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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。,重组DNA技术,(DNA克隆或分子克隆),DNA Recombination Technique,(DNA Cloning or Molecular Clone),第二章,1/79,1944年 O.T.Avery肺炎球菌转化试验:,从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质，并把每一个成份同活R型细菌混合，悬浮在合成培养液中。结果发觉只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌,2/79,重组DNA技术发展史,O.T.Avery（1944年）证实，遗传信息携带者是DNA；,1953年,Watson和Crick提出了DNA分子双螺旋结构模型,1958年,Meselson和Stahl证实了DNA半保留复制,同年，Crick提出遗传信息传递“中心法则”,1961年，,F.Jacob和J.Monod提出了操纵子模型,1966年,，,Nirenberg等人破译了氨基酸64个遗传密码,1972年，P.Berg等率先完成DNA体外重组(诺贝尔化学奖),1973年，S.Cohen等深入实现了重组DNA转化,1977年 美国南旧金山建立世界上第一家遗传工程企业，专门应用重组DNA技术制造医学上主要药品。,1980年，第一家应用重组DNA技术生产胰岛素工厂。,1982年，美国FDA同意首例基因工程产品-人胰岛素,1997年 英国罗林研究所成功克隆了多莉,。,3/79,人体生长激素释放激素(SS),抑制和调整各种激素作用,从动物脑中提取:,5mg-,50万只羊脑,基因工程,9升大肠杆菌,培养液,4/79,相关概念,DNA克隆,工具酶,目标基因,基因载体,基本原理,重组DNA技术与医学关系,主要内容：,5/79,第一节,、重组DNA技术相关概念,Concept Associated to Recombinant DNA Technology,克隆(clone):,是指从一个共同祖先无性繁殖下来一群遗传上同一DNA分子、细胞或个体所组成群体,获取同一拷贝过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一）DNA克隆,6/79,技术水平：,分子克隆(molecular clone),（即DNA 克隆）,细胞克隆,个体克隆（动物或植物）,7/79,是在,体外,将不一样起源,特异基因或DNA片段,插入病毒、质粒或其它,载体,分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到适当,受体细胞,中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），,筛选,出含有目标基因转化子细胞，再进行扩增、提取取得大量同一DNA分子(recombinant DNA,chimera DNA），即DNA克隆，所以DNA重组技术又称为DNA克隆（DNA cloning）。,DNA克隆,8/79,生物技术工程:,基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,基因工程(genetic engineering),实现基因克隆所用方法及相关工作称基因工程，又称重组DNA工艺学或,重组DNA,技术(recombination DNA technique)，基因操作(gene manipulation)、遗传工程(genedc engineering)。,9/79,(二)目标基因,进行DNA重组目标主要有两方面：,分离取得某一感兴趣基因或DNA,取得感兴趣基因表示产物（蛋白质）,这些,使我们感兴趣基因或DNA序列,就是目标基因(target DNA),。,目标基因有两种类型：,cDNA(complementary DNA):在体外经反转录合成与mRNA互补DNA。,基因组DNA(Genomic DNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息全部DNA序列。,10/79,(三)载体,一.表示载体(expression vector):,为使插入外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计载体称为,表示载体,。,二.克隆载体(Cloning vector):,为使插入外源DNA序列被扩增而特意设计载体称为,克隆载体,。,11/79,第二节 重组DNA技术操作基本过程,基本原理,目标基因获取,DNA导入受体细胞,外源基因与载体连接,克隆载体选择和构建,重组体筛选,克隆基因表示,12/79,重组DNA技术操作过程可形象归纳为：,分,分离目标基因,切,限制酶切目标基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体细胞,筛,筛选重组体,13/79,目标基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,14/79,以,质,粒,为,载,体,DNA,克,隆,过,程,15/79,16/79,第三节 主要工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割DNA,DNA连接酶,催化DNA中相邻5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接,DNA聚合酶,合成双链cDNA分子或片段连接,缺口平移制作高比活探针,DNA序列分析,填补3末端,Klenow片段,又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而无53外切活性。惯用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标识等,反转录酶,合成cDNA,替换DNA聚合酶I进行填补，标识或DNA序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标识探针,末端转移酶,在3羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,17/79,一.限制性核酸内切酶,(,restriction endonuclease),限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是识别DNA特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA一类内切酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,定义：,18/79,第一个字母取自产生该酶细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发觉先后次序。,命名：,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株第三种酶,、（基因工程技术中惯用型）,分类：,19/79,型限制性核酸内切酶作用特点,回文结构(palindrome),大部分型限制酶能够识别由4个8个核苷酸组成特定序列。型酶识别含有回文结构核苷酸序列（图2-2）。“回文”意为顺读和倒读都一样词语,切口：,平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,20/79,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,粘端切口,21/79,起源不一样限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称,同功异源酶,。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,同功异源酶：,22/79,有些限制性内切酶即使识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同粘性末端，称为同尾酶。这两个相同粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,同尾酶,23/79,名称 识别序列及切割位点,名称识别序列及切割点,切割后产生突出末端:,BamH,5G,GATCC.3,Bgl,5A,GATCT.3,EcoR,5G,AATTC.3,Hind,5A,AGCTT.3,Hpa,5C,CGG.3,Mbo,5,GATC.3,Nde,5GA,TATG.3,切割后产生3突出末端:,Apa,5GGGCC,C.3,Hae,5PuGCGC,Py.3,Kpn,5GGTAC,C.3,Pst,5CTGCA,G.3,Sph,5GCATG,C.3,切割后产生平末端:,Alu,5AG,CT.3,EcoR,5GAT,ATC.3,Hae,5GG,CC.3,Pvu,5CAG,CTG.3,Sma,5CCC,GGG.3,限制性内切核酸酶,24/79,二、DNA连接酶(基因工程“缝纫针”)：,1.T4噬菌体DNA连接酶：两个不一样片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6mol/L)或平末端(Km=50mol/L)。DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导,2.大肠杆菌DNA连接酶:,不能催化平末端DNA分子连接,三、DNA聚合酶,1.大肠杆菌DNA聚合酶I,及其大片段(Klenow片段):,大肠杆菌DNA聚合酶I含有三种酶活性。,Klenow片段,含有二种酶活性（去除5 3外切酶活性）。,2.Taq,DNA聚合酶:耐热（75-80,），分子量65kD,也具5 3外切酶活性。,反转录酶(RDDP):多功效酶，无3 5DNA外切酶活性，含有3 5RNA外切酶活性。,25/79,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割DNA,DNA连接酶,催化DNA中相邻5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接,DNA聚合酶,合成双链cDNA分子或片段连接,缺口平移制作高比活探针,DNA序列分析,填补3末端,Klenow片段,又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而无53外切活性。惯用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标识等,反转录酶,合成cDNA,替换DNA聚合酶I进行填补，标识或DNA序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标识探针,末端转移酶,在3羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,26/79,第四节 惯用载体,定义,载体是携带目标基因进入宿主细胞扩增和表示工具。具备条件:,含有自主复制能力,有多个单一限制性内切酶酶切位点（MCS）,含有选择性遗传标识,分子量小,拷贝数高（10个200个/细胞）,含有较高遗传稳定性。,惯用载体:,质粒DNA,噬菌体DNA,病毒DNA,27/79,Eco,R,Sac,Kpn,Sma,Bam,H,Xba,Sal,Pst,Sph,Hind,pUC19,(2 686bp),Amp,r,LacZ,Ori,ori,pUC19质粒载体图,28/79,质粒,(plasmid):,是细菌内携带染色体外小型双链环状DNA，能独立进行复制。,特点:,1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自主复制；有较高拷贝数。,2.含有一个以上遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。,3.含有多个限制性酶单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因插入。,29/79,惯用质粒载体,（一）,pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA经过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：,（1）含有复制起始点和复制调整信号；,（2）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目标基因；,（3）有抗四环素基因Ter,+,和抗氨苄青霉素基因 Amp,+,，便于重组体细胞筛选。,30/79,31/79,1.抗药性标识选择,32/79,（二）,pUC系列载体:,由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点：,含有更小分子量和更高拷贝数。,“蓝白斑”筛选:,pUC载体中LacZ基因可编码-半乳糖苷酶（-Gal）N端-肽链，该-肽与宿主细胞(如E.coli JM109）中F因子上LacZ,M,15基因（-肽缺点型）产物互补，产生完整、有活性-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成蓝色菌落。当外源基因插入MCS后，LacZ-肽基因读码框被破坏，不能合成完整-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。称为“蓝白斑”筛选。,33/79,Eco,R,Sac,Kpn,Sma,Bam,H,Xba,Sal,Pst,Sph,Hind,pUC19,(2 686bp),Amp,r,LacZ,Ori,ori,pUC19质粒载体图,34/79,3依据-半乳糖苷酶显色反应筛选:,标志补救,lacZ,Am,N,2,H,片段,COOH,片段,35/79,X-gal,Lac Z,蓝色化合物,X-gal,36/79,第五节 目标基因获取和体外重组,化学合成法：,较短基因（60-80bp）,基因组DNA文库(genomic DNA library),cDNA文库(cDNA library),聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),一.目标基因获取:,37/79,1.化学合成法获取目标基因,由已知氨基酸序列推测可能DNA序列。,较短基因（60-80bp）,用途：PCR引物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针,38/79,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带全部基因组DNA集合,2.从基因组DNA文库获取目标基因,基因组DNA(genomic DNA):指代表一个细胞或生物体整套遗传信息全部DNA序列,39/79,构建基因组DNA文库基本过程,40/79,mRNA,cDNA,双链cDNA,重组DNA分子,cDNA文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,3.从cDNA文库获取目标基因,逆转录酶,A A A A,T T T T,AAAA,SI核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,cDNA:,指经反转录合成、与RNA(mRNA或病毒RNA)互补单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA,41/79,基因组文库和cDNA文库比较,42/79,PCR技术基本过程,模板DNA,dNTP,引物,Buffer,预变性,模板DNA,dNTP,引物,Buffer,TaqDNA聚合酶,循环仪,94,o,C5,94,55,72,4.PCR技术获取目标基因:,43/79,二.外源基因与载体连接:体外重组,DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶催化作用下，将外源DNA分子与载体DNA分子连接成一个重组分子过程。,连接方式:,（一）黏性末端连接,（二）平末端连接,（三）同聚物加尾连接,（四）人工接头连接,（五）T-A克隆,44/79,Bam,H切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目标基因用,Bam,H,切割,载体DNA用,Bam,H切割,重组体,载体自连,目标基因自连,同一限制酶切位点连接,1.粘性末端连接,45/79,不一样限制酶切位点连接,Eco,R切割位点,Bg,l切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA连接酶,15,C,重组体,46/79,目标基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA连接酶,15,C,重组体,载体自连,目标基因,自连,2.,平端连接,47/79,DNA连接酶,同聚物尾巴,同聚物加尾法连接重组DNA分子,同聚物加尾连接:,在末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,48/79,利用人工合成接头连接重组DNA分子,4.人工接头(linker)连接:,由平端加上新酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接,49/79,5.T-A克隆,T-A克隆策略是一个直接将PCR产物插入到载体中方法。,50/79,一、重组DNA分子导入,选定受体细胞应具备条件：,1.易于接纳重组DNA分子导入；,2.对载体复制、扩增和表示无严格限制；,3.不存在特异性降解外源DNA酶系统；不对外源DNA进行修饰；能表示重组体分子所提供某种表型特征。,惯用导入方法:,（一）转化（transformation）,（二）转染（transfection）,（三）感染（infection）,第六节 重组DNA分子导入和筛选与判定,51/79,转化方法：,1.氯化钙法：,细菌处于低温、低渗CaCl2溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组DNA易进入,2.电穿孔法：,除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。,特殊处理,受体细胞,细胞膜特征改变,（一）转化（transformation）,52/79,CaCl,2,处理,受体细菌,50-100mmol/L,CaCl,2,感受态细菌,重组体转入细菌,53/79,（二）转染,将表示载体导入真核细胞过程,方法：,磷酸钙转染,DEAE葡聚糖介导转染,电穿,孔:,操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表示或稳定表示。不过它需要专门仪器，确定最正确试验条件。,脂质体转染:,脂质体（liposomes）是一个人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表示和稳定表示，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵。,显微注射:,转染效率高，但需要一定仪器和操作技巧。主要用于稳定表示,54/79,（三）感染（infection）,感染是指以人工改造噬菌体或病毒为载体构建重组体DNA，经,体外包装,成含有感染性噬菌体颗粒和病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒外壳蛋白将重组DNA注入细菌或真核细胞。,感染效率很高，但重组体DNA需经过较为复杂体外包装过程。,55/79,(一）依据重组载体遗传表型进行筛选,1依据载体抗药性标识筛选,2依据载体抗药性标识插入失活选择,3依据-半乳糖苷酶显色反应筛选,4依据插入外源基因性状进行筛选,(二）限制性核酸内切酶酶切判定,（三）核酸分子杂交法,（四）PCR法,（五）免疫化学检测法,（六）DNA序列检测,：,二.重组体筛选与判定,56/79,1.抗药性标识选择,57/79,Amp,r,Tet,r,Bam,H位点,Bam,H酶切,Bam,H酶切,DNA连接酶,目标DNA,重组质粒,大肠杆菌,含Amp平板,含Amp平板,含Tet平板,2.抗药性标识插入失活选择,58/79,3依据-半乳糖苷酶显色反应筛选:,标志补救,lacZ,Am,N,2,H,片段,COOH,片段,59/79,X-gal,Lac Z,蓝色化合物,X-gal,60/79,4依据插入外源基因性状进行筛选,如把酵母基因组DNA随机切割后插入到质粒载体中，然后将重组质粒转化到组氨酸缺点型大肠杆菌细胞中，并在无组氨酸培养基中培养。这么只有含酵母组氨酸基因并取得表示转化菌才能在无组氨酸培养基中生长。,61/79,（二）.限制性核酸内切酶酶切判定,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒PCR扩增片段,62/79,原位杂交,（三）.核酸分子杂交法:,菌落杂交筛选法,63/79,（四）.PCR法,一些载体MCS两侧存在保守序列，如pGEM系列载体MCS两侧是T7及SP6开启子序列，可依据此序列设计引物，对提取重组质粒进行PCR扩增。,假如已知目标基因全序列或其两端序列与全长，可设计合成一对引物，以转化菌质粒DNA为模板进行PCR扩增，若PCR产物与目标基因预期长度相一致，那么即可初步筛选出含重组体阳性菌落。,64/79,鸡肌球蛋白克隆和检出,（五）.免疫化学检测法,65/79,（六）.DNA序列检测,ACTGAAGGCT,66/79,标准：选择标志，强开启子，翻译调控序列，多接头克隆位点,外源基因在原核细胞中表示：,1融合型表示蛋白 所谓融合型表示是指将外源目标基因与另一基因相拼接构建成融合基因进行表示。,2非融合型表示蛋白,3分泌型表示蛋白 利用分泌型表示载体，需要在信号肽帮助下进行。4包涵体,1.原核表示体系,第七节 克隆基因表示,67/79,E.coli表示体系不足：,不宜表示真核基因组DNA；,不能加工表示真核蛋白质；,表示蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body),；,极难表示大量可溶性蛋白,68/79,优点：,可表示克隆cDNA及真核基因组DNA,可适当修饰表示蛋白质,表示产物分区域积累,缺点：,操作技术难、费时、经济,2.真核表示体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）,69/79,真核表示载体大多是穿梭载体,通常包含以下元件：,1开启子 包含SV40、CMV、RSV及LTR等。,2增强子,3剪接信号,4终止信号和PolyA化信号,5遗传选择标识：胸苷激酶基因（,tk,）、二氢叶酸还原酶基因（,dhfr,）、氯霉素乙酰转移酶基因（,cat,）、新霉素抗性基因（,neo,r,）等。,70/79,新霉素抗性选择系统,新霉素类似物G418（geneticin）对真核和原核细胞都有毒性。表示载体中携带,neo,r,基因编码磷酸转移酶能使G418失活，所以当真核细胞中导入了含,neor,基因载体后，转染细胞就能够在含有G418培养基中生长而得以筛选。该选择系统适合用于全部真核细胞,。,71/79,重组DNA技术与医学,关系非常亲密并前景远大,DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective,72/79,重组DNA医药产品,产 品,功 能,组织胞浆素原激活剂,抗凝,血液因子VIII,促进凝血,颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子,剌激白细胞生成,促红细胞生成素,剌激白细胞生成,生长因子(bFGF,EGF),刺激细胞生长与分化,生长素,治疗侏儒症,胰岛素,治疗糖尿病,干扰素(,1b,2a,2b,),抗病毒感染及一些肿瘤,白细胞介素,激活、剌激各类白细胞,超氧化物歧化酶,抗组织损伤,单克隆抗体,利用其结合特异性进行诊疗试验、肿瘤导向治疗,乙肝疫苗(CHO,酵母),预防乙肝,口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗,预防霍乱,73/79,重组DNA技术操作主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目标基因（外源基因）,基因组DNA,cDNA,人工合成,PCR产物,限制酶消化,开环载体DNA,目标基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳判定,菌落原位杂交,74/79,一、A型题：,1以质粒为载体，将外源基因导入受体菌过程称为：,A转化 B转染 C转导,D转位 E感染,2最惯用筛选转化细菌是否含有质粒方法是：,A营养互补筛选 B抗药性筛选 C免疫化学筛选,D原位杂交筛选 ESouthern印迹筛选,3.互补筛选属于：,A抗药性标志筛选 B酶联免疫筛选 C标志补救筛选,D原位杂交筛选 E免疫化学筛选,4.溶原菌是指：,A整合了噬菌体基因组细菌 B整合了质粒基因组细菌,C含有独立噬菌体基因组细菌,D含有独立质粒基因组细菌,E含有独立噬菌体和质粒基因组细菌,75/79,5 理想宿主细胞不应有以下哪种特点：,A易接纳重组子 B对载体复制扩增无严格限制,C不存在特异限制酶体系以降解外源DNA,D不对外源DNA进行修饰 E含有载体筛选标识,6 相关重组体转化及表示叙述，错误是：,A宿主细胞经CaCl2处理后对重组体通透性增加,B电击法也可增加宿主细胞通透性,C噬菌体为载体重组体必须以体外包装方式转化宿主细胞,D真核基因难于在原核细胞中表示,E转化生殖细胞可采取直接导入方法,7.互补筛选属于：,A抗药性标志筛选 B酶联免疫筛选 C标志补救筛选,D原位杂交筛选 E免疫化学筛选,8.基因工程操作程序可简单概括为：,A将重组体导入宿主细胞并筛选 B限制酶应用,C将载体和目标基因接合成重组体 D目标基因和载体分离提纯与鉴,定,E分、切、接、转、筛,76/79,9.重组DNA筛选与判定不包含哪一方法,A.限制酶酶切图谱判定 B.PCR扩增判定,C.显微注射 D.蓝白筛选 E.抗药筛选,10.直接针对目标DNA进行筛选方法是,A青霉素抗药性 B氨卞青霉素抗药性 C分子杂交,D分子筛 E电泳,11以下那项不能作为表示载体导入真核细胞方法？,A磷酸钙转染 B电穿孔 C脂质体转染,D显微注射 E氯化钙转染,12以下那项不能作为基因工程重组体筛选方法,A 抗药性标志选择 BPCR技术,C原位杂交 DSouthern印迹 E siRNA,77/79,二、名词解释,1.转化,2.转染,3.,感染,4.转导,5.-互补（alpha complementatlon）,6.感受态细胞（competent cell）,7融合型表示,8.非融合型表示蛋白,78/79,三,、问答题,1,简述互补筛选重组体质粒细菌原理？,2.试述G418筛选稳定表示细胞系原理？,3.重组DNA分子导入受体细胞方法有哪些？,4.制备感受态细胞原理是什么？当前最惯用感受态细胞制备方法是什么？,5.基因工程中重组体筛选与判定方法有那些？,79/79,
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