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*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。,企业生产过程微生物污染控制实例分析,-无菌制剂生产过程微生物菌库建立和种属判定,辽宁省食品药品检验所抗生素室,张亚杰,.5,第1页,一、立项目标,二、采样方案,三、试验材料及仪器设备,四、判定方法,五、判定结果,六、结果分析,七、讨论,第2页,（1）为了了解无菌制剂生产过程中微生物污染情况，即微生物种类及分布情况，实现生产环境微生物、操作过程微生物与药品中污染微生物比较和溯源分析，方便到达生产过程微生物实时有效动态控制目标。从而满足药品GMP对无菌制剂生产过程中微生物污染监测和控制要求。,（2）生产企业也能够利用这些数据，对无菌制剂生产过程进行微生物风险评定。,一、,立项目标,第3页,1.采样区域确实定,2.采样对象及方式确实定,3.采样频次确实定,二、采样方案,第4页,依据车间面积、房间数，考虑到可能影响到产品质量关键区域及易于受到微生物污染关键部位分布，设定了监测点及采样方案。企业按照中国新版药品GMP要求，将洁净区划分为A级（动态100级）、B级（静态100级）、C级（10000级）、D级（100000级）。,微生物采样点分布图见图1和图2。其中一车间采样点共39个，二车间采样点共98个。,1.采样区域确实定,第5页,1.采样区域确实定（一车间）,第6页,1.采样区域确实定（二车间）,第7页,人员：手套印记,表面接触（头、胸、,手腕、肘、膝盖）,环境：沉降菌（A级、B级、,C级）,浮游菌（A级、B级）,2.采样对象及方式确实定,第8页,企业依据生产情况和制剂车间使用频次按季度制订采样频次，共搜集4个季度样本。,3.采样频次确实定,第9页,1样本起源,2培养基,3仪器设备,4试剂试药,三、试验材料及仪器设备,第10页,1样本起源,无菌制剂一车间和二车间286份样,本,2培养基,胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA），批号：1221965，BD企业；,麦康凯琼脂（Mac），批号：1108423,BD企业；,MRS琼脂，批号：100915，北京陆桥技术有限责任企,业,三、试验材料及仪器设备,第11页,3仪器设备,全自动微生物生化判定仪（Viteck 2 Compact）：法国生物梅里埃企业；,麦氏浊度比浊仪：法国生物梅里埃企业；,BX 41 光学成像显微镜：日本奥林巴斯企业；,卡玛薄层色谱成像仪:瑞士CAMAG卡玛企业。,API,RP,三、试验材料及仪器设备,第12页,4试剂试药,革兰氏染色液：青岛高科园海博生物科技有限企业；,GN判定卡、GP判定卡、BCL判定卡、YST判定卡、ANC判定卡：法国生物梅里埃企业。,API,RP,三、试验材料及仪器设备,第13页,判定流程图,四、判定方法,第14页,1.菌种纯化与复壮,采集微生物可能在物理、化学消杀条件下暴露,了较长时间，菌株本身可能存在一定损伤和变异，有必,要对送检菌株进行复壮和再次纯化。,首选复壮及纯化培养基为胰酪胨大豆琼脂培养基,（TSA）;对于革兰氏阴性菌，在无法与革兰氏阳性菌区分,情况下，也会选择MaC琼脂作为纯化培养基；对于较难,培养菌株，也采取血平板、改良MRS琼脂等进行纯培,养。,四、判定方法,第15页,四、判定方法,短小芽孢杆菌,第16页,溶血葡萄球菌,四、判定方法,第17页,施氏假单胞菌,四、判定方法,第18页,2.革兰氏染色及镜检,表皮葡萄球菌,四、判定方法,第19页,2.革兰氏染色及镜检,迟缓芽孢杆菌,四、判定方法,第20页,2.革兰氏染色及镜检,施氏假单胞菌,四、判定方法,第21页,3.生化判定,（1）采取全自动微生物生化判定仪（Viteck 2,Compact），依据革兰染色结果选择判定卡。,（2）将24小时培养物，用0.45%无菌氯化钠,溶液制备一定浊度菌悬液，将64个生化反应,集成到Viteck判定卡上，普通2-10小时左右给出,判定结果。,（3）结果判断：相同度96%-99%为极好，95%-92%为很好，91%-89%为好，88%-85%为能够接收，85%以下相同度为低分辨率判别。对于只判定到属判别，还需依据提醒信息进行补充试验，深入甄别到种。,四、判定方法,第22页,（一）人员环境总体结果,一车间：110株,其中：人员67株,环境43株,二车间：182株,其中：人员133株,环境49株,总计：292株，其中阳性球菌109株（37.3%）,阳性芽孢杆菌 114株（39.0%）,阳性无芽孢杆菌 22株（7.5%）,阴性杆菌 39株（13.4%）,-12,-12-1,五、判定结果,第23页,(二)不一样区域结果 一车间主要区域,五、判定结果,分装,灌装区,（B级）,人员,环境,金黄色葡萄球菌,溶血葡萄球菌,头状葡萄球菌,蜡样/蕈状/苏云金芽孢杆菌,泛菌属,少动鞘氨醇单胞菌,短小芽孢杆菌,花域芽孢杆菌,解淀粉/萎缩/枯草芽孢杆菌,迟缓芽孢杆菌,解淀粉类芽孢杆菌,变异库克菌等,溶血葡萄球菌,腐生葡萄球菌,木糖葡萄球菌,表皮葡萄球菌,人葡萄球菌,藤黄微球菌/里拉微球菌,苏云金芽孢杆菌,少动鞘氨醇单胞菌,嗜麦芽寡养单胞菌,巨大芽孢杆菌等,第24页,(二)不一样区域结果 一车间主要区域,五、判定结果,调剂区,（C级）,人员,环境,人葡萄球菌/腐生葡萄球菌,溶血葡萄球菌,表皮葡萄球菌,科氏葡萄球菌科氏亚种,苛养颗粒链菌/藤黄微球菌/里拉微球菌,藤黄微球菌/里拉微球菌,施氏假单胞菌,缺点短波单胞菌/泡囊短波单胞菌,泛菌属,浅黄假单胞菌,马耳他布鲁菌,非脱羧勒菌,少动鞘氨醇单胞菌/杀鲑气单胞菌,巨大芽孢杆菌,鲍曼不动杆菌,蜡样/蕈状/苏云金芽孢杆菌,解脲棒杆菌,克氏库克菌,铫子短小芽孢杆菌,短小芽孢杆菌等,短小芽孢杆菌,耳炎差异球菌/玫瑰色库克菌,（采样少）,第25页,(二)不一样区域结果 二车间主要区域,五、判定结果,调剂区,（B级）,人员,环境,头状葡萄球菌,藤黄微球菌/里拉微球菌4,溶血葡萄球菌,腐生葡萄球菌,金黄色葡萄球菌/中间葡萄球菌,山羊葡萄球菌,表皮葡萄球菌3,花域芽孢杆7,枯草/解淀粉/萎缩芽孢杆菌11,巨大芽孢杆菌2,坚强芽孢杆菌2,肠膜明串珠菌乳脂亚种,迟缓芽孢杆菌5,枯草/解淀粉/萎缩/花域芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,波茨坦短小芽孢杆菌,玫瑰色库克菌,杀鲑气单胞菌/奈瑟菌属,西宫皮球菌/坐皮肤球菌,少动鞘氨醇单胞菌,蜡样/蕈状/苏云金芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,铫子短小芽孢杆菌等,人葡萄球菌,沃氏葡萄球菌,金黄色葡萄球菌2,头状葡萄球菌,藤黄微球菌/里拉微球菌,模仿葡萄糖球菌,非脱羧勒菌,植生拉乌尔菌,克氏库克菌,酸土脂环酸芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,地衣芽胞杆菌,简单芽孢杆菌,鲍曼不动杆菌,乳酸杆菌,解淀粉/萎缩/枯草芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌等,第26页,(二)不一样区域结果 二车间主要区域,五、判定结果,分装灌装区,（B级）,人员,环境,沃氏葡萄球菌,金黄色葡萄球菌,溶血葡萄球菌2,藤黄微球菌/里拉微球菌8,鲁氏不动杆菌/少动鞘氨醇单胞菌/杀鲑气单胞菌,枯草芽孢杆菌2,枯草/解淀粉/萎缩芽孢杆菌2,花域芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,施氏假单胞菌,短小芽孢杆菌4,迟缓芽孢杆菌2,蜡样/苏云金/蕈状芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌等,藤黄微球菌/里拉微球菌,鲁氏不动杆菌,铜绿假单胞菌,蜡样/苏云金/蕈状芽孢杆菌2,波茨坦芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,史密氏芽孢杆菌,迟缓芽孢杆菌等,第27页,（三）不一样季节判定结果,第一季度：,本季度阳性芽孢杆菌检出率最高，到达了44.9%；阳性球菌检出率居第2位为43.5%，阳性杆菌检出率为7.2%，阴性杆菌检出率为4.3%。,五、判定结果,第28页,（三）不一样季节判定结果,第二季度：,在本季度，阳性芽孢杆菌种群占据绝对优势地位，为54.2%；阳性球菌检出率为33.6%；阳性无芽孢杆菌和阴性杆菌检出率均为5.6%。,五、判定结果,第29页,（三）不一样季节判定结果,第三季度：,在本季度，阳性球菌检出率为38.3%，阴性杆菌检出率为31.7%，阳性芽孢杆菌检出率为16.7%，阳性无芽孢杆菌检出率为6.7%。,五、判定结果,第30页,（三）不一样季节判定结果,第四季度：,本季度阳性球菌检出率为35.7%，阴性杆菌检出率为21.4%，阳性芽孢杆菌检出率为26.8%，阳性无芽孢杆菌检出率为12.5%。,五、判定结果,第31页,第32页,食品微生物方法标准,第33页,1、生产过程微生物污染结果分析,经过以上样本判定结果，能够看出，生产过程微,生物污染主要起源于人员及人员不妥操作过程。环境,微生物种类与人员表面微生物种类基本一致，主要是,革兰阳性葡萄球菌属和革兰阳性芽孢杆菌。,六、结果分析,第34页,2.不一样季节微生物污染趋势改变,一车间：,从年第3季度到年第2季度，一车间革兰氏阳性球菌检出率一直维持在40%50%区间范围内；革兰氏阳性无芽孢杆菌检出率在10%上下徘徊；放线菌、霉菌、酵母菌仅在年第3季度零星检出；革兰氏阳性芽孢杆菌展现逐步上升趋势；革兰氏阴性杆菌展现逐步下降趋势。,六、结果分析,第35页,2.不一样季节微生物污染趋势改变,二车间：,从年第4季度到年第2季度，二车间革兰氏阳性球菌检出率在30%50%区间范围内；革兰氏阳性无芽孢杆菌检出率在10%上下徘徊；放线菌在年第4季度和年第2季度零星检出；革兰氏阳性芽孢杆菌展现逐步上升趋势；革兰氏阴性杆菌展现逐步下降趋势。,六、结果分析,第36页,2.不一样季节微生物污染趋势改变,1）在第一、二季度，阳性芽孢杆菌种群优势显著。,原因分析：北方第一、二季度因为天气严寒干燥，一些在夏秋轻易滋生微生物，如革兰氏阴性细菌、霉菌和酵母菌营养体在空气中显著降低，而芽孢杆菌休眠体（芽孢）则相对增多；另首先，冬春两季北方大气质量较差，空气中悬浮尘埃粒子较多，芽孢能够随尘埃迁入洁净区甚至空调净化设备中，,并长久驻留。,2）四个季节阳性球菌种群和所占百分比基本一致。,提醒：阳性球菌种群受季节性原因影响较小。,六、结果分析,第37页,2.不一样季节环境微生物判定结果分析：,3）在第三季度（夏季），阴性杆菌检出率较高，,阳性芽孢杆菌检出率为四个季度中最低。,提醒：夏季优势菌群为阳性球菌和阴性杆菌。,六、结果分析,第38页,1.主要微生物污染源,经过上述分析，296株菌中有200株来自于人员表面接触皿，可见得无菌制剂生产过程微生物最大污染源就是人，人员数量和活动将直接影响着整个洁净区环境质量。提醒要严格控制操作人员卫生情况和无菌操作技术。,2.依据微生物分布情况，制订合理控制办法,经过上述分析，依据不一样季节生产过程微生物主要种群分布趋势，选择适宜消杀方法和适当控制办法，到达更加好控制人员和生产环境目标。,七、讨论,第39页,3.方法尚存在问题，有待深入改进,此次考查是对无菌制剂生产过程微生物污染情况初步探索研究，主要采使用方法国生物梅里埃全自动微生物生化判定仪（Viteck 2 Compact）进行判定，因为数据库原因，一些革兰阳性无芽孢杆菌极难判定。另外还存在需深入进行生化试验因为时间关系而未进行情况。,七、讨论,第40页,4.对微生物溯源分析认识,建立菌库目标是发觉微生物污染规律，更加好地进行生产过程控制。但要到达溯源分析目标需要在现有环境微生物数据库基础上建立基于基因分型数据库，方能真正实现生产环境微生物与药品中污染微生物比较和溯源之目标。,七、讨论,第41页,感激聆听！谢谢！,第42页,
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