸附分析法,35,.,图,7-5,双抗体夹心法,第二节,酶联免疫吸附分析法,36,.,（,2,）,间接法,间接法,（,indirect ELISA,）是最常用的,ELISA,检测方法，其原理是利用,酶标记的抗体,和已与,固相抗原,结合的受检,抗体,相结合。,该法只要,更换不同的固相抗原,，就可以,用一种酶标抗抗体检测,各种与抗原相应的抗体。,该方法不必为每个待测抗体（或抗原）制备特异性的酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地,简化,了实验。,第二节,酶联免疫吸附分析法,37,.,图,7-6,间接法,第二节,酶联免疫吸附分析法,38,.,（,3,）,竞争法,竞争法（,competing ELISA,）是利用,待测抗原,和,酶标抗原,与,特异性抗体,竞争结合，,或,待测抗体和酶标抗体与特异性抗原竞争结合而进行测定的一种方法（图,7-7,）。,第二节,酶联免疫吸附分析法,39,.,图,7-7,竞争法,第二节,酶联免疫吸附分析法,40,.,（,4,）,异种动物抗体双夹心法,异种动物抗体双夹心法,（图,7-8,），又称,间接双抗体夹心法,（,indirect DAS-ELISA,）或,三抗体夹心法,（,triple antibodies sandwich,，,TAS-ELISA,）。,此法可用,通用的酶标记抗体检验多种病毒,，它不仅免去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。,第二节,酶联免疫吸附分析法,41,.,图,7-8,异种动物抗体夹心法,第二节,酶联免疫吸附分析法,42,.,（,5,）,抗酶抗体法,抗酶抗体法,（图,7-9,）是,利用免疫学反应,而不是用化学交联反应来,制备酶结合物,，常用,HRP,为标记酶,作为抗原,免疫动物制备抗,HRP,抗体,。,可用一种动物（如,兔,）制备,特异性抗体,（第一抗体）和,抗酶抗体,（第三抗体），再用另一种动物（如,羊,）制备,抗第一种动物,（兔）,IgG,的抗体,（第二抗体）。,让这种抗,IgG,的,第二抗体,把,第一抗体,（兔,IgG,）和,抗酶抗体,（也为兔,IgG,）通过免疫学反应连接起来。,最后让,酶与抗酶抗体结合,，通过对底物的作用而揭示在固相载体上待测抗原的存在。,第二节,酶联免疫吸附分析法,43,.,优点,:HRP,通过免疫学反应与抗体结合,，避免了用化学方法交联时抗体活性的改变，也避免了,HRP,与其他蛋白质分子结合，,防止,标记抗体和游离的未标记抗体之间的,竞争,，,提高了标记抗体的质量,。,在纯化化学交联反应制备的酶结合物的过程中，除去未标记抗体比较困难，而且该法,仅在制备抗酶抗体时用少量纯,HRP,作抗原,，所以用较粗制的,HRP,与抗酶抗体形成免疫复合物，并不影响其质量，这大大,节约,了价格较昂贵的精制,HRP,。,因为制备抗酶抗体必须在动物中进行，故抗酶抗体法多,适用于检测动物中的抗体,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,44,.,图,7-9,抗酶抗体法,第二节,酶联免疫吸附分析法,45,.,三、,ELISA,反应条件的选择,1,、酶标抗体浓度的选择,先用,200,L,IgG,（,100 mg/ml,）,包被,小孔，,再,将,酶标记抗体球蛋白,系列稀释并加入小孔中，,洗涤,后，加,底物,反应,，,终止,后,测定,吸光度。,选择,吸光度为,1,的稀释度,作为酶标抗体最适浓度。,图,7-10,酶标抗体浓度的选择,第二节,酶联免疫吸附分析法,46,.,2,、包被浓度的选择,当包被抗原的,浓度较低时,，包被量,随,抗原,浓度的增加,而,增大,；当包被抗原,达到一定浓度后,，,包被量为定值,，不再随抗原浓度的增加而增大,。,此浓度称为,抗原的饱和包被浓度,。,图,7-11,抗原包被量和,ELISA,反应的关系,第二节,酶联免疫吸附分析法,47,.,表,7-3 SM-EDA-GA,包被法中链霉素包被质量浓度对,ELISA,实验误差的影响,包被质量浓度（,mg/ml）,ELISA测定结果（A,492,SD）（,n,=4）,4,1.0980.0628,1*,1.0110.0302,0.5,0.9690.0876,0.25,0.7920.1023,第二节,酶联免疫吸附分析法,48,.,3,、酶,-,底物反应时间的选择,抗原与抗体、抗体与酶标抗体反应一般在,37,反应,2,3h,达到高峰。,时间太短，敏感性下降，时间太长，吸附的抗原或复合物（在这个温度下）可能脱落。,酶,-,底物反应时间一般采用,15min,、,30min,或,45min,，也,可以标准阳性血清为准,，随时测定其,OD,值，当,达到规定的,OD,值时，即终止反应,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,49,.,四、,ELISA,的定量计算与灵敏度,1,、,ELISA,的定量计算,一般采用分光光度计测定结合物中的酶量和抗体蛋白（,IgG,）量，酶量和,IgG,计算方法如下。,其中，,0.4,表示酶的,A,403nm,值为,1,时，酶量为,0.4mg/ml,；,0.42,表示酶的,A,403nm,值为,1,时，其相应,A,280nm,值为,0.42,；,0.62,表示在,A,280nm,值为,1,时，,IgG,量为,0.62mg/ml,；,0.94,表示酶、戊二醛结合后，,A,280nm,增加约,6,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,50,.,酶结合物中结合的酶量、酶结合率计算方法,：,以采用过碘酸钠氧化法进行酶联为例，摩尔比值计算方法,：,酶量,为,1mg/ml,，,摩尔比值,为,1.5,2.0,，,酶结合率,在,30%,以上,时，可获得较好的,ELISA,分析结果。,第二节,酶联免疫吸附分析法,51,.,2,、,ELISA,的灵敏度与,ELISA,放大系统,（,1,）,ELISA,的灵敏度,ELISA,的检出限已经达到,10,-8,10,-12,g,，但对某些测定仍需更高的灵敏度。,传统,ELISA,中显色剂发色团的吸光度是限制,ELISA,灵敏度的主要因素,。,改用荧光标记,或其他化学发光物标记抗体替代酶标记抗体可以提高灵敏度。,改变,传统,ELISA,的,操作程序,也可以提高灵敏度，如,SIMIT,技术。,采用放大系统,是提高,ELISA,灵敏度的,主要途径,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,52,.,（,2,）,ELISA,放大系统 ,生物素,-,亲和素放大系统,可,增加抗体（或抗原）的标记率。,生物素与亲和素结合速率较快且结合物的稳定性高（,K,=10,15,），不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。,生物素对抗体和酶的标记率高（,10,个生物素分子,/,抗体分子）,，且,生物素分子易于活化，,标记后,不影响抗体和酶的活性。,每个亲和素分子能结合,4,个生物素,，,因而可,偶联更多的联结生物素的酶分子，从而提高,ELISA,的敏感性。,生物素,-,亲和素标记体系有灵活多变的运用方式，可以适应不同的分析设计。,第二节,酶联免疫吸附分析法,53,.,微粒放大,。用适当的微粒代替酶,-,抗体结合物也可以获得放大效果。,每个微粒表面可以同时结合大量记酶和抗体分子。在包含微粒放大的夹心,ELISA,法中，,微粒通过结合于其上的第二抗体结合于抗原,。微粒上又结合着标记酶，其数量远比第二抗体能结合的标记酶多，因此得以放大。,例如，微颗粒放大系统用,微颗粒硅胶,（直径,约,40nm,）作为中间体连接酶和抗体，避免酶和抗体直接连接,。,酶微颗粒硅胶可连接上千个酶分子，可使体系增敏，已用于测定甲胎蛋白，灵敏度放大两个数量级。,第二节,酶联免疫吸附分析法,54,.,五、,ELISA,法的应用,酶免疫测定具有高度的特异性和敏感性，几乎所有的可溶性抗原,-,抗体系统均可用以检测，它的最小可测值达,ng,甚至,pg,水平。,酶免疫测定在各应用领域中的普及，应归功于商品试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。,目前应用较广的酶免疫检测项目一般有试剂盒出售。,完整的,ELISA,试剂盒,应包含,包被好的固相载体,、,酶结合物,、,底物,和,各种浓缩的稀释液,、,缓冲液,等。,这些试剂在冰箱中可保存半年以上，因此实验室中只需要用蒸馏水稀释全套试剂即可。,第二节,酶联免疫吸附分析法,55,.,六、,微量致敏性杂质青霉噻唑蛋白的测定,基因工程药品在生产过程中为防止污染，在细胞培养或发酵过程中常需加入一定量的青霉素。,青霉素在水溶液中很容易和蛋白质结合形成,过敏性杂质青霉噻唑,（,benzyl penicilloyl,，,BPO,）蛋白，为确保基因工程药品的产品质量，可以用,ELISA,对基因工程药品中是否残存有青霉噻唑蛋白进行检测，其对样品中结合青霉素的,绝对检出量小于,0.310,-6,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,56,.,其实验步骤如下：,（,1,）,包被,：用碳酸缓冲液（,0.1mol/L,，,pH 9.6,）直接包被,待测抗原,，,200L/,孔；,包被,BPO,4,-CY,作为,阳性对照,，并设有,包被抗原不加抗,BPO,血清,和,不包被抗原但加抗,BPO,血清,两组,阴性对照,；,此外，实验中还设有,待测抗原,-BSA,抗血清,相互作用组作为,阴性血清,对照；,4,冰箱过夜。,（,2,）用洗涤液（,BPS 0.01mol/L,，,pH 7.2,）,洗涤,三次，每次,3min,。,第二节,酶联免疫吸附分析法,57,.,（,3,）,与特异性抗体反应,：在经洗涤好的酶标板中加入稀释至一定滴度的,抗,BPO,血清,或,抗,BPO,单克隆抗体,，,200L/,孔，,37,保温,2h,。,（,4,）,洗涤,三次。,（,5,）,与酶联抗抗体反应,：再加入,1,50,稀释的,GAR-IgG-HRP,200L/,孔，,37,保温,1h,。,（,6,）,洗涤,三次。,（,7,）,显色,：加入,OPD,底物液，,200L/,孔，,37,显色。,第二节,酶联免疫吸附分析法,58,.,（,8,）用,1mol/L,的硫酸,终止,反应，,50L/,孔，用酶标仪测定其在,492nm,波长处的光吸收值。,（,9,）,结果判断,：当阳性孔呈阳性，阴性血清呈阴性时,实验成立,。,若当待测抗原的,测定结果大于,阴性对照,均值,（,X,）与其,2,倍标准差（,SD,）之和（,X+2SD,），判为,阳性,；,若小于,X+SD,，判为,阴性,；,若在,X+2SD,与,X+SD,之间需要调整试验条件,重新测试,。,ELISA,测定,125,SerIL-2,中青霉噻唑蛋白的结果如下（见表,7-4,）：,第二节,酶联免疫吸附分析法,59,.,表,7-4 ELISA,实验测定,125,SerIL-2,*,中青霉噻唑蛋白,第二节,酶联免疫吸附分析法,60,.,包被样品稀释至约,210,-6,mg,（,110,-16,mol,）,/,孔时，,ELISA,反应仍为阳性，提示,样品中,BPO,的量大于,110,-5,mol,，即待测样品中含有结合青霉素的绝对含量为千分之一左右。,第二节,酶联免疫吸附分析法,61,.,一、,化学发光分析,1,、化学发光（,chemiluminescence,，,CL,）,一些物质在进行化学反应时，,吸收,了化学反应过程中产生的,化学能,，使得分子,外层电子,激发到,激发态,，生成激发态产物。当电子从激发态的最低振动能级,回到基态,的各个振动能级时，以,光辐射,的形式释放能量，这个发光过程称为,化学发光,，其反应过程如下：,发光效率,表示一个化学发光分子的量子产率,，指,每摩尔反应物,辐射出光子的量。,第三节,发光酶联免疫分析,62,.,2,、化学发光分析,化学发光分析,是根据化学反应,产生的光辐射,确定,物质含量,的一种痕量分析方法。,化学发光免疫分析,（,CLIA,）是将,化学发光反应,与,免疫反应,相结合而对,抗体,、,抗原,或,半抗原,进行测定的一种免疫分析方法。,第三节,发光酶联免疫分析,63,.,3,、化学发光剂,用作标记的化学发光剂应,符合以下条件,：,能,参与化学发光,反应；,与抗原或抗体偶联后能,形成稳定结合物,；,偶联后仍,保留高的量子产率,和,反应动力,；,不改变,或极少改变,被标记物,的物理化学,特性,，特别是免疫活性。,常用的化学发光剂有,吖啶酯类,化合物,、,氨基苯二酰肼类,化合物,、,咪唑类,化合物,、,苯酚类,化合物,、,芳基草酸酯类,化合物,等,。,第三节,发光酶联免疫分析,64,.,（,1,）,吖啶酯类化合物,吖啶酯是,三环,有机化合物，很容易氧化。,当其,在碱性介质,中,氧化,时，经历共价键的断裂，产生,二氧酮,的中间体，然后形成电激发的,N-,甲基吖啶酮,。当它回复到基态时在,430nm,处释放出光子。,在,加入,H,2,O,2,及随后加入,NaOH,调节至所需,pH,之前维持一,低,pH,以实现,最佳氧化,过程，可加速其氧化反应。,吖啶酯氧化反应如图,7-12,所示。,第三节,发光酶联免疫分析,65,.,图,7-12,吖啶酯氧化反应过程,第三节,发光酶联免疫分析,66,.,吖啶酯类化学发光剂的典型代表是,光泽精,（,N,N,-,二甲基吖啶硝酸酯,）。,它在碱性条件下，与,H,2,O,2,等,过氧化物,作用形成发光体激发态,N,-,甲基吖啶酮。,能促使光泽精激发的物质还有,丙酮、次黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、羟胺及抗坏血酸,等。,光泽精的氧化反应如图,7-13,所示。,第三节,发光酶联免疫分析,67,.,图,7-13,光泽精的氧化反应,第三节,发光酶联免疫分析,68,.,吖啶酯类化合物作为化学发光标记物有显著的,优点,：,氧化反应不需催化剂,，只需要在,碱性环境,中就可以进行，发光,反应快速,，在,1s,内光子散射达到高峰,，整个过程在,2s,内完成，可充分计数，,背景噪声低,。,这类化合物与被标记物的,结合发生在分子一定部位,，在氧化反应过程中，结合物被分解，,吖啶酯分子从发光的部分断裂并分离下来,，所以吖啶酯的发光,不受抑制,，敏感度不受标记反应的影响，,试剂稳定性好,。,第三节,发光酶联免疫分析,69,.,（,2,）,氨基苯二酰肼类化合物,鲁米诺,（,5-,氨基,-2,3-,二氢,-1,4-,酞嗪二酮）、,异鲁米诺,（,6-,氨基,-2,3-,二氢,-1,4-,酞嗪二酮）及其,衍生物,如氨丁基乙基异鲁米诺（,ABEI,）、氨己基乙基异鲁米诺（,AHEI,）、氨丁基乙基鲁米诺（,ABENH,）等,均,属于这一类化学发光剂。,鲁米诺类化合物的发光反应,必须有催化剂,（如,过氧化物酶,）催化，且,与蛋白或肽结合后,其发光作用,减弱,，因此鲁米诺类化合物在,CLIA,中是很好的底物，但已较少用于,CLIA,的标记。,第三节,发光酶联免疫分析,70,.,图,7-14,鲁米诺、异鲁米诺及其某些衍生物的结构式,第三节,发光酶联免疫分析,71,.,图,7-15,鲁米诺化学发光反应过程,第三节,发光酶联免疫分析,72,.,（,3,）咪唑类化合物,咪唑类发光剂主要,是,咯吩碱,。,其反应过程首先是咯吩碱在,碱性二甲亚砜水溶液,中形成,过氧化物中间体,，再进行,重排,，,降解,，伴随产生,化学发光,，如图,7-16,所示。,第三节,发光酶联免疫分析,73,.,图,7-16,咯吩碱的化学发光反应,第三节,发光酶联免疫分析,74,.,（,4,）,苯酚类,化合物,用于化学发光免疫测定的酚类物质主要是,邻苯三酚,（焦性没食子酸），它是一种强还原剂，在,催化剂,（如,HRP,、,血红素）催化下，与,H,2,O,2,反应产生化学发光。,（,5,）,芳基草酸酯类,化合物,这类化合物主要有,双,-,（,2,4,6-,三氯苯基,）,草酸酯,（,TCPO,）和,双,-,（,2,4-,二硝基苯基,）,草酸酯,（,DNPO,）。,此类物质的发光反应是在反应体系中加入一种,荧光染料,如,8-,苯胺基,-1-,萘磺酸,（,ANS,）作为荧光载体，通过,过氧化草酸酯中间产物,捕获化学能，使,荧光体处于激发态,，退激至基态时，放出光子。,第三节,发光酶联免疫分析,75,.,二、,化学发光酶联免疫分析,1,、化学发光酶联免疫分析,以在酶催化反应中可以产生化学发光的,发光物质作为底物,，以化学发光法,检测酶的活性,，则为,化学发光酶联免疫分析,（,chemiluminescent enzyme immuno,-,assay,，,CLEIA,）。,CLEIA,方法的检测限低至,10,-17,mol/L,，达到或超过放射免疫分析的灵敏度。,化学发光酶联免疫分析实际上是一种酶联免疫测定过程。,第三节,发光酶联免疫分析,76,.,2,、,CLEIA,常用的标记酶,CLEIA,方法中最常用的是辣根过氧化物酶和,葡萄糖氧化酶,（,GOD,）。,此外还有,丙酮酸激酶,、,葡萄糖,-6-,磷酸脱氢酶,、,萤火虫素酶,、,碱性磷酸酶,（,AP,）和,-D-,半乳糖苷酶,等。,HRP,标记,的,CLEIA,，常用,的底物为鲁米诺或其衍生物,。,第三节,发光酶联免疫分析,77,.,鲁米诺,的氧化反应在,碱性,缓冲液中进行，通常以,0.1mol/L,、,pH8.6,的,Tris,缓冲液,作底物液，鲁米诺和,H,2,O,2,在无,HRP,催化时也能缓慢,自发发光,，而在最后光强度测定中造成,空白干扰,，因而宜,分别配制,成两瓶试剂溶液，只在用前即刻混合。,HRP,催化鲁米诺的氧化,反应可被,某些,酚类物质,（如对碘苯酚）或,萤火虫荧光素酶,等,增强,。,增强剂的作用是,增强发光,和,延长发光时间,，由此可提高敏感度。,另外一些,金属配合物,能催化鲁米诺的化学发光反应。,第三节,发光酶联免疫分析,78,.,利用,GOD,对,葡萄糖,的催化氧化,产生,H,2,O,2,，用,化学发光反应底物检测,产生的,H,2,O,2,，可间接测定,GOD,的活性。,常见发光反应底物有,鲁米诺,、,TCPO,等,。,如,Masako,和,Akio,以,GOD,为标记酶,，,鲁米诺,-H,2,O,2,作为发光底物，以流动注射化学发光分析测定,17-,羟基孕甾酮,、,甲胎蛋白,和,胰岛素,，检测限分